СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ КОГНИТИВНОЙ ФУНКЦИИ

Область изобретения

Изобретение относится к композициям и способам их применения для (i) усиления исполнительных когнитивных функций (например, принятие решений, планирование, кратковременная память, многозадачная работа, способность к суждению, решение числовых задач, способность к пониманию прочитанного материала), и/или (ii) увеличения кровотока в сосудистой сети мозга, предусматривающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, определенных полифенольных соединений, приведенных в описании.

Предшествующий уровень техники

Флаванолы и процианидины привлекли к себе большое внимание в областях медицины и питания благодаря широкому спектру их биологических активностей (например, патент США No. 6297273). В настоящее время авторы изобретения обнаружили, что введение перечисленных в описании соединений приводит к усилению исполнительной когнитивной функции(й) и/или к увеличению кровотока в сосудистой сети мозга.

Магнитно-резонансная томография (MRI) является способом визуализации, который основан на принципах ядерного магнитного резонанса (NMR), спектроскопического способа, используемого для получения микроскопической химической и физической информации о молекулах. MRI используют главным образом в медицинских установках для получения высокого качества изображений внутренних частей тела человека. Системы MRI также могут отображать кровоток практически в любой части тела. Это позволяет проводить исследования на уровне изображений артериальной системы в организме, но не ткани вокруг нее. Во многих случаях система MRI может работать без контрастной инъекции, которая требуется в радиологии сосудистой системы.

Изменения в кровотоке и оксигенации крови (вместе названные гемодинамикой) в сосудистой сети мозга, как известно, тесно связаны с нейрональной активностью или сопровождают ее (т.е. активность/функция мозга). Поэтому активность/функция мозга может быть исследована путем картирования изменений гемодинамики мозга с использованием способов визуализации. Функциональная магнитно-резонансная визуализация (fMRI) является одним из таких способов на основе магнитного резонанса (MR), используемого для определения функции головного мозга. Указанный способ позволяет измерить изменения активности мозга через эффект контраста, зависимый от уровня оксигенации крови (“BOLD”). BOLD-эффект основан на изменениях в распределении оксигенированного гемоглобина. Когда клетки мозга активны, они потребляют кислород, переносимый гемоглобином в эритроцитах из местных капилляров. Такое потребление кислорода приводит к увеличению кровотока к областям повышенной активности мозга, которое приводит к локальным изменениям относительной концентрации оксигемоглобина и дезоксигемоглобина. Следовательно, изменение уровня оксигенации, измеряемого посредством BOLD-ответа, возникает в результате сложного взаимодействия увеличеного мозгового кровотока (CBF), объема центрального кровотока (CBV) и скорости метаболизма кислорода в мозговой ткани (CMRO₂). Таким образом, изменения BOLD-сигнала хорошо коррелируют с изменениями в кровотоке, т.е. увеличение BOLD-ответа является показателем повышенного кровотока, который, в свою очередь, может соответствовать усилению когнитивной функции, например, повышению психической активности и/или способностям.

Спиновый метод маркировки артериальной крови (ASL) представляет собой другой неинвазивный метод визуализации, основанный на магнитном резонансе (MR), который позволяет осуществить физиологически значимое измерение CBF в абсолютных единицах (т.е. мл крови/100 грамм ткани/минуту). Визуализация на основе ASL возможна благодаря такой же региональной нейроваскулярной взаимосвязи, которая представляет собой основу BOLD-ответа; однако она скорее дает возможность количественно измерить изменения в кровотоке как таковые, чем изменения в оксигенации крови.

Применение перечисленных выше способов визуализации головного мозга (fMRI, BOLD-ответ и ASL) дают возможность осуществить данное изобретение.

Исполнительные когнитивные функции играют критическую роль в выполнении многочисленных сложных задач, например, принятии решений, планировании, рабочей памяти, многофункциональности, способности к суждению, способности к решению числовых задач и способности к пониманию прочитанного материала. Следовательно, в данной области существует потребность в способах усиления исполнительной когнитивной функции(й) и/или увеличения кровотока в головном мозге.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам их пприменение для (i) усиления исполнительной когнитивной функции(й) и/или (ii) увеличения кровотока в сосудистой сети мозга, предусматривающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, определенных полифенольных соединений, приведенных в описании.

В одном аспекте, изобретение относится к композиции, такой как фармацевтический препарат, пища, пищевая добавка или биологически активная добавка, содержащей соединения согласно изобретению. Композиция может необязательно содержать дополнительное средство, повышающее/улучшающее познавательную способность. Упакованные продукты, содержащие указанные выше композиции и этикетку и/или инструкции для использования с целью повышения/улучшения психической познавательной способности и/или лечения/предотвращения состояний, ассоциированных с ухудшением психической познавательной способности, также входят в объем изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к способу повышения активности головного мозга (определенной, например, путем использования fMRI BOLD-ответа) в некоторых областях мозга, предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, соединений согласно изобретению. Неограничивающие примеры таких активированных областей включают в себя правую дорсолатеральную префронтальную кору головного мозга, теменную кору и переднюю часть поясной извилины.

В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения кровотока к головному мозгу (измеренного, например, путем использования ASL), предусматривающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, соединений согласно изобретению.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: графически представлено среднее время реакции (±SEM) для буквенно-цифрового задания. Время реакции усредняли по всем субъектам.

Фигура 2(а): представлена картина связанной с заданием активности в 'переключении' по сравнению с исходным состоянием для 'высокого флаванола' (напиток с высоким содержанием флаванола). Статистические параметрические карты с заданными границами при Р<0,05 (с поправкой) по высоте и пространственной протяженности.

Фигура 2(b): представлена картина связанной с заданием активности для сравнения между условиями 'переключение' и 'без переключения' ('переключение' по сравнению с исходным состоянием > 'без переключения' по сравнению с исходным состоянием) для 'высокого флаванола'. Статистические параметрические карты с заданными границами при Р<0,05 (с поправкой) по высоте и пространственной протяженности.

Фигура 3: представлена кривая времени средних ответов мозгового кровотока (±SEM) через серое вещество (n=4) после принятия большой дозы напитка с высоким и низким содержанием флаванола.

Фигура 4(a-d): представлены результаты влияния напитка какао, обогащенного флаванолами/процианидинами, на “батарею тестов по определению познавательной способности”: (а) тест на правильность ответов, состоящий из последовательных вычитаний по три от заданного числа (Threes Correct test); (b) тест на частоту ошибочных ответов, состоящий из последовательных вычитаний по семь от заданного числа (Sevens Error test); (с) задание на скорость обработки зрительной информации (RVIP); и (d) ментальное утомление.

Подробное описание

Все патенты, патентные заявки и ссылки, цитируемые в данной заявке, включены в описание посредством ссылки. В случае возникновения какого-либо противоречия следует иметь в виду, что настоящее описание имеет приоритетное значение.

Настоящее изобретение относится к композициям, продуктам и способам для (i) усиления исполнительных когнитивных функций и/или (ii) увеличения кровотока в сосудистой сети мозга, каждый из которых включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, некоторых полифенольных соединений, приведенных в описании. Соединения для использования в настоящем изобретении включают в себя определенные флаванолы (флаван-3-олы), процианидины или их фармацевтически приемлемые соли или производные. Такие соединения, в случае природного происхождения, могут быть включены в композицию в виде компонента какао, например, очищенных от шелухи зерен какао или их фрагментов, тертого какао, частиц какао (например, частично или полностью обезжиренного), экстракта какао или его фракции.

Употребляемый в описании термин “флаванол” или “флаван-3-ол” относится к мономеру следующей формулы:

Термин “процианидин” относится к олигомеру мономера, представленного выше.

Термин “компонент какао” относится к компоненту, полученному из бобов какао, например, зерен какао, очищенных от шелухи, и их фрагментов, тертого какао, частиц какао (например, частично и полностью обезжиренный жмых или порошок), экстракта какао, содержащего флаванол и/или процианидин, или его фракции.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к флаванолу (например, (-)-эпикатехину и (+)-катехину) и композиции, содержащей эффективное количество флаванола (например, (-)-эпикатехина и (+)-катехина), или его фармацевтически приемлемой соли или производному (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные). Производные могут быть получены, как описано ниже.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к соединению и композиции, содержащей эффективное количество соединения со следующей формулой A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производному (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n является целым числом от 2 до 18;

каждый из R и X имеет либо α-, либо β-стереохимию;

R означает OH или O-сахар или O-галлат;

заместители С-4, С-6 и С-8 означают X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит у С-4, С-6 или С-8;

когда любой из заместителей С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z независимо означают водород или сахар; и

сахар необязательно замещен фенольным фрагментом в любом положении, например, посредством сложноэфирной связи.

Мономерные единицы в формуле A_n могут быть связаны посредством 4→6α; 4→6β; 4→8α и/или 4→8β связей. Сахар предпочтительно является моносахаридом или дисахаридом. Сахар может быть выбран из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, рамнозы, ксилозы и арабинозы. Фенольный фрагмент может быть выбран из группы, состоящей из кофеиновой, коричной, кумаровой, феруловой, галлиевой, гидроксибензойной и синаповой кислот. Производные могут включать сложные эфиры, такие как эфиры галлиевой кислоты; соединения, полученные с сахаридным фрагментом, таким как моно- или дисахаридный фрагмент (например, β-D-глюкоза), глюкуронидированные и метилированные производные и продукты окисления. В некоторых вариантах осуществления изобретения сложноэфирными производными являются производные, отличные от сложных эфиров галлиевой кислоты. Продукты окисления могут быть получены, как описано в патенте США No. 5554645, существенные части которого включены в данное описание посредством ссылки. Сложные эфиры, например, с галлиевой кислотой, могут быть получены известными реакциями этерификации и, например, как описано в патенте США No. 6420572, раскрытие которого включено в данное описание посредством ссылки. Метилированные производные, такие как 3'О-метил-, 4'О-метил- и 3'О,4'О-диметил-производные могут быть получены, например, как описано в публикации Cren-Olive et al., 2002, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 821-830 и Donovan et al., Journal of Chromatography B, 726 (1999) 277-283, раскрытие которых включено в данное описание посредством ссылки. Глюкуронидированные продукты могут быть получены, как описано в публикации Yu et al., “A novel and effective procedure for the preparation of glucuronides”, Organic Letters, 2(16) (2000) 2539-41, и в публикации Spencer et al., “Contrasting influences of glucuronidation and O-methylation of epicathechin on hydrogen peroxide-induced cell death in neurons and fibroblasts”, Free Radical Biology and Medicine 31(9) (2001) 1139-46, которая включена в данное описание посредством ссылки. Следует отметить, что данное раскрытие применимо ко всем формулам, цитируемым в описании.

В другом варианте осуществления изобретение относится к соединению и композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы A_n или его фармацевтически приемлемой соли или производному (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n является целым числом от 2 до 18;

каждый из R и X имеет либо α-, либо β-стереохимию;

R означает OH;

заместители С-4, С-6 и С-8 означают X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит у С-4, С-6 или С-8; и

когда любой из заместителей С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z означают водород.

Примеры соединений, пригодных для продуктов и для способов согласно изобретению, включают соединения формулы A_n, приведенные в описании, где целое число n равно от 3 до 18; от 2 до 12; от 3 до 12; от 2 до 5; от 4 до 12; от 5 до 12; от 4 до 10; или от 5 до 10. В некоторых вариантах осуществления изобретения целое число n равно от 2 до 4, например, 2 или 3. Это раскрытие применимо к любому соединению формулы A_n, представленному в описании.

Способы применения

Изобретение относится к способам (i) усиления исполнительной когнитивной функции(й) и/или (ii) увеличения кровотока в сосудистой сети мозга.

Здесь “исполнительную когнитивную функцию” определяют как познавательную способность высшего порядка, которая играет роль в управлении (подобно “управляющему”) другими когнитивными функциями, такими как внимание, речь и память. Примеры исполнительных когнитивных функций включают в себя принятие решений, многопрофильность, кратковременную память, способность к выполнению сложных числовых расчетов, способность к пониманию прочитанного материала.

“Усиление когнитивной функции” определяют здесь как измеряемое улучшение по меньшей мере одной из исполнительных когнитивных функций. Специалист в данной области будет выбирать известные способы измерения улучшения когнитивных функций, например, способы, описанные в примерах.

“Ухудшение познавательных способностей” определяют здесь как нарушение познавательных способностей у здорового субъекта, например, пожилого/престарелого субъекта, т.е. здесь “ухудшение познавательных способностей” не относится к нейродегенеративному состоянию.

Согласно настоящему описанию “здоровый” субъект является субъектом, который не страдает от нейродегенеративного заболевания или у которого оно не выявляется.

Здесь “увеличение кровотока” относится к повышению количества крови, доставляемой к ткани, которое может быть выражено в единицах миллилитров (мл) крови на 100 мл ткани в минуту. Увеличение кровотока в головном мозге относится к увеличению объема крови, поступающей в единицу объема мозга в единицу времени.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен (i) способ усиления исполнительной когнитивной функции и/или (ii) способ увеличения кровотока к сосудистой сети мозга, каждый из которых включает в себя введение млекопитающему (например, человеку) или “ветеринарному” животному, нуждающемуся в таком введении, эффективного количества флаванола, такого как эпикатехин или катехин (например, (-)-эпикатехин или (+)-катехин), или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные).

Термин “ветеринарное животное” относится к любому животному, за которым ухаживает или которому оказывает помощь ветеринарный врач, и включает в себя домашних (комнатных) животных и домашний скот, например, кошку, собаку и лошадь (например, скаковую лошадь).

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к (i) способу усиления исполнительной когнитивной функции и/или (ii) способу увеличения кровотока к сосудистой сети мозга, каждый из которых включает в себя введение млекопитающему (например, человеку) или “ветеринарному” животному, нуждающемуся в таком введении, композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n является целым числом от 2 до 18;

каждый из R и X имеет либо α-, либо β-стереохимию;

R означает OH или O-сахар или O-галлат;

заместители С-4, С-6 и С-8 означают X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит у С-4, С-6 или С-8;

когда любой из заместителей С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z независимо означают водород или сахар; и

сахар необязательно замещен фенольным фрагментом в любом положении, например, посредством сложноэфирной связи.

Например, приведенный выше способ может включать в себя использование соединения формулы A_n или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные), где R означает OH, и когда С-4, С-6 или С-8 не связаны с другой мономерной единицей, X, Y и Z означают водород. Примерами подходящих сахаров являются описанные выше сахара. Примерами фенольных фрагментов являются такие, какие описаны выше. Примерами производных являются описанные выше производные.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к (i) способу усиления исполнительной когнитивной функции и/или (ii) способу увеличения кровотока к сосудистой сети мозга, каждый из которых включает в себя введение млекопитающему (например, человеку) или “ветеринарному” животному, нуждающемуся в таком введении, композиции, содержащей эффективное количество соединения формулы A_n, или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные):

где

n является целым числом от 2 до 18;

каждый из R и X имеет либо α-, либо β-стереохимию;

R означает OH;

заместители С-4, С-6 и С-8 означают X, Z и Y, соответственно, и связывание мономерных единиц происходит у С-4, С-6 или С-8; и

когда любой из заместителей С-4, С-6 или С-8 не связан с другой мономерной единицей, X, Y и Z означают водород.

Примеры соединений, пригодных для продуктов и способов согласно изобретению, включают в себя соединения, приведенные в описании, где целое число n равно от 3 до 18; от 2 до 12; от 3 до 12; от 2 до 5; от 4 до 12; от 5 до 12; от 4 до 10; или от 5 до 10. В некоторых вариантах осуществления целое число n равно от 2 до 4, например, 2 или 3. Это раскрытие применимо к любому соединению формулы A_n, представленному в описании.

Хотя любому человеку или ветеринарному животному могут быть полезны способы, приведенные в описании, следует понимать, что “субъект, нуждающийся в этом” является субъектом, у которого возникла необходимость в усилении когнитивной функции, или субъектом, имеющим профессию (или выполняющим задачи), которая требует(ют) постоянного подключения исполнительной когнитивной функции(й). Примеры субъектов, нуждающихся в усилении когнитивной функции(й) и/или увеличении кровотока, будут очевидны специалистам в данной области, например, субъекты, которые неизбежно будут участвовать в соревновательной деятельности (например, субъекты, находящиеся на экзамене, состязающиеся в спортивных/атлетических мероприятиях, проходящие собеседование при приеме на работу); субъекты, обращающиеся к публике/собранию (например, преподаватели, политики, ведущие прямые передачи телевизионных новостей, репортеры); эстрадные артисты (например, киноактеры и исполнители в прямом эфире); и субъекты, занимающиеся деятельностью, включающей периоды напряженной психической работы. Также включенными в изобретение являются субъекты, которые выполняют задания, требующие принятие сложных решений и многопрофильности, например, руководящие работники высокого ранга; транспортные рабочие (например, водители транспортных средств, водители тепловозов, летчики гражданской авиации, капитаны/командиры судна); строительные рабочие (например, строящие конструкции высокого риска, такие как мосты, высотные здания, дорожные полотна и железнодорожные линии в горах); военные специалисты (например, командиры военных кораблей, летчики боевых самолетов, лоцманы военных кораблей). Кроме того, пожилой/престарелый индивидуум (например, > 65, например, > 75 лет), который испытывает ухудшение познавательной способности, но у которого не было клинически диагностировано нейродегенеративное расстройство, также ощутит пользу от композиций и способов, приведенных в описании.

Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить перорально в виде компонента какао, например, зерен какао, очищенных от шелухи, и их фрагментов, тертого какао, частиц какао (например, частично и полностью обезжиренные частицы какао, примером частиц какао является порошок какао), экстракта какао или его фракции, или могут быть добавлены независимо от компонентов какао. Компонент какао может быть получен таким образом, что содержание полифенолов какао (СР) сохраняется, например, путем изменения традиционных стадий обработки, как описано, например, в патентах США No. 6194020 и 6599553.

В некоторых вариантах осуществления соединения согласно изобретению можно вводить в комбинации с другими средствами, усиливающими познавательный процесс, и/или для повышения восприимчивости к другим средствам, усиливающим познавательный процесс.

Примеры средств, усиливающих познавательный процесс, включают в себя метаболические субстраты (например, глюкоза, кетоны, дополнительный кислород), алкалоиды (например, теобромин, кофеин), витамины, аминокислоты, минералы, питательные микроэлементы, экстракты из растительного сырья или их производные, травы или травяные пищевые добавки (например, гинкго, корень женьшеня).

Таким образом, следующие применения включены в сферу изобретения. Применение флаванола или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные), как определено выше, в производстве лекарственного средства, пищи, нутрицевтика или биологически активной добавки для усиления исполнительной когнитивной функции и/или для увеличения кровотока в сосудистой сети мозга. Применение соединения формулы A_n или его фармацевтически приемлемой соли или производного (включая продукты окисления, метилированные производные и глюкуронидированные производные), как определено выше, в производстве лекарственного средства, пищи, нутрицевтика или биологически активной добавки для усиления исполнительной когнитивной функции и/или для увеличения кровотока в сосудистой сети мозга.

Эффективное количество может быть определено специалистом в данной области при использовании представленного в описании руководства и общих знаний в данной области. Например, эффективное количество может быть таким, которое может достичь физиологически значимой концентрации в организме млекопитающего. Такой физиологически значимой концентрацией может быть по меньшей мере 20-наномолярная (нМ) концентрация, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100 нМ и более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 500 нМ. В одном варианте осуществления изобретения концентрация по меньшей мере приблизительно в один микромоль достигается в крови млекопитающего, такого как человек. Соединения, определяемые в описании, могут быть введены приблизительно от 35 мг/день, 40 мг/день или 50 мг/день (например, приблизительно до 1000 мг/день), или приблизительно от 75 мг/день (например, приблизительно до 1000 мг/день), или приблизительно от 100-150 мг/день (например, приблизительно до 900 мг/день), или приблизительно от 300 мг/день (например, приблизительно до 500 мг/день). Однако могут быть использованы количества больше, чем приведенные выше, так как верхняя граница диапазона количеств является неограничивающим фактором. Количества могут быть измерены, как описано в публикации Adamson, G.E. et al., J. Ag. Food Chem.; 1999; 47(10) 4184-4188.

Введение можно проводить по схеме, т.е. в течение эффективного периода, например, ежедневно, ежемесячно, два раза в месяц, два раза в год, один раз в год или в каком-либо другом режиме, что определяется врачом-терапевтом на тот период, который необходим. Введение может продолжаться по меньшей мере в течение периода, требуемого для усиления исполнительной когнитивной функции(й) и/или для увеличения кровотока в сосудистой сети мозга. Композицию можно вводить ежедневно, предпочтительно, два или три раза в день, например, утром и вечером, для поддержания уровней эффективных соединений в организме млекопитающего. Для получения наиболее благоприятных результатов композицию можно вводить по меньшей мере в течение 7 дней или по меньшей мере в течение 14 дней, или по меньшей мере в течение 30 дней, или по меньшей мере в течение 45 дней, или по меньшей мере в течение 60 дней, или по меньшей мере в течение 90 дней. Указанные режимы введения могут, в случае необходимости, периодически повторяться.

Композиции и препараты

Соединения согласно изобретению могут быть введены в качестве пищи (включая корм для домашних животных), пищевой добавки или биологически активной добавки или фармацевтического препарата.

Здесь под “пищей” подразумевают материал, содержащий белок, углевод и/или жир, который используется в организме для поддержания процессов роста, репарации и жизнедеятельности и для снабжения энергией. Продукты питания также могут содержать дополнительные вещества, например, минералы, витамины и приправы. См., Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10^th Edition, 1993. Термин “пища” включает в себя напиток, приспособленный для потребления человеком или животным. В данном описании термин “пищевая добавка” определятся согласно FDA в 21 C.F.R. 170.3(e)(1), и он включает в себя добавки к пище или в виде отдельных препаратов. Здесь “биологически активная добавка” является продуктом (отличным от табака), предназначенным дополнить рацион, который содержит один или более следующих питательных ингредиентов: витамин, минерал, траву или другое растительное сырье, аминокислоту, питательное вещество для использования человеком, чтобы дополнить рацион питания путем увеличения общего ежедневного потребления, или концентрат, метаболит, составной компонент, экстракт или комбинацию указанных ингредиентов. Термин “фармацевтический препарат” представляет собой лекарственное средство. См. Merriam-Webster's Collegiate Dictionary, 10^th Edition, 1993. Фармацевтический препарат также называют лекарственным средством. Указанные выше композиции могут быть получены известными в данной области способами.

Композиции могут содержать носитель, разбавитель или наполнитель. В зависимости от предназначения, носитель, разбавитель или наполнитель могут быть выбраны так, чтобы они были приемлемы для человека или для ветеринарного использования, для использования в пище, добавке, биологически активной добавке или фармацевтическом препарате. Композиция может необязательно содержать дополнительное средство, усиливающее/улучшающее познавательный процесс. Также в зависимости от использования, специалист в данной области может выбрать степень чистоты соединения согласно изобретению. Например, в случае использования в изготовлении лекарственных форм соединение должно быть настолько чистым, насколько возможно с коммерческой точки зрения, в то время как для приготовления пищи, добавки или биологически активной добавки можно использовать менее чистые соединения или смеси соединений (например, экстракты растений).

Соединение согласно изобретению может быть “выделено и очищено”, т.е. оно может быть отделено от соединений, с которыми встречается в природе (например, в случае соединения природного происхождения), или его можно синтезировать, в любом случае его получают таким образом, чтобы уровень сопутствующих соединений и/или примесей не вносил значительный вклад в эффективность соединения или не уменьшал ее. Например, “выделенный и очищенный В2-димер” отделяют от В5-димера, с которым он может встречаться в природе (например, в бобах какао), до степени очистки, достигаемой доступными коммерчески рентабельными способами очистки и разделения. Такие соединения особенно подходят для фармацевтических применений.

Соединение может быть менее чистым, т.е. “в значительной степени чистым”, т.е. оно может быть в высшей степени однородным, что достигается доступными способами очистки, разделения и/или синтеза, но при этом не требует отделения от подобных соединений. Под “подобными соединениями” подразумевают соединения, имеющие одинаковую степень полимеризации. Например, “в значительной степени чистый димер” относится к смеси димеров (например, В2 и В5, как должно быть во фракции экстракта какао). Хотя и менее подходящие для применения в фармацевтических целях, такие “в значительной степени чистые” соединения могут быть употреблены в пище, пищевых добавках и биологически активных добавках.

В некоторых вариантах осуществления соединение согласно изобретению имеет степень чистоты, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Такие соединения особенно подходят для фармацевтических применений.

Фармацевтические препараты, содержащие соединения согласно изобретению, необязательно в комбинации с другим средством, усиливающим/улучшающим познавательные процессы, могут быть введены перорально. “Пероральное введение” включает в себя введение через рот и подъязычное и трансбуккальное введение. Специалист в данной области сможет определить подходящий способ введения для достижения оптимальной доставки соединений согласно изобретению. Таким образом, лекарственные формы, адаптированные для каждого типа введения через рот, входят в объем, охватываемый изобретением, и включают в себя твердые, жидкие и полутвердые лекарственные формы, такие как таблетки, капсулы, желатиновые капсулы (гелькапы), порошки или гранулы в виде одноразовой дозы или большого объема, эмульсии, суспензии, пасты или желе. Лекарственные формы с пролонгированным действием также включены в объем изобретения. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители или наполнители широко известны в данной области и могут быть легко выбраны специалистом. Таблетка, например, может содержать эффективное количество соединения согласно изобретению и необязательно носитель, такой как сорбит, лактоза, целлюлоза или дикальцийфосфат.

Пищевые продукты, содержащие соединения, представленные в описании, и, необязательно, другое средство, усиливающее/улучшающее процессы познания, могут быть адаптированы для человека или использованы в ветеринарных целях, и включают в себя корма для домашних животных. Пища может быть отличной от кондитерских изделий, например, напиток (например, ароматизированный напиток какао). Кондитерские изделия, такие как шоколад, соответствующий стандарту идентичности (SOI) и не соответствующий SOI шоколад, такой как молочный, сладкий и полусладкий шоколад, включая темный шоколад, шоколад с низким содержанием жира и карамель, которая может быть покрытой шоколадом карамелью, также входят в объем изобретения. Другие примеры включают выпеченные хлебобулочные изделия (например, шоколадное пирожное с орехами, испеченная легкая закуска, печенье, бисквит), приправу, батончик гранолы, жевательную ириску, брикетированный заменитель пищи, пасту, сироп, сухую смесь для напитка, ароматизированный напиток какао или шоколадный напиток, пудинг, рисовый кекс, рисовую смесь, острый соус и тому подобное. Если желательно, пищевыми продуктами могут быть ароматизированный шоколад или какао. Пищевыми продуктами могут быть шоколадные конфеты и карамельные батончики, такие как батончики гранолы, содержащие орехи, например, арахис, грецкие орехи, миндаль и фундук. Пища предназначена доставить эффективное количество соединений, приведенных в данном описании.

Соединения, используемые в настоящем изобретении, могут быть природного происхождения, например, полученными из бобов какао или другого природного источника, известного специалисту в данной области, или синтезированы. Специалист сможет выбрать природные или синтетические полифенолы, основываясь на использовании и/или доступности или стоимости.

Соединения могут быть включены в композицию в виде компонента какао. Например, соединение(я) может быть включено в композицию в виде ингредиента какао, например, тертого шоколада, включенного в шоколад, или может быть добавлено независимо от ингредиентов какао, например, в качестве экстракта, фракции экстракта, выделенного и очищенного отдельного соединения, объединенных фракций экстракта или синтезированного соединения. Экстракцию и очистку можно осуществлять, как описано в патентах США No. 5554645 и 6670390 на имя Romanczyk et al, и патенте США No. 6627232 на имя Hammerstone et al., каждый из которых включен в описание посредством ссылки.

Флаванолы и/или процианидины какао могут быть представлены в композиции согласно изобретению ингредиентами какао, содержащими указанные соединения, или включением шоколада, который может быть молочным, сладким и полусладким и, предпочтительно, темным шоколадом и шоколадом с низким содержанием жира. Ингредиенты какао могут быть получены с использованием традиционных способов обработки какао, но предпочтительно, чтобы их получали способом, описанным в патенте США No. 6015913 на имя Kealey et al. В качестве альтернативы, для повышения уровня полифенолов какао можно использовать тертый шоколад и частицы какао, полученные из бобов какао, имеющих фактор ферментации 275 или меньше. Указанные ингредиенты имеют более высокое содержание полифенолов какао, чем можно получить традиционными способами обработки какао (например, посредством обжаривания бобов и полной ферментации бобов). Шоколад может быть получен обычными способами из ингредиентов, описанных выше, или улучшенным способом для защиты полифенолов какао в производстве шоколада, как описано в Международной заявке No. PCT/US99/05414, опубликованной как WO99/45788, и в ее аналоге - патенте США No. 6194020, существенные части которых включены в данное описание посредством ссылки. Шоколад, полученный по меньшей мере одним из следующих нетрадиционных способов, называют в описании “шоколадом, имеющим неизменное количество полифенолов какао”: (i) получение ингредиентов какао из недоферментированных или неферментированных бобов какао; (ii) сохранение полифенола какао в способе производства ингредиента какао; и (iii) сохранение полифенола какао в способе производства шоколада. Такие нетрадиционные способы могут быть использованы для получения других продуктов, содержащих компонент какао (пищевые продукты, например, напитки, биологически активные добавки), которые должны содержать повышенные уровни флаванолов и/или процианидинов.

Синтетические процианидины также могут быть использованы и получены способами, известными в данной области; они описаны, например, в патентах США No. 6420572; 6156912 и 6864377, существенные части каждого из которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Ежедневное эффективное количество соединения согласно изобретению может быть представлено в одной порции в случае пищи или в одноразовой дозировке в случае фармацевтического препарата или биологически активной добавки. Например, кондитерские изделия (например, шоколад) могут содержать по меньшей мере приблизительно 100 мг/порцию (например, 150-200, 200-400 мг/порцию).

Биологически активная добавка, содержащая соединения согласно изобретению и необязательно другое средство, усиливающее/улучшающее познавательные процессы, может быть получена способами, известными в данной области, и может включать, например, питательное вещество, такое как дикальция фосфат, стеарат магния, кальция нитрат, витамины и минералы.

Также в объем изобретения входит изделие, такое как упакованный продукт, содержащий композицию согласно изобретению (например, пища, биологически активная добавка, фармацевтический препарат), и этикетка, указывающая на наличие или повышенное содержание соединений согласно изобретению, или руководство по применению композиции для усиления исполнительных когнитивных функций и/или повышения кровотока в сосудистой сети мозга. Упакованный продукт может содержать композицию и инструкции для использования с целью усиления исполнительных когнитивных функций и/или повышения кровотока в сосудистой сети мозга. Этикетка и/или инструкции для использования могут быть адресованы любому из способов применения, описанных в данной заявке.

Изобретение также относится к способу производства изделия, включающего в себя любую из композиций, приведенных в описании, к способу упаковки композиции для получения изделия и к инструкции по применению, с указаниями или рекомендациями по применению композиции/изделия для любого из вариантов применения, приведенных в описании. Такие инструкции, указания или рекомендации включают рекламирование.

Изобретение также описано в следующих неограничивающих примерах.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Влияние флаванолов какао на ответ, идентифицируемый с помощью fMRI, на задание по определению познавательной способности здоровой молодежи

Методы

Субъекты

Шестнадцать молодых женщин в возрасте от 18 до 30 лет принимали участие в исследовании со следующими исключающими критериями: отсутствие в анамнезе мигреней, удара, гипертензии, диабета или любого неврологического или сосудистого заболевания и неприменение табачных изделий. Все субъекты имели нормальное зрение и нормальное цветовое зрение, могли читать, были праворукими, и для их родного языка использовался латинский алфавит. Среднее ежедневное потребление кофеина субъектами оценивали, исходя из их ответов на вопросы о рационе питания, и их всех классифицировали как малоупотребляющих кофеин (<120 мг/день). Всех субъектов инструктировали воздерживаться от алкоголя и кофеина или от использования какого бы то ни было лекарственного средства в течение 12 часов до каждого посещения для fMRI. Местная медицинская комиссия по этическим нормам поведения в учебном заведении одобрила указанное исследование, и все субъекты дали письменное информированное согласие до принятия участия в исследовании.

Каждый субъект подвергался двум сеансам fMRI, которые повторялись по меньшей мере с интервалом в 14 дней. Субъектов отбирали наугад для принятия напитка какао с высоким содержанием флаванола (150 мг флаванола/процианидинов на напиток) в течение 5 дней до одного сеанса fMRI и низким содержанием флаванола в напитке какао (13 мг флаванола/процианидинов на напиток) в течение 5 дней до другого сеанса в двойном слепом методе с позиционным уравниванием. Напитки (содержащие высокие концентрации флаванола) обозначены здесь “высоким флаванолом” и “низким флаванолом” (содержащие низкие концентрации флаванола). Субъекты потребляли один напиток в день в заданное время в течение 5 дней до каждого сеанса томографии, с потреблением последнего напитка приблизительно за 1,5 часа до fMRI-томографии.

Постановка опыта

Субъектов предварительно обучали для выполнения двух заданий, числового задания, состоящего из узнавания нечетного-четного числа, и буквенного задания, требующего узнавания согласной-гласной буквы. В буквенном задании субъекты учились отвечать на стимул, обусловленный одной буквой, в зависимости от того, была ли предложенная буква согласной (G, K, M, R) или гласной (A, E, O, U). Субъектов обучали нажимать левую кнопку в ответ на гласную букву и правую кнопку в ответ на согласную букву. В числовом задании субъектов обучали отвечать на однозначные числа, которые были либо нечетными (3, 5, 7, 9), либо четными (2, 4, 6, 8), используя для ответов нажатие левой и правой кнопок.

Как только испытуемые привыкали к правилам выполнения буквенного и числового заданий, их обучали выполнению задания на буквенно-цифровые пары в fMRI-исследовании. Задание на буквенно-цифровые пары состояло из представляемых одновременно букв и цифр на экране компьютера (для fMRI-сканирования использовали проектор и экран). Буквенно-цифровые пары были либо красными, либо синими. Когда буквенно-цифровые пары были представлены в красном цвете, субъектов инструктировали реагировать на букву и отвечать путем нажатия на соответствующую кнопку, как обучали (т.е. применяя правило отнесения к категории гласных или согласных). Если буквенно-цифровая пара была синей, они реагировали на цифру (оценка нечетная-четная) подобным образом.

В указанном исследовании определение задания на 'переключение' представляет собой изменение между двумя сводами правил, один для букв (оценка согласная-гласная) и один для цифр (оценка нечетная-четная). Для создания парадигмы, включающей условия 'переключение' и 'без переключения', буквенно-цифровые пары были сгруппированы в блоки. Блок из пяти буквенно-цифровых пар, все одинакового цвета, представляет собой блок 'без переключения'. Блок из пяти буквенно-цифровых пар, цвет которых переходит от красного к синему (и, таким образом, изменяется конфигурация решения задания), представляет собой блок 'переключение'. Промежуток