КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УХОДА ЗА СУСТАВОМ

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей куркуминоид с полифенолом зеленого чая или с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина, для применения в предотвращении или лечении остеоартрита. Изобретение также относится к способу предотвращения или лечения остеоартрита у млекопитающих, причем способ включает в себя введение указанному млекопитающему композиции, которая содержит куркуминоид с полифенолом зеленого чая или с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина.

Повреждение хряща может быть вызвано несколькими причинами, такими как повторяющаяся физическая нагрузка, нестабильность сустава и так далее, которые могут приводить к воспалению суставов. В то время как большинство людей с артритом имеют ревматоидный артрит, артрит, наблюдающийся у животных-компаньонов, большей частью представляет собой остеоартрит.

В настоящее время для остеоартрита не существует лечения и фармакологическое лечение ограничено ослаблением симптомов. Наиболее популярными являются нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, однако с ними связаны побочные эффекты. Желательным является более безопасное лечение.

Первый аспект данного изобретения относится к композиции, содержащей куркуминоид с полифенолом зеленого чая или с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина, для применения в предотвращении или лечении остеоартрита. Лечение остеоартрита включает в себя уменьшение симптомов остеоартрита.

Настоящее изобретение относится во всех аспектах к любому млекопитающему, включая человека. В частности, настоящее изобретение относится к животному-компаньону, такому как собака, кошка или животное рода лошадиных (например, лошадь), или любому другому такому животному, которое страдает остеоартритом или предрасположено к остеоартриту.

Композиция настоящего изобретения содержит куркуминоид. Куркуминоидом является куркумин или производное куркумина. Химические структуры куркуминоидов отличаются по своим функциональным группам.

Куркуминоид включает в себя куркумин, деметоксикуркумин, бис-деметоксикуркумин и/или тетрагидрокуркумин.

Куркуминоиды представляют собой природные фенолы, которые присутствуют, в частности, в индийской специи куркума. Источником куркумы являются корни растения Curcuma longa. Куркуминоиды также были обнаружены в корнях других видов семейства растений Zingiberaceae рода Curcuma. Куркуминоиды имеют отчетливый землистый, горький, перечный аромат и горчичный запах.

В частности, куркума содержит 60-80% куркумина, 15-30% деметоксикуркумина и 2-6% бис-деметоксикуркумина.

Куркуминоид в композиции изобретения может иметь любую форму, включая порошок или липидный экстракт.

В некоторых вариантах осуществления куркуминоид может быть смешан с фосфолипидами и/или целлюлозой, крахмалом или его производными, чтобы сформировать комплексы. Это может содействовать стабильности и/или дополнительному увеличению растворимости и биодоступности куркуминоида.

Куркуминоид может быть смешан с эфирными маслами, пиперином или бромелаином. Куркуминоид может быть смешан с фосфатидихолином, например, лецитином.

Предпочтительно, куркуминоид настоящего изобретения представляет собой куркумин, который является наиболее активным куркуминоидом. Куркумин согласно настоящему изобретению включает в себя деметоксикуркумин, бис-деметоксикуркумин и/или тетрагидрокуркумин.

Композиция изобретения содержит куркуминоид и полифенол зеленого чая.

Чай (Camellia sinensis), в частности зеленый чай, имеет высокое содержание флавоноидов, включая полифенолы, в частности катехины. Катехины чая включают в себя эпигаллокатехин-3-галлат (ЭГКГ), эпикатехин (ЭК), эпикатехин-3-галлат (ЭКГ), эпигаллокатехин (ЭГК), катехин и галлокатехин (ГК).

Предпочтительно, полифенолы зеленого чая включают в себя катехин. Предпочтительно, катехин включает в себя ЭГКГ. Экстракт зеленого чая обычно содержит по меньшей мере примерно 25% полифенолов, примерно 12,5% катехинов и примерно 9,3% ЭГКГ.

Эпигаллокатехин-галлат (ЭГКГ) представляет собой сложный эфир эпигаллокатехина и галловой кислоты. ЭГКГ является преобладающим катехином в чае и представляет собой сильный антиоксидант. Он обнаруживается в особенности в зеленом чае. ЭГКГ является главным полифенолом зеленого чая и проявляет антиоксидантную, противоопухолевую и антимутагенную активность.

Композиция изобретения содержит куркумин и сочетание глицина, пролина и гидроксипролина.

