Результат интеллектуальной деятельности: Гель с нафтохиноновым комплексом биологически активных веществ воробейника краснокорневого

Изобретение относится к области медицины, к разделу фармации и может быть в дальнейшем использовано в медицинской практике с целью повышения эффективности и сокращения сроков лечения инфекционно-воспалительных заболеваний кожи, включая кожу лица, язвенных и рожистых поражений мягких тканей.

Увеличение ассортимента лекарственных средств ранозаживляющего, противовоспалительного, антимикробного действия представляет собой актуальную задачу для медицины и фармации. Это обусловлено, в первую очередь, возросшей антибиотикорезистентностью микроорганизмов, о чем неоднократно сообщалось на научно-практических конференциях последних лет [Яковлев С.В. Проблемы антибиотикорезистентности и рационального применения антимикробных препаратов в амбулаторной практике и ЛПУ: Образовательная конференция «Рациональное применение антимикробных средств а амбулаторной практике», г. Хабаровск, 29 апреля 2017 г.]. Это стимулирует научное сообщество на поиски новых антимикробных веществ [Козлов Р.С. Селекция резистентных микроорганизмов при использовании антимикробных препаратов: концепция «параллельного ущерба» // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 284-294]. Кроме того, возрастает интерес к биологически активным веществам (БАВ) растительного происхождения, обладающих выраженным фармакологическим действием при низкой токсичности и малой вероятности развития неблагоприятных побочных эффектов, свойственных некоторым современным химиотерапевтическим лекарственным средствам [Минина С.А., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов: учебное пособие. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 560 с.: ил.].

Одним из перспективных объектов исследования, по нашему мнению, является нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ, который содержится преимущественно в корнях воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., представителя семейства бурачниковые - Boraginaceae. Данный комплекс включает в себя нафтохинон шиконин, его химическая формула: 5,8-диокси-2(1-окси-4-метилпентил-3)-1,4-нафтохинон. Также комплекс включает эфиры шиконина, такие как ацетилшиконин, изовалерилшиконин, изобутирилшиконин, пропионилшиконин, β,β-диметилакрилшиконин и другие производные шиконина.

Шиконин и его эфиры известны с давних времен как красные природные пигменты и как перспективные лекарственные средства. Так, в обзорной статье Papageorgiou et al. [Papageorgiou V.P., Assimopoulou A.N., Couladouros E.A., Hepworth D., Nicolaou K.C. The chemistry and biology of alkannin, shikonin, and related naphthazarin natural products // Angewandte Chemie International Edition in English. - 1999. - Vol. 38. - P. 270-301] описаны фармакологические свойства данных веществ и обсуждаются возможности их медицинского применения. Авторы статьи ссылаются также и на другие независимые исследования, в которых было доказано наличие у шиконина и у его эфиров противовоспалительного, ранозаживляющего и антимикробного эффектов.

В настоящее время есть способ выделения незаявляемого нафтохинонового комплекса БАВ воробейника краснокорневого из культуры клеток с целью его дальнейшего применения в составе лекарственных форм для местного лечения слизистых оболочек и кожи, что является перспективным направлением в фармации [Булгаков В.П., Федореев С.А., Журавлев Ю.Н. Биотехнология - здоровью человека: научные достижения и первые шаги инноваций на Дальнем Востоке 2004 // Вестник ДВО РАН. - №3]; [Bulgakov V.P. et al. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithospermum erythrorhizon // Fitoterapia. - 2001. - №4 (72). - c. 394-401].

Однако на сегодняшний день применение нафтохинонового комплекса БАВ в медицине ограничено ввиду отсутствия удобной лекарственной формы. Нами была проведена работа по созданию полимерной пленки, содержащей нафтохиноновый комплекс БАВ [Л.М. Таран, А.Я. Башаров, Е.В. Слободенюк, В.П. Булгаков, Н.В. Стрельникова. Патент на изобретение №2593795 «Способ получения полимерной основы для изготовления пленки с нафтохиноновым комплексом БАВ воробейника краснокорневого», зарегистрировано в Государственном реестре РФ 15 июля 2016 г.], [Л.М. Таран, А.Я. Башаров, Е.В. Слободенюк, В.П. Булгаков, Н.В. Стрельникова. Патент на изобретение №2595880 «Полимерная пленка с нафтохиноновым комплексом биологически активных веществ воробейника краснокорневого», зарегистрировано в Государственном реестре РФ 04 августа 2016 г.]. Полимерные пленки имеют ряд преимуществ, позволяющих использовать их в медицинской практике, однако в ходе дальнейших исследований были выявлены и некоторые недостатки. Во-первых, пленки предназначены преимущественно для нанесения на слизистые оболочки, так как состав пленок предполагает хорошие адгезионные свойства при контакте с жидкостями (слюна, экссудат и т.д.). При нанесении на кожный покров полимерные пленки малоэффективны, так как не проявляют обозначенных адгезионных свойств. Во-вторых, полимерная пленка имеет определенный размер, поэтому при нанесении на обширные участки повреждений пленка может не охватить всю зону поражения. Ввиду наличия названных недостатков у полимерных пленок возникла необходимость в разработке альтернативной лекарственной формы для наружного применения, содержащей нафтохиноновый комплекс БАВ: был получен гель с нафтохиноновым комплексом биологически активных веществ воробейника краснокорневого.

Гель - лекарственная форма, представляющая собой структурированную систему из высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ. Для гелей характерны следующие свойства: отсутствие текучести, способность сохранять форму, прочность, способность к деформации, пластичность и упругость. Одним из преимуществ гелей из полимеров, например из гидроксиэтилцеллюлозы, является способность их после нанесения образовывать тонкую полимерную пленочку, которая закрывает зону повреждения от внешних раздражителей, сохраняя лечебный эффект [Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И.И. Краснюк, Г.В. Михайлова, Т.В. Денисова, В.И. Скляренко; под ред. И.И. Краснюка, Г.В. Михайловой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 656 с].

Существуют другие лекарственные формы, содержащие шиконин и его эфиры. Известен пластырь для слизистой оболочки ротовой полости, содержащий шикониновый экстракт из корней воробейника краснокорневого (Заявка №1-226823, Япония, A61K 35/78, 9/70 от 11.09.89). Другой известный аналог - гигиенический состав для ухода за полостью рта, содержащий шиконин (Заявка №59-24993, Япония, A61K 7/16, 7/26, 31/35, публ. от 15.02.84, прототип). Состав содержит в качестве активного компонента шиконин с чистотой 80%, для получения которого сырье, содержащее шиконин, экстрагируют органическим растворителем, гидролизуют с применением водного раствора щелочи и осаждают кислотой. Недостатками данных изобретений являются их однокомпонентность, ведь известно, что шиконин в комплексе с суммой его эфиров обладает более выраженным фармакологическим действием, а также применение натурального растительного сырья, ведь воробейник краснокорневой - редкое, эндемичное растение с ограниченным ареалом произрастания в Японии, Китае и на Дальнем Востоке РФ, занесенное в Красную книгу Амурской области [Красная книга Амурской области. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных, растений и грибов. - Благовещенск: Изд-во БГПУ. - 2009. - 444 с.]. Также недостаток пластыря - ограниченная по площади форма, не позволяющая применять его на обширной зоне поражения.

Известен также аналог - масло шикониновое (патент РФ №2141840), однако недостатками данного изобретения являются жирная, плохо смывающаяся консистенция, неудобство применения ввиду сильных красящих свойств, невозможность самостоятельной фиксации в зоне патологии из-за отсутствия у масла адгезионных свойств и, как следствие, невозможность обеспечить пролонгированного воздействия активного компонента на зону патологического очага.

Наиболее близким аналогом является средство для лечения ран, содержащее коллаген и шиконин, для использования в хирургической практике - перевязочный материал «Гешиспон» (патент РФ №2071788). Недостатком данного изобретения являются невозможность самостоятельной фиксации в зоне патологического очага, а также меньшая компактность по сравнению с мягкой лекарственной формой в тубе. Кроме того, недостатком описанного изобретения является отсутствие в его составе веществ, способствующих лучшему высвобождению нафтохинонового комплекса из лекарственной формы.

С целью улучшения процесса высвобождения активного компонента из заявляемого геля в его состав вводится Коллидон 30 (Kollidon® 30, производитель BASF, Германия), ввиду его технологических свойств. Коллидон 30 - среднемолекулярный повидон, широко используется в фармацевтических препаратах в качестве связующего, солюбилизирующего агента, пролонгатора и т.д. Преимуществами использования повидонов является их легкая растворимость в воде и спирте, а также их способность улучшать растворение и биодоступность лекарственных веществ за счет образования водорастворимых комплексов [Бюлер Ф. // Поливинилпирролидон для фармацевтической промышленности. - 2001. - С. 20-40]. Это свойство Коллидона 30 позволяет ввести в состав геля нерастворимый в воде нафтохиноновый комплекс БАВ и повысить скорость высвобождения его из лекарственной формы.

Задача изобретения: разработать и изготовить гель оптимального состава, содержащий нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ - шиконин и его эфиры, выделенный из культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., с ожидаемым местным антимикробным эффектом.

Технический результат состоит в изготовлении геля оптимального состава, содержащего незаявляемый нафтохиноновый комплекс биологически активных веществ - шиконин и его эфиры, выделенный из культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc.

Технический результат достигается следующим образом. На первом этапе выделяют незаявляемый нафтохиноновый комплекс БАВ из каллусной культуры клеток воробейника краснокорневого - Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc., выращенной на искусственной питательной среде по известной методике [Bulgakov V.P., Kozyrenko М.М., Fedoreyev S.A. et al. Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithospremum erythrorhizon // Fitoterapia. 2001. 72. 394-401]. Выделение проводят по установленной методике [Журавлев Ю.Н., Федореев С.А., Булгаков В.П., Музарок Т.И., Береснева Н.В., Головко Е.И. Противовоспалительное и антимикробное средство "Масло шикониновое" // Патент Российской Федерации №2141840, 1999. Бюл. №33]. Для этого навеску культуры клеток воробейника краснокорневого экстрагируют в сокслете гексаном до полного обесцвечивания сырья, затем гексан отгоняют, а остаток сушат до постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу. При этом полученный продукт представляет собой ярко-красную вязкую массу.

На втором этапе предлагаемой методики полученный незаявляемый нафтохиноновый комплекс БАВ растворяют в 95% этиловом спирте, так чтобы получить спиртовой раствор с концентрацией нафтохинонового комплекса БАВ 5%. Использование раствора суммы эфиров шиконина с концентрацией 5% позволяет вводить его в состав геля, получая оптимальное количество нафтохинонового комплекса в геле.

На третьем этапе готовят 1,5% гель из гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ). Для изготовления геля заданных параметров массой 10 г берут 0,15 г ГЭЦ и заливают 8,8 мл воды очищенной, нагретой до температуры 80°С. Дополнительно по предлагаемой методике добавляют 0,06 г Коллидона 30, что обеспечит его концентрацию 0,6% от массы геля, оставляют на 24 часа для набухания полимеров. Далее смесь тщательно перемешивают до гомогенности.

На четвертом этапе предлагаемой методики в готовый гель гидроксиэтилцеллюлозы и Коллидона 30 вводят 1 мл 5% спиртового раствора суммы эфиров шиконина, тщательно гомогенизируют до однородной консистенции геля и выдерживают при температуре 8°С-10°С 6 часов. Готовый продукт представляет собой гель ярко-красного цвета с концентрацией нафтохинонового комплекса 0,5%, что представлено на Фиг. 1. Упаковывают гель в плотно закрывающиеся стерильные флаконы из темного стекла или алюминиевые тубы.

Для определения антимикробной активности изготовленного геля было проведено микробиологическое исследование на базе бактериологической лаборатории КГБУЗ «Краевая клиническая больница №1 им. профессора С.И. Сергеева» г. Хабаровска (главный врач С.С. Пудовиков). Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати различных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС.

Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), основанном на диффузии вещества в агар [Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И., 1993], помещая образец геля массой около 0,2 г в лунки диаметром 9 мм на питательной среде Мюллера-Хилтона с засеянной суточной культурой бактерий и грибов (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной инкубации учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов в мм. Вид зоны задержки роста вокруг лунок с исследуемым гелем изображен на Фиг. 2. Эксперимент проводили пятикратно и за конечный результат принимали среднее значение. Статистическую обработку проводили в программе MS Excel. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Достоверность различий полученных результатов оценивали при помощи критерия Ньюмена-Кейлса при попарном сравнении объектов исследования. Так, проведенный микробиологический эксперимент подтвердил наличие антимикробной активности у геля с концентрацией нафтохинонового комплекса БАВ 0,5% в отношении некоторых клинически значимых штаммов микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Kocuria varians. Незначительный противомикробный эффект был обнаружен в отношении Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis. He было обнаружено противомикробного эффекта в отношении энтеробактерий видов Escherichia coli, Proteus mirabilis.

Преимуществами предлагаемого изобретения являются:

- безвредность для пациента;

- возможность применения геля с оптимальной концентрацией нафтохинонового комплекса БАВ воробейника краснокорневого, обеспечивающей антимикробный эффект;

- возможность применения геля для лечения инфицированных ран, воспалительных процессов на коже, включая кожу и мягкие ткани лица, исходя из свойств шиконина и его эфиров;

- возможность использования геля и в качестве монотерапии, и в комбинации с другими лекарственными средствами;

- возможность обеспечения местного пролонгированного действия в зоне патологии благодаря свойствам используемых полимеров;

- после нанесения геля образуется тонкая полимерная пленочка, защищающая зону повреждения от внешних факторов, обеспечивающая продолжительный фармакологический эффект;

- отсутствие механизмов привыкания к шиконину и его эфирам у микроорганизмов, что не позволяет формироваться антимикробной резистентности при многократном применении геля;

- простота применения геля: возможность применения пациентом самостоятельно в любых условиях, что повышает комплаентность к данной лекарственной форме.

Для определения оптимальной концентрации нафтохинонового комплекса БАВ в геле были изготовлены образцы геля с различными концентрациями активного компонента и проведено микробиологической исследование, что отражено в примерах.

Пример 1

Был изготовлен образец геля массой 10 г по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,2 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в геле 0,1%. Для определения антимикробной активности изготовленного геля с концентрацией 0,1% было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), помещая образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки. Поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона была засеяна газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца геля. Эксперимент проводили пять раз и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была подтверждена активность данного образца геля только против пяти видов бактерий: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Kocuria varians.

Пример 2

Был изготовлен образец геля массой 10 г по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 0,6 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в геле 0,3%. Для определения антимикробной активности изготовленного геля с концентрацией 0,3% было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), помещая образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки. Поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона была засеяна газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца геля. Эксперимент проводили пять раз и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была подтверждена активность данного образца геля только против пяти видов бактерий: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Kocuria varians. Причем, наблюдаемые зоны задержки роста микроорганизмов достоверно не отличались от аналогичных у образцов геля с концентрацией 0,1%, описанные в примере 1.

Пример 3

Был изготовлен образец геля массой 10 г по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 1 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в геле 0,5%. Для определения антимикробной активности изготовленного геля с концентрацией 0,5% было проведено микробиологическое исследование.

Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), помещая образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки. Поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона была засеяна газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца геля. Эксперимент проводили пять раз и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была подтверждена активность данного образца геля против десяти видов бактерий: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Kocuria varians, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis. Причем, наблюдаемые зоны задержки роста достоверно превышали аналогичные у образцов геля с концентрацией 0,3%, описанные в примере 2.

Пример 4

Был изготовлен образец геля массой 10 г по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 1,4 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в геле 0,7%. Для определения противомикробной активности изготовленного геля с концентрацией 0,7% было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), помещая образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки. Поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона была засеяна газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца геля. Эксперимент проводили пять раз и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Так, была выявлена активность данных образцов геля против десяти видов микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Kocuria varians, Enterococcus faecium, Hafnia alvei, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides fragilis, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis. Причем, наблюдаемые зоны задержки роста достоверно не отличались от аналогичных у образцов геля с концентрацией 0,5%, описанные в примере 3.

Пример 5

Был изготовлен образец геля массой 10 г по предлагаемой методике, количество введенного шиконинсодержащего спиртового раствора 5% составило 2 мл, что обеспечило концентрацию нафтохинонового комплекса в геле 1%. Для определения противомикробной активности изготовленного геля с концентрацией 1% было проведено микробиологическое исследование. Исследовано 60 штаммов микроорганизмов двенадцати разных видов, включая музейные культуры и штаммы АТСС. Определение проводили стандартным методом лунок (колодцев), помещая образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки. Поверхность питательной среды Мюллера-Хилтона была засеяна газоном суточной культурой (мутность 0,5 по McFarland) и выдерживали в термостате 24 часа при температуре 37°С. После суточной экспозиции учитывали результат по наличию или отсутствию зоны задержки роста микроорганизмов вокруг образца геля. Эксперимент проводили пятикратно и за конечный результат принимали среднее значение. Полученные результаты приведены в Таблице 1. Результаты проведенного эксперимента значимо не отличались от результатов двух предыдущих опытов, описанных в примерах 3 и 4. Следовательно, увеличивать далее дозу нафтохинонового комплекса не имеет практической значимости. Таким образом, по результатам проведенных экспериментов было доказано, что для обеспечения антимикробного действия оптимальной является гель с концентрацией нафтохинонового комплекса 0,5%.

Пример 6

Были изготовлены образцы геля по предлагаемой методике, с концентрацией нафтохинонового комплекса 0,5%, двух видов: с Коллидоном-30 и без него. Затем было проведено биофармацевтическое исследование для определения скорости высвобождения нафтохинонового комплекса биологически активных веществ из геля стандартным методом диффузии в агар. Для этого помещали образец геля массой около 0,2 г в вырезанные в агаре лунки и в течение двух часов с интервалом в 30 минут измеряли диаметр зоны диффузии активного вещества, определяемый по ярко-красной окраске агара. В результате эксперимента было выявлено, что образец, содержащий в составе Коллидон 30, быстрее высвобождал нафтохиноновый комплекс, так как по истечении двух часов диаметр зоны диффузии данного образца был 22 мм, что изображено на Фиг. 3, а диаметр зоны диффузии образца, не содержащего Коллидон 30, был 15 мм, что изображено на Фиг. 4.