Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 для получения биопрепарата комплексного действия для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, касается биологических средств для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста и представляет собой штамм бактерии Bacillus amyloliquefaciens OPS-32.

Предложено и запатентовано множество различных штаммов микроорганизмов, предложенных для использования в производстве биопрепаратов в качестве основных действующих агентов биопестицидов и/или биоудобрений. Значительная часть таких микроорганизмов является представителями родов Bacillus и Pseudomonas. Согласно многочисленным исследованиям именно эти бактерии чаще всего встречаются в ризосфере и ризоплане растений и образуют с ними взаимовыгодные ассоциации. С точки зрения биологической активности и бациллы, и псевдомонады могут оказывать комплексное положительное воздействие на растения, но с точки зрения промышленного использования в качестве основы для биопрепаратов бактерии рода Bacillus имеют существенное преимущество, так как образуют устойчивые покоящиеся формы - споры, которые позволяют производить биопродукты с большим сроком годности (не менее 1 года) без каких-либо дополнительных производственных этапов и/или внесения стабилизирующих и консервирующих добавок.

Известны штаммы Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (Авторское свидетельство №1717156, опубл. 07.03.1992) и биопрепарат Фитоспорин, созданный на основе этого штамма (Патент РФ №2099947, опубл. 27.12.1997), В. subtilis №10, являющийся основой биопрепарата Алирин Б (Патент РФ №2081167, опубл. 10.06.1997), В. subtilis В-40 (Патент РФ №2094990, опубл. 10.11.1997), В. subtilis 11 В (ВКМ В-2218Д) (Патент РФ №2182172, опубл. 10.05.2002), Bacillus pumilus BKM CR-333Д (Патент РФ №1817875, опубл. 20.05.1995), В. pumilus А1.5 (Патент РФ №2551968, опубл. 10.06.2015), Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7767 (Патент РФ №2242125, опубл. 20.12.2004), Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 (Патент РФ №2570624, опубл. 10.12.2015). Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является недостаточная биологическая активность, проявляющаяся в антагонизме к фитопатогенным и не только микроорганизмам и защите растений от некоторых заболеваний, при этом их влияние на урожайность растений остается неизвестным. Не все из указанных штаммов обладают достаточно широким спектром антагонистической активности, что ограничивает их применение, а некоторые из них проявляют антагонизм также и к полезным представителям почвенной микрофлоры, например штамм В. subtilis В-40 подавляет рост энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana.

Известен штамм Paenibacillus sp. ИБ-1 (BKM B-2823D) для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами (Патент РФ №2539738, опубл. 27.01.2015). Штамм продуцирует цитокинины, способствует переводу труднорастворимых фосфатов в растворимую форму, фиксирует молекулярный азот и защищает проростки пшеницы от корневых гнилей в лабораторных условиях. Известен штамм бактерии Bacillus subtilis 1С-5 (ВКПМ В-7036), являющийся основой препарата «Фитоп» (Патент РФ №2086128, опубл. 10.08.1997), эффективно защищающий розы от мучнистой росы, огурцы - от ложной мучнистой росы, картофель - от фитофтороза, клевер - от пероноспороза. Известен штамм бактерии В. subtilis М-22, являющийся основой препарата Гамаир (Патент РФ №2084152, опубл. 20.07.1997), обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям, защищающий растения томата от бактериальных инфекций в период вегетации. Однако известно о способности этих штаммов подавлять развитие лишь небольшого числа фитопатогенных грибов, и ничего неизвестно об их влиянии на урожайность растений.

Известен штамм Bacillus subtilis M1 (Патент РФ №2307158, опубл. 27.09.2007). Указанный микроорганизм повышает всхожесть семян яровой пшеницы, стимулирует рост проростков, повышает их массу, снижает пораженность проростков возбудителями корневых гнилей, но практически не способствует повышению урожайности.

Известны штаммы бактерий, которые не только проявляют антагонизм по отношению к различным фитопатогенам и защищают растения от болезней, но и достоверно повышают урожайность. В качестве примеров можно привести штаммы Bacillus sp.739 (Патент РФ №1743019, опубл. 30.05.1994), В. subtilis 4-13 - основа препарата «Экстрасол» (Патент РФ №2259397, опубл. 27.08.2005), Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ Д138 - основа препарата «Экстрагран» (Патент РФ №2284353, опубл. 27.09.2006), Bacillus spp. KR-083 (Патент РФ №2295562, опубл. 20.03.2007), Bacillus licheniformis ВКПМ В-10561, В-10562, В-10563, В-10564 (Патент РФ №2440413, опубл. 20.01.2012), В. subtilis 8А (Патент РФ №2495119, опубл. 10.10.2013), Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475 (Патент РФ №2528058). Однако ничего не известно об их антифунгальной активности в отношении таких фитопатогенов, как Claviceps purpurea (возбудитель спорыньи), Rhizopus stolonifer (возбудитель гнилей плодов у клубники, томатов и др., возбудитель сухой гнили, например, корзинок подсолнечника), Cercospora beticola (возбудитель церкоспороза сахарной свеклы), Passalora fulva (листовая гниль томатов). Кроме того, отсутствуют сведения об устойчивости этих штаммов к химическим пестицидам.

Наиболее близкими к достигаемому результату и рассматриваемыми в качестве наиболее близких аналогов являются штаммы В. subtilis BZR 517 (Патент РФ №2552146, опубл. 10.06.2015) и В. subtilis BZR 336g (Патент РФ №2553518, опубл. 20.06.2015). Эти штаммы являются антагонистами фитопатогенных грибов, защищают растения озимой пшеницы и подсолнечника от болезней в полевых условиях, способствуют повышению их урожайности, и при этом совместимы с химическими гербицидами и инсектицидами. Однако для этих бактерий выявлен узкий спектр фитопатогенов, которых они подавляют, ничего неизвестно о механизмах стимуляции роста растений, а также об устойчивости указанных штаммов к химическим фунгицидам, и, кроме того, неизвестно их влияние на полезных представителей почвенной микрофлоры.

Задачей заявленного изобретения является выделение нового природного штамма, обладающего антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам, защищающего растения от болезней, стимулирующего их рост и повышающего урожайность, способного к мобилизации труднорастворимых соединений фосфора, устойчивого к химическим средствам защиты растений и не угнетающего полезную почвенную микрофлору.

Эта задача решается благодаря выделению и использованию штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-12464. Штамм был выделен из ризосферы яровой пшеницы, произраставшей в Гафурийском районе республики Башкортостан. Видовая принадлежность культуры была определена на основании результатов секвенирования гена 16S рРНК в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии и подтверждена во ФГУП ГосНИИГенетика посредством повторного секвенирования и идентификации с помощью видоспецифичных праймеров.

Заявленный штамм имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки

Клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами размером 1,5-2,5×0,5-0,7 мкм; располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже. При спорообразовании клетки не раздуваются, споры эллипсовидные, расположены центрально.

На мясо-пептонном агаре (МПА) через 2 суток образует округлые колонии с фестончатым краем и кратерообразным центром, 6-7 мм в диаметре; с преимущественно складчато-бороздчатой поверхностью (у «кратера» поверхность гладкая), матовые, непрозрачные, цвет - в основном молочно-белый, в бороздах - серовато-бежевый. Колонии имеют выпуклое основание, рельефные складки и значительно приподнятый центральный кратер; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.

На картофельно-глюкозном агаре (КГА) через 2 суток образует круглые колонии с фестончатым краем и центром в виде узкого конуса, 5-10 мм в диаметре, складчатые, матовые, непрозрачные, молочно-белого цвета. Колонии имеют плоское основание, рельефные складки и приподнимающийся центр; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.

Физиолого-биохимические свойства

Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 является аэробной, хемоорганогетеротрофной бактерией, не нуждающейся в факторах роста. Растет в диапазоне температур от 10 до 47°C с оптимальным диапазоном 28-32°C, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5, при концентрации хлорида натрия до 7%.

Проявляет активность триптофандеаминазы и желатиназы. Активность β-галактозидазы (ортонитрофенил-βD-галактопиранозидазы), аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы не выявлена. Не продуцирует индол и сероводород и не восстанавливает нитраты. Реакция Фогес-Проскауэра (продукция ацетоина) положительная.

В качестве источника углерода и энергии утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-ксилозу, D-рибозу, L-арабинозу, D-маннозу, D-маннит, инозит, D-сорбит, метил-αD-маннопиранозид, метил-αD-глюкопиранозид, D-мальтозу, D-целлобиозу, D-лактозу, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-мелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-раффинозу, крахмал, гликоген, гентибиозу, глицерин, цитрат.

Не утилизирует эритритол, D-арабинозу, D-адонитол, D-галактозу, L-ксилозу, L-сорбозу, L-рамнозу, метил-βD-ксилопиранозид, дульцитол, N-ацетилглюкозамин, инулин, D-мелецитозу, ксилит, D-туранозу, D-ликсозу, D-тагатозу, D-фукозу, D-арабит, L-арабит, глюконат калия, 2-кетоглюконат калия, 5-кетоглюконат калия.

Штамм хранится при 4-6°C в пробирках под ватно-марлевыми пробками со скошенным МПА или среде Громыко (состав: мясо-пептонный бульон и сусло пивное неохмеленное с концентрацией сахаров 7% (7° Баллинга), взятых в соотношении 1:1, с добавлением 2,0% агар-агара, рН среды 7,0-7,2) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечению 2-х суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года.

Штамм хорошо растет на МПА, КГ А, питательном агаре, среде LB, сусло-агаре (состав: концентрат сусла пивного неохмеленного, разбавленный дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10° Баллинга), рН 7,0-7,2 с добавлением 2,0% агар-агара), среде Громыко, среде Гаузе №2 (состав: триптон - 2,5 г; пептон - 5,0 г; NaCI - 5,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 20 г; вода водопроводная - 1000 мл; рН - 7,0-7,4). Ферментация осуществляется на смеси равных объемов мясо-пептонного бульона и 6°Б неохмеленного пивного сусла (рН 6,9-7,2) при 30°C до 95% спорообразования. Количество КОЕ составляет не менее 5×10⁹ в 1 мл.

Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Башкирском государственном медицинском университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Более подробно сущность описываемого изобретения раскрывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Исследование антагонистической активности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32

Для выявления антагонизма изучаемого штамма к фитопатогенным микроорганизмам использовали метод агаровых блоков. На чашки Петри с КГА высевали сплошным газоном суспензию спор и фрагментов мицелия фитопатогенов. Одновременно в отдельную чашку Петри с той же средой сеяли газоном споровую культуру Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, полученную на среде для ферментации. Всех микроорганизмов помещали на 3-5 часов в термостаты при температуре 25°C и 30°C для того, чтобы конидии и споры проросли. По прошествии указанного времени из среды, на которой росли бациллы, стерильным пробочным сверлом вырезали агаровые блоки и посредством микробиологической иглы помещали их в чашки Петри с фитопатогенами так, чтобы та сторона блока, на которой находились бактерии, оказалась непосредственно прилегающей к поверхности среды с развивающейся культурой фитопатогена. Контролем служили газоны фитопатогенов, посеянные одновременно с экспериментальными, но к которым не помещали агаровые блоки с бациллами. Контрольные и опытные чашки с культурами помещали в термостат при 27°C. Наблюдения проводили на 2-5 сутки в зависимости от скорости роста фитопатогена.

Этот способ определения антагонистической активности принято считать полуколичественным, и представление результатов в виде площади зон подавления роста тест-объектов является не совсем корректным. Это связано с тем, что при такой постановке опыта антагонизм между микроорганизмами реализуется за счет продукции ими различных антимикробных метаболитов. В свою очередь, эти метаболиты диффундируют в питательную среду, поэтому накопление их в конкретной точке питательной среды и, соответственно, размер области, где наблюдаются проявления антагонизма, зависит от объема среды, а также от качества и плотности агара. В связи с этим результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 представлены в виде фотографий на фиг. 1.

Согласно представленной информации, штамм Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 является мощным антагонистом и обладает широким спектром активности; все использованные в исследовании тест-объекты проявили чувствительность к антагонистичному штамму.

Пример 2. Лабораторные испытания эффективности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32

В качестве объекта исследования использовали семена озимой пшеницы сорта Айвина. Семена обрабатывали полусухим способом жидкой споровой культурой штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 с титром 5×10⁹ КОЕ/мл, полученной в результате глубинного культивирования штамма на среде для ферментации. Контрольные семена обрабатывали водой, а в качестве стандарта использовали биофунгицид Бактофит, Ж (на основе бактерии Bacillus subtilis, штамм ИПМ 215) с нормой расхода 3 л/т, рекомендованной производителем. Расход рабочего раствора - 10 л/т. Через сутки после обработки семена помещали во влажную камеру и выдерживали при 25°C. Учет развития гриба на семенах проводили через 3 суток, а измерение длины корня и ростка - через 6 суток после размещения во влажной камере. Результаты представлены в таблице 1.

Согласно приведенным данным оптимальной нормой расхода жидкой культуры В. amyloliquefaciens OPS-32 с титром 5×10⁹ КОЕ/мл была 0,5 л/т. Стимулирующее и фунгицидное действие обработки семян в этом случае достоверно превышало показатели в контроле. Также стимуляция роста корней и фунгицидная активность проявлялись в случае использования штамма В. amyloliquefaciens OPS-32 сильнее, чем при воздействии Бактофита, Ж.

Пример 3. Выявление способности к мобилизации труднорастворимых соединений фосфора

Одним из аспектов положительного влияния микроорганизмов на растения является улучшение их минерального питания. Поэтому способность к переводу труднорастворимых соединений макро- и микроэлементов в растворимую форму, пригодную для поглощения корнями, является важным фактором стимуляции роста и развития растений.

Оценку способности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 мобилизовать труднодоступные соединения фосфора оценивали на среде Пиковской (состав: глюкоза - 10 г/л, сульфат аммония - 0,5 г/л, хлорид калия - 0,2 г/л, сульфат магния - 0,1 г/л, сульфат марганца - 0,0001 г/л, сульфат железа (II) - 0,0001 г/л) с добавлением труднорастворимого трехзамещенного ортофосфата кальция в количестве 5 г/л. Культуру штамма помещали на среду в виде агарового блока так же, как описано в примере 1, и инкубировали при 30°С в течение трех суток. О наличии у штамма выявляемой способности судили по появлению вокруг агарового блока зон просветления среды. Поскольку метод является полуколичественным, результаты представлены на фиг. 2.

На фотографии хорошо заметно, что зоны просветления среды намного обширнее, чем площадь, занятая бактериальными клетками. В связи с этим можно сделать вывод о ярко выраженной способности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 к мобилизации труднорастворимых фосфатов.

Пример 4. Оценка эффективности обработки растений штаммом Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в полевых условиях

Для проведения эксперимента использовали жидкую споровую культуру Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, выращенную на среде для ферментации, с титром 5×10⁹ КОЕ/мл. Оценку проводили в полевом мелкоделяночном эксперименте на растениях яровой пшеницы сорта Экада 66. Схема опыта была следующая: 1) контроль (протравливание семян водой + опрыскивание вегетирующих растений водой); 2) В. amyloliquefaciens OPS-32 (протравливание семян 0,2 л/т + опрыскивание вегетирующих растений 0,2 л/га); 3) В. amyloliquefaciens OPS-32 (протравливание семян 0,2 л/т + опрыскивание вегетирующих растений 0,3 л/га); 4) В. amyloliquefaciens OPS-32 (протравливание семян 0,2 л/т + опрыскивание вегетирующих растений 0,4 л/га).

В таблице 2 представлены наблюдения за развитием корневых гнилей в фазу третьего листа и в конце цветения.

Как видно из таблицы, заявляемый бактериальный штамм сдерживал распространение болезни по посевам, но еще в большей степени снижал ее развитие. Также обработка растений В. amyloliquefaciens OPS-32 уменьшала развитие на листьях мучнистой росы (таблица 3).

Результаты обработки растений культурой штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 представлены в таблице 4.

Представленные данные свидетельствуют о высокой биологической эффективности штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, выражающейся в снижении заболеваемости и повышении урожайности сельскохозяйственных культур, в частности яровой пшеницы.

Пример 5. Оценка совместимости штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 с химическими средствами защиты растений

В настоящее время невозможно представить полный отказ производства растениеводческой продукции от химических средств защиты растений. Поэтому при внедрении в эту область биологических препаратов на основе живых микроорганизмов всегда следует учитывать то, что обработка растений будет проводиться биологическими и химическими агентами совместно. Производить обработки каждым необходимым препаратом в отдельности экономически невыгодно, а в случае предпосевной обработки семян - бесполезно, так как до посева семена должны быть обработаны всеми необходимыми препаратами. В связи с этим нами была проведена оценка выживаемости штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в рабочих растворах некоторых фунгицидов и гербицидов. Для этого готовили рабочие растворы пестицидов согласно инструкциям производителей, в которые добавляли жидкую споровую культуру штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32. В контрольном варианте ту же культуру штамма добавляли в стерильную водопроводную воду. Оценку жизнеспособности спор штамма проводили через 4 часа и через 24 часа после внесения бактерий в рабочие растворы пестицидов. Результаты представлены в таблице 5.

* - действующее вещество (ДВ) - тебуконазол, 60 г/л (ООО НПО «РосАгроХим»);

** - ДВ - тебуконазол, 250 г/л (ЗАО Фирма «Август»);

*** - ДВ - пропиконазол 300 г/л + тебуконазол 200 г/л (ЗАО Фирма «Август»);

**** - ДВ - флутриафол, 250 г/л (АРИСТА ЛАЙФСАЙЕНС САС);

***** - ДВ - глифосат (изопропиламинная соль), 360 г/л (ЗАО Фирма «Август»);

****** - ДВ - метсульфурон-метил, 600 г/кг (Дюпон де Немур Интернэшнл С.А.);

******* - ДВ хлорсульфурон, 750 г/кг (ООО «Дюпон Наука и Технологии»);

******** - ДВ - 2,4-Д (ООО «Агрусхим»).

Согласно приведенным данным, в рабочих растворах исследованных пестицидов штамм сохраняет жизнеспособность не хуже, чем в воде даже после 24 часов инкубации. Единственным исключением стал гербицид на основе 2,4-Д, в рабочем растворе которого число жизнеспособных спор через сутки инкубации существенно снижалось. Однако гибель спор происходит относительно медленно (через 3 часа инкубации их число на уровне контрольного варианта), поэтому при оперативном использовании можно совмещать этот гербицид и культуру штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 в общем рабочем растворе.

Пример 6. Оценка влияния штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 на представителей полезной почвенной микрофлоры

Поскольку штамм Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 существенно подавляет рост фитопатогенной микрофлоры, следовало также оценивать его воздействие и на дружественных растениям представителей почвенного микробиоценоза. В качестве представителей «полезной» почвенной микрофлоры в исследовании были использованы азотфиксирующие бактерии Rhizobium sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., выделенные и идентифицированные в научно-исследовательской лаборатории ООО «Органик парк» по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, а также штамм Pseudomonas fluorescens Е4, предоставленный сотрудниками кафедры биохимии Казанского Федерального Университета.

Вероятный антагонизм по отношению к указанным бактериям выявляли методом агаровых блоков так же, как описано в примере 1. Результаты представлены на фиг.3.

Как видно из рисунка, клетки Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 и тест-культур вплотную соприкасаются в условиях двойной культуры, при этом признаков угнетения роста какой-либо из культур не наблюдается. Исходя из этого можно сделать, что Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 не проявляет антагонизма по отношению к различным представителям «полезной» почвенной микрофлоры.

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста сельскохозяйственных растений и защита их от фитопатогенов, следствием чего является повышение их урожайности. Он достигается тем, что в качестве средства для обработки растений используется штамм бактерии Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, обладающий комплексом полезных свойств, таких как способность подавлять рост фитопатогенных грибов и защищать растения от болезней, стимулировать рост проростков, мобилизовать труднорастворимые соединения фосфора, повышать урожайность, при этом устойчивый к химическим пестицидам и не угнетающий развитие полезных для растений представителей почвенной микрофлоры.