На сочетание глицина, пролина и гидроксипролина приходится 50% суммарного содержания аминокислот в гидролизованном коллагене. Предпочтительно, сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген. Аминокислотная композиция гидролизованного коллагена приведена в нижеследующей таблице:

Гидролизованный коллаген получают ферментативным гидролизом коллагеновых тканей, имеющихся в костях, коже и соединительной ткани животных, таких как крупный рогатый скот, рыба, лошади, свиньи и кролики. Гидролизованный коллаген хорошо усваивается и предпочтительно накапливается в хряще.

Предпочтительная композиция включает в себя куркуминоид, полифенол зеленого чая и сочетание глицина, пролина и гидроксипролина. Предпочтительно, данная композиция включает в себя куркумин, полифенол зеленого чая и гидролизованный коллаген.

Изобретение предпочтительно предоставляет корм. Он может представлять собой любой корм, такой как сухой, полувлажный или влажный пищевой продукт. В частности, корм может представлять собой пищевой продукт для домашних животных.

Корм для домашних животных предпочтительно представляет собой промышленный пищевой продукт для домашних животных. Такой продукт предпочтительно продается как продукт для кормления домашнего животного, в частности домашней кошки или домашней собаки.

Типичный корм для домашних животных содержит примерно 20-30% неочищенного белка и примерно 10-20% жира, причем остаток представляет собой углевод, включая пищевое волокно и золу. Типичный влажный или мокрый продукт содержит (в расчете на сухое вещество) примерно 40% жира, 50% белка, причем остаток представляет собой волокно и золу. Корм по изобретению может представлять собой сухой продукт (с содержанием влаги от приблизительно 5 до приблизительно 15%), полувлажный продукт (с содержанием влаги от приблизительно 15 до приблизительно 70%) или мокрый продукт (с содержанием влаги от приблизительно 70 до приблизительно 90%).

Остаточные компоненты корма несущественны для изобретения, и могут быть включены типичные стандартные продукты. Объединенные ингредиенты корма по изобретению могут обеспечивать все рекомендованные витамины и минералы для конкретного рассматриваемого животного (полная и сбалансированная пища).

Корм по настоящему изобретению охватывает любой продукт, который домашнее животное потребляет в своем рационе. Таким образом, изобретение покрывает стандартные пищевые продукты, включая жидкости, а также лакомствалакомства для домашних животных (например, лакомства в форме батончиков, жвачка для домашних животных, хрустящее угощение, зерновые батончики, закуски, галеты и сладкие продукты) и добавки.

Корм может быть предоставлен в виде пищевой добавки. Пищевая добавка может представлять собой порошок, соус, вкусовую поливку, галету, гранулу, мешочек или таблетку, которые могут быть введены вместе с дополнительным кормом или без него. Когда пищевую добавку вводят с дополнительным кормом, пищевая добавка может быть введена последовательно, одновременно или отдельно. Пищевая добавка может быть смешана с кормом, применена путем обрызгивания поверх корма или скормлена отдельно. Альтернативно, пищевая добавка может быть добавлена в жидкость, предусмотренную для потребления в качестве питья, такую как вода или молоко.

Корм предпочтительно представляет собой подвергнутый кулинарной обработке продукт. Он может включать мясо или материал животного происхождения (такой, как говядина, курица, индейка, ягненок, рыба, плазма крови, кость, содержащая костный мозг, и так далее или один или более из них). Альтернативно, продукт может не содержать мяса (предпочтительно, включая в себя заменитель мяса, такой как соя, кукурузный глютен или соевый продукт), чтобы обеспечить источник белка. Корм может содержать дополнительные источники белка, такие как концентрат соевого белка, молочные белки, глютен и так далее. Корм может также содержать источник крахмала, такой как одно или более зерновые (например, пшеница, кукуруза, рис, овес, ячмень и так далее), или может не содержать крахмала.

Корм по изобретению предпочтительно получают в виде сухого продукта, содержащего от приблизительно 5% до приблизительно 15% влаги. Предпочтительная сухая пища в более предпочтительном варианте присутствует в виде гранул, напоминающих малые галеты.

В нижеприведенной таблице подробно показано количество композиции по настоящему изобретению и количество композиции для приема собаками в соответствии с настоящим изобретением:

В первом аспекте изобретения композиция может содержать куркуминоид в количестве в диапазоне от примерно 0,005 до 1,1% по массе куркуминоида в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество куркуминоида может представлять собой любое количество от 0,005 до 1,1% (как есть). Количество куркуминоида может представлять собой любое количество от 0,1 до 1% (как есть). Количество куркуминоида может представлять собой любое количество от 0,1 до 0,6% (как есть). Количество куркуминоида может представлять собой любое количество от 0,3 до 0,6% (как есть).

В первом аспекте изобретения композиция может содержать куркуминоид в количестве в диапазоне от примерно 0,005 до 0,15% по массе куркуминоида в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество куркуминоида может представлять собой любое количество от 0,005 до 0,15% (как есть) (от 7 до 99 мг/400 ккал).

Когда диета является сухой, масса “как есть” является той же самой, что и “масса сухого вещества”.

Предпочтительно, количество куркуминоида в композиции находится в диапазоне от примерно 0,01 до 0,07% (как есть) (от 14 до 46 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество куркуминоида составляет 0,035% (как есть) (36 мг/400 ккал).

В некоторых вариантах осуществления куркуминоид в композиции представляет собой куркумин в количестве в диапазоне от примерно 0,005 до 0,15% по массе куркумина в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество куркумина может представлять собой любое количество от 0,005 до 0,15% (как есть) (от 7 до 99 мг/400 ккал). Предпочтительно, количество куркумина находится в диапазоне от примерно 0,01 до 0,05% (как есть) (от 14 до 32 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество куркумина составляет 0,026% (как есть) (27 мг/400 ккал).

В первом аспекте изобретения композиция может содержать полифенол зеленого чая в количестве в диапазоне от примерно 0,01 до 1,1% по массе полифенола зеленого чая в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество полифенола зеленого чая может представлять собой любое количество от 0,01 до 1,1% (как есть). Количество полифенола зеленого чая может представлять собой любое количество от 0,1 до 1% (как есть). Количество полифенола зеленого чая может представлять собой любое количество от 0,1 до 0,6% (как есть). Количество полифенола зеленого чая может представлять собой любое количество от 0,3 до 0,6% (как есть).

В первом аспекте изобретения композиция может содержать полифенол зеленого чая в количестве в диапазоне от примерно 0,01 до 0,3% по массе полифенола зеленого чая в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество полифенола зеленого чая может представлять собой любое количество от 0,01 до 0,3% (как есть) (от 14 до 197 мг/400 ккал). Предпочтительно, количество полифенола зеленого чая находится в диапазоне от примерно 0,03 до 0,17% (как есть) (от 43 до 113 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество полифенола зеленого чая составляет 0,085% (как есть) (87 мг/400 ккал).

В некоторых вариантах осуществления полифенол зеленого чая представляет собой ЭГКГ в количестве в диапазоне от примерно 0,005 до 0,2% по массе ЭГКГ в расчете на массовый процент “как есть” в пище (от 7 до 131 мг/400 ккал). Количество ЭГКГ может представлять собой любое количество от 0,01 до 0,06% (как есть) (от 14 до 39 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество ЭГКГ составляет 0,032% (как есть) (33 мг/400 ккал).

В первом аспекте изобретения композиция может содержать сочетание глицина, пролина и гидроксипролина в количестве в диапазоне от примерно 0,5 до 10% по массе сочетания глицина, пролина и гидроксипролина в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество сочетания глицина, пролина и гидроксипролина может представлять собой любое количество от 0,5 до 10% (как есть) (от 720 до 6591 мг/400 ккал). Предпочтительно, количество сочетания глицина, пролина и гидроксипролина находится в диапазоне от примерно 1,2 до 5% (как есть) (от 1736 до 3295 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество сочетания глицина, пролина и гидроксипролина составляет 2,7% (как есть) (2780 мг/400 ккал).

В некоторых вариантах осуществления сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген в количестве в диапазоне от примерно 0,5 до 5% по массе сочетания глицина, пролина и гидроксипролина в расчете на массовый процент “как есть” в пище. Количество гидролизованного коллагена может представлять собой любое количество от 0,5 до 5% (как есть) (от 720 до 3295 мг/400 ккал). Предпочтительно, количество гидролизованного коллагена находится в диапазоне от примерно 0,7 до 3,2% (как есть) (от 1016 до 2138 мг/400 ккал). Наиболее предпочтительно, количество гидролизованного коллагена составляет 1,7% (как есть) (1750 мг/400 ккал).

В других вариантах осуществления композиция может содержать куркумин в количестве примерно 27 мг/400 ккал (35 мг/400 ккал куркуминоидов) с примерно 87 мг/400 ккал полифенола зеленого чая и с примерно 2757 мг/400 ккал сочетания глицина, пролина и гидроксипролина, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген. Предпочтительно, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген и присутствует в композиции в количестве примерно 1747 мг/400 ккал.

В других вариантах осуществления композиция может содержать куркумин в количестве примерно 33 мг/400 ккал (43 мг/400 ккал куркуминоидов) с примерно 106 мг/400 ккал полифенола зеленого чая и с примерно 3295 мг/400 ккал сочетания глицина, пролина и гидроксипролина, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген. Предпочтительно, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген и присутствует в композиции в количестве примерно 2108 мг/400 ккал.

В других вариантах осуществления композиция может содержать куркумин в количестве примерно 15 мг/400 ккал (22 мг/400 ккал куркуминоидов) с примерно 51 мг/400 ккал полифенола зеленого чая и с примерно 1736 мг/400 ккал сочетания глицина, пролина и гидроксипролина, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген. Предпочтительно, где сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген и присутствует в композиции в количестве примерно 1016 мг/400 ккал.

Данные значения применимы к композиции для кормления млекопитающего, в частности животного-компаньона.

Второй аспект изобретения относится к способу предотвращения или лечения остеоартрита у млекопитающих.

Остеоартрит (ОА) представляет собой дегенеративное и воспалительное состояние, при котором поражаются суставы млекопитающих. Он также известен как дегенеративный артрит или дегенеративное заболевание суставов. Остеоартрит представляет собой группу нарушений, включающих в себя разрушение суставов, включая суставный хрящ и субхондральную кость.

Остеоартрит представляет собой последствие дисбаланса катаболизма и анаболизма, при котором катаболизм повышен, анаболизм понижен, что вызывает воспаление хондроцитов. Хондроциты представляют собой единственные клетки, обнаруживаемые в здоровом хряще. Они продуцируют и поддерживают хрящевую матрицу, которая состоит главным образом из коллагена и протеогликанов. Продемонстрировано, что композиция изобретения обеспечивает, среди прочего, уменьшение воспаления, понижение катаболизма и повышение анаболизма в случае индуцированного воспаления хондроцитов in vitro и в случае здоровых хондроцитов in vitro. Таким образом, композиция изобретения предотвращает остеоартрит и/или оказывает лечебное воздействие в отношении остеоартрита у животных.

Настоящее изобретение относится во всех аспектах к любому млекопитающему, включая человека. В частности, настоящее изобретение относится к животному-компаньону, такому как собака, кошка или животное рода лошадиных (например, лошадь), или любому другому такому животному, которое страдает остеоартритом или предрасположено к остеоартриту.

В частности, в области кормов для животных и здоровья животных-компаньонов желательным является предоставление корма, включающего в себя добавки, подходящие для поддержания здоровья животных-компаньонов. В частности, желательно предоставить рационы, подходящие для содействия укреплению или поддержания здоровья уже здоровых животных-компаньонов.

В частности, второй аспект изобретения предоставляет способ предотвращения и лечения остеоартрита у млекопитающих, включая уменьшение симптомов остеоартрита, в частности у животных-компаньонов. Способ включает в себя введение указанному животному композиции, которая содержит куркумин с полифенолом зеленого чая или с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина. Животное может нуждаться в таком введении. Поскольку значительное число собак страдает остеоартритом на протяжении своей жизни, всех собак можно рассматривать как нуждающихся в предотвращении.

В конкретных вариантах осуществления способ включает в себя введение указанному животному композиции, содержащей куркумин, полифенол зеленого чая и сочетание глицина, пролина и гидроксипролина. Наиболее предпочтительно, сочетание глицина, пролина и гидроксипролина представляет собой гидролизованный коллаген.

Далее, способ предпочтительно применяют в отношении животного, в частности животного-компаньона, которое страдает остеоартритом и нуждается в уменьшении симптомов остеоартрита или нуждается в предотвращении дополнительных симптомов остеоартрита, или нуждается в лечении остеоартрита. Способ можно применять, например, в отношении детеныша домашнего животного, такого как щенок, или старого животного. Когда композиция представляет собой корм, корм может быть введен в режиме питания в соответствии с обычным режимом питания животного-компаньона. Корм может содержать 100% рациона животного-компаньона или меньшую долю в зависимости от требуемого уровня предотвращения или лечения. Корм обеспечивает возможность легкого введения композиции, позволяя, таким образом, избежать необходимости введения добавки в пищу животного-компаньона. Кроме того, корм может быть введен владельцем животного, позволяя, таким образом, избежать необходимости постоянного ветеринарного наблюдения. Корм может быть доступен в любой торговой точке, продающей продукты питания для домашних животных, или может быть доступен от ветеринара. Корм может представлять собой таковой, как описано выше согласно первому аспекту изобретения.

Использованный здесь термин “введение” также включает в себя кормление или любой другой способ перорального введения. Другие средства введения могут включать в себя таблетки, капсулы, инъекцию, суппозитории или любые другие подходящие средства.

С учетом соответствующих изменений в отношении второго аспекта изобретения применимы предпочтительные признаки первого аспекта.

Настоящее описание включает в себя способ получения композиции первого аспекта изобретения.

Корм может быть изготовлен согласно любому способу, известному в данной области, такому как описанный в руководстве Waltham Book of Dog and Cat Nutrition под редакцией A. T. B. Edney, в главе, озаглавленной “A Balanced Diet”, автор A. Rainbird, на страницах 57-74, Pergamon Press, Oxford.

Например, способ изготовления корма, определение которому дано здесь, включает в себя совместное смешение ингредиентов с композицией, содержащей куркуминоид с полифенолом зеленого чая или с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина, и формирование корма, в частности корма для домашних животных. Нагрев/кулинарную обработку можно применять в отношении любого одного или более из ингредиентов до, в ходе или после смешения.

Композиция может быть распылена на корм, смешана с кормом или включена в корм в матрице. Способы включения композиции известны в данной области.

Важность настоящего изобретения заключается в полезных свойствах куркуминоида, использованного либо с полифенолом зеленого чая, либо с сочетанием глицина, пролина и гидроксипролина (необязательно, в виде гидролизованного коллагена). В частности, наблюдается эффект, который является более чем совокупным эффектом.

Дополнительное преимущество наблюдается в случае тройного сочетания ингредиентов: куркуминоида, полифенола зеленого чая и глицина, пролина и гидроксипролина (необязательно, в виде гидролизованного коллагена).

Сочетание соединений композиции настоящего изобретения может обеспечивать синергетический эффект в плане одного или более из: уменьшения воспаления, понижения катаболизма и повышения анаболизма.

Далее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приведены лишь с иллюстративной целью и не должны рассматриваться в качестве ограничивающих изобретение.

Пример 1: Скрининг отдельных соединений

Были проведены эксперименты для того, чтобы оценить действие нескольких соединений на культуру бычьих хондроцитов, в которых воспалительные и катаболические процессы индуцировали интерлейкином-1бета, чтобы имитировать эффект артритных хондроцитов.

В приведенной ниже таблице подробно описаны биомаркеры, которые измеряли в экспериментах, чтобы продемонстрировать действие соединений трех метаболических путей на хондроциты.

Первичная культура бычьих хондроцитов в монослое

Нормальный бычий суставный хрящ получали из пястно-фалангового сустава 1-2-летних кастрированных бычков вскоре после смерти. Суставный хрящ вырезали на полную длину и погружали в модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM) (с феноловым красным и 4,5 г/л глюкозы), дополненную 10 мМ N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновой кислоты) (HEPES), пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (0,1 мг/мл) (все компоненты от Lonza, Вервье, Бельгия). После трех промывок хондроциты высвобождали из хряща последовательными ферментациями, воздействуя 0,5 мг/мл гиалуронидазы типа IV S (Sigma-Aldrich, Борнем, Бельгия) в течение 30 мин при 37°C, 1 мг/мл проназы E (Merck, Левен, Бельгия) в течение 1 ч при 37°C и 0,5 мг/мл клостридиальной коллагеназы IA (Sigma-Aldrich, Борнем, Бельгия) в течение 16-20 ч при 37°C. Затем ферментативно изолированные клетки фильтровали через нейлоновое сито (70 мкм), трижды промывали, подсчитывали и доводили до плотности 0,25×10⁶ клеток/мл среды DMEM (с феноловым красным и 4,5 г/л глюкозы), дополненной 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина (все компоненты от Lonza, Вервье, Бельгия) и 20 мкг/мл пролина (Sigma-Aldrich, Борнем, Бельгия). Клетки высевали в 6-луночный планшет в количестве 0,5×10⁶ клеток/лунку путем добавления 2 мл вышеописанной культурной среды/лунку и культивировали в монослое в течение 5 дней. Затем хондроциты культивировали в монослое до конфлюэнтности (в течение примерно 2 дней) в среде DMEM (не содержащей фенолового красного и содержащей только 1 г/л глюкозы) (Lonza, Вервье, Бельгия), дополненной 1% эмбриональной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина и 20 мкг/мл пролина. Для обеспечения стабильности фенотипа хондроцитов использовали только первичные культуры.

Когда клетки достигли конфлюэнтности, культурную среду удаляли и заменяли свежей культурной средой (среда DMEM, не содержащая фенолового красного и содержащая только 1 г/л глюкозы, дополненная 1% эмбриональной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина и 20 мкг/мл пролина), содержащей некоторые нутрицевтики (12,5 мкг/мл каждого из них) и с отсутствующим или присутствующим рекомбинантным свиным ИЛ-1β (10^-11 М) (RD System, Абингдон, Великобритания).

Противовоспалительную активность соединений (сначала по отдельности, а затем в сочетании) оценивали измерением жизнеспособности хондроцитов и продукции PGE2 и NO.

Соединения добавляли в культурную среду либо до воспаления (измерение профилактического эффекта), либо одновременно с воспалением (измерение лечебного эффекта).

Список соединений, подвергнутых скринингу:

1) Рыбий жир: 18% ЭПК (эйкозапентаеновая кислота)+10% ДГК (докозагексаеновая кислота) (DSM)

2) ЭПК 99% (Sigma)

3) ДГК 99% (Sigma)

4) Aloe Vera (Naturex)

5) Экстракт листьев крапивы (Naturex)

6) Resvida: 99% ресвератрол (DSM)

7) Экстракт зеленого чая: 25% полифенолов, из которых 12,5% составляют катехины и 8% приходится на ЭГКГ (Naturex)

8) Экстракт сосновой коры: пикногенол: 65-75% процианидинов (Biolandes)

9) Готовая смесь витаминов, включающая в себя витамин D3

10) GLM (AromaNZ)

11) Гидролизат коллагена (Fortigel de Gelita [3,3 кДа]: гидролизованный свиной коллаген)

12) ASU (Sochim)

13) Порошок куркумы: 85% куркуминоидов (Naturex)

Результаты показали, что 3 соединения, заслуживающие использования, представляли собой экстракт куркумы, гидролизат коллагена и экстракт зеленого чая, которые показали значительное влияние на различные параметры. Исходя из этого, для данных 3 соединений оценивали зависимость “доза-ответ”.

Пример 2: Зависимости “доза-ответ”

Следовали методологии примера 1. Оценивали четыре разные концентрации, чтобы покрыть диапазон концентраций, соответствующий 10^-5 М в зависимости от молекулярной массы: 0,5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 12,5 мкг/мл и 62,5 мкг/мл.

Результаты показали, что концентрация, которая давала наилучшие эффекты без токсических эффектов, составляла 12,5 мкг/мл для каждого соединения. Поэтому концентрацию 12,5 мкг/мл использовали для испытания соединений в сочетании друг с другом.

Пример 3: Испытание конкретных сочетаний соединений и синергетические эффекты

Следовали способу примера 1.

Введение соединений

Когда клетки достигли конфлюэнтности, культурную среду удаляли и заменяли свежей культурной средой (среда DMEM, не содержащая фенолового красного и содержащая только 1 г/л глюкозы, дополненная 1% эмбриональной бычьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина и 20 мкг/мл пролина), содержащей некоторые соединения (12,5 мкг/мл каждого из них) и с отсутствующим или присутствующим рекомбинантным свиным ИЛ-1β (10^-11 М) (RD System, Абингдон, Великобритания).

Испытывали три соединения, а именно: экстракт куркумы (Naturex, Авиньон, Франция), гидролизат коллагена (Gelita, Эбербах, Германия) и экстракт зеленого чая (Naturex, Авиньон, Франция). Экстракт куркумы готовили как раствор с концентрацией 12,5 мг/мл в тетрагидрофуране (Merck, Левен, Бельгия) и затем дополнительно разводили в 1000 раз в среде для клеточных культур. Гидролизат коллагена и экстракт зеленого чая растворяли в воде в концентрации 12,5 мг/мл, фильтровали через стерильное сито (0,20 мкм) и затем дополнительно разводили в 1000 раз в среде для клеточных культур. Соединения испытывали в одиночку при конечной концентрации 12,5 мкг/мл или в сочетании (12,5 мкг/мл экстракта куркумы + 12,5 мкг/мл гидролизата коллагена; 12,5 мкг/мл экстракта куркумы + 12,5 мкг/мл экстракта зеленого чая; 12,5 мкг/мл экстракта куркумы + 12,5 мкг/мл гидролизата коллагена + 12,5 мкг/мл экстракта зеленого чая) в отсутствии или в присутствии рекомбинантного свиного ИЛ-1β (10^-11 М). Эффекты соединений сравнивали с контролями: только DMEM или DMEM + ИЛ-1β.

Остановка роста культуры

По прошествии 24 ч в данных условиях кондиционированную культурную среду трех лунок каждого условия собирали и сохраняли при -20°C. Клетки данных соответствующих лунок соскабливали, используя мини-набор RNeasy (Qiagen, Венло, Нидерланды) проводили извлечение РНК, осуществляли полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой, а затем осуществляли количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени, используя LightCycler 480 (Roche, Вилворде, Бельгия), чтобы проанализировать экспрессию генов.

По прошествии 48 ч в данных условиях кондиционированную культурную среду оставшихся лунок (3 для каждого условия) собирали (анализ высвобождения лактатдегидрогеназы) и сохраняли при -20°C до проведения анализа (анализ на нитрил и простагландин E2). Клетки соскабливали и гомогенизировали в 500 мкл буфера Tris-HCl посредством ультразвукового диспергирования в течение 20 с при 4°C, чтобы измерить содержание ДНК.

Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы

Жизнеспособность клеток оценивали количественным определением высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в супернатанте культуры. Образец супернатанта объемом 100 мкл или разведения стандартного раствора (ЛДГ из мышцы кролика) смешивали с 50 мкл буфера Tris (10 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 0,1% бычьего сывороточного альбумина), содержащего 800 мМ лактата. Затем добавляли 50 мкл колориметрического реагента, 1,6 мг/мл хлорида иодонитротетразолия (Sigma-Aldrich, Борнем, Бельгия), 4 мг/мл никотинамид-аденинового динуклеотида (Roche Diagnostics, Брюссель, Бельгия) и 0,4 мг/мл метосульфата феназина (Sigma-Aldrich, Борнем, Бельгия), и спустя 10 мин инкубации при комнатной температуре считывали поглощение при 492 нм.

Анализ ДНК

Хондроциты гомогенизировали в 500 мкл буфера Tris-HCl посредством ультразвукового диспергирования в течение 15 с при 4°C. Содержание ДНК измеряли в клеточных экстрактах, используя флуориметрический метод Hoechst.

Анализ на нитрил

Продукцию оксида азота (NO) определяли путем количественного определения образующегося из него нитрила в супернатанте культуры, используя спектрофотометрический метод, основанный на реакции Грисса. Вкратце, 100 мкл супернатанта или стандартных растворов нитрита натрия (NaNO₂) смешивали со 100 мкл реагента Грисса (0,5% сульфаниламида, 0,05% дигидрохлорида нафтилэтилендиамина, 2,5% H₃PO₄). Поглощение измеряли при 540 нм. Продукцию NO выражали на микрограмм ДНК.

Анализ на PGE2

Продукцию простагландина E2 (PGE2) измеряли в супернатанте культуры, используя набор для высокочувствительного иммуноанализа DetectX PGE2 (Arbor Assays, Мичиган, США). Вкратце, 100 мкл супернатанта или стандартных разведений PGE2 отмеряли пипеткой в чистый планшет для микротитрования, покрытый антителом для захвата мышиного IgG. Конъюгат PGE2-пероксидаза (25 мкл) добавляют к стандартам и супернатантам в лунках. Реакцию связывания инициируют добавлением 25 мкл моноклонального антитела к PGE2. После инкубации в течение ночи при 4°C планшет промывают и добавляют 100 мкл субстрата. Субстрат реагирует со связанным конъюгатом PGE2-пероксидаза. После короткой инкубации реакцию останавливают и интенсивность образовавшейся окраски детектируют при длине волны 450 нм. Продукцию PGE2 выражали на микрограмм ДНК.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой в реальном времени (RT-ПЦР)

РНК клеток из 3 лунок для каждого условия изолировали, используя мини-набор RNeasy (Qiagen, Венло, Нидерланды). Затем проводили обратную транскрипцию РНК. Количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли, используя SYBR Prenix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Westburg, Лейсден, Нидерланды). Источник матрицы ПЦР представлял собой либо первоцепочечную кДНК, либо стандарт очищенной ДНК. Последовательности праймера, использованные для амплификации желаемой кДНК представляли собой следующие: прямые и обратные праймеры бычьей ГФРТ: 5'-AGTTTGGAAATACCTGGCG-3' и 5'-AGTCTTTAGGCTCGTAGTGC-3'; прямые и обратные праймеры бычьего интерлейкина-6 (ИЛ-6): 5'-TGGTGATGACTTCTGCTTTCC-3' и 5'-TGCCAGTGTCTCCTTGC-3'; прямые и обратные праймеры бычьей циклооксигеназы-2 (COX-2): 5'-GTCTGATGATGTATGCCACC-3' и 5'-ACGTAGTCTTCAATCACAATCT-3'; прямые и обратные праймеры бычьей индуцированной синтазы оксида азота (iNOS): 5'-GGCAAGCACCACATTGAGA-3' и 5'-TGCGGCTGGATTTCGGA-3'; прямые и обратные праймеры бычьих аггреканов (AGG): 5'-TGCCTTTGACGTGAGC-3' и 5'-GCATTGTTGTTGACAAACT-3'; прямые и обратные праймеры бычьего коллагена типа II (COL2): 5'-CTGCGTCTACCCCAAC-3' и 5'-GGGTGCAATGTCAATGAT-3'; прямые и обратные праймеры бычьей металлопротеиназы-3 (MMP-3): 5'-TCTATGAAGGAGAAGCTGACATAAT-3' и 5'-TTCATGGGCAGCAACAAG-3'; прямые и обратные праймеры бычьего дизинтегрина A и металлопротеиназы с тромбоспондиновыми мотивами 4 (ADAMTS 4): 5'-CTTTCAATGTCCCACAGGC-3' и 5'-CAGGAACGGAAGCGGGTA-3'; прямые и обратные праймеры бычьего ADAMTS 5: 5'-GACACCCTGGGAATGGCA-3' и 5'-CACAGAACTTGGAATCGTCA-3'.

Амплификацию осуществляли с помощью спектрофлуорометрического термоциклера (LightCycler 480, Roche Diagnostics, Вилворде, Бельгия). Для стандартизации уровней мРНК авторы изобретения амплифицировали ГФРТ, ген “домашнего хозяйства”, в качестве внутреннего контроля. Экспрессию генов нормировали путем расчета соотношения между числом копий кДНК для ИЛ-6, COX2, iNOS, AGG, COL2, MMP-3, ADAMTS4, ADAMTS5 и для ГФРТ.

Результаты выражали в виде среднего процента увеличения по сравнению с контролем. Статистическую значимость определяли, используя t-тест. Разницы рассматривали статистически значимыми при p<0,05. В нижеприведенной таблице подробно представлены полученные результаты для сочетания соединений и наблюдаемые синергетические эффекты.

Обсуждение

Результаты для сочетаний были лучше, чем аддитивный эффект каждого соединения. Объяснением является то, что поскольку соединения действуют на разные метаболические пути, которые связаны друг с другом, когда имеется воспаление, повышается катаболизм и снижается анаболизм. Таким образом, неограничивающая гипотеза авторов изобретения заключается в том, что куркумин ингибирует воспаление, индуцированное ИЛ-1β (а также индуцированное коллагеном и зеленым чаем). Когда воспаление ингибировано, катаболизм снижается, и коллаген и полифенолы зеленого чая могут оказывать свое положительное воздействие на анаболизм. Учитывая, что артроз представляет собой порочный круг (воспаление индуцирует катаболизм, который индуцирует воспаление и так далее), когда катаболизм снижается (и повышается анаболизм), имеется уменьшение воспаления и восстанавливается благоприятный круг.

Более того, в общем, в здоровых клетках всегда существует баланс между катаболизмом и анаболизмом. Авторы изобретения показали, что описанные сочетания могли бы оказывать положительное воздействие на метаболизм здоровых клеток (в отсутствии индукции воспаления ИЛ-1β). Это весьма интересно, поскольку в случае артроза или пред развитием артроза клетки, которые еще здоровы, могут быть защищены предложенными авторами изобретения сочетаниями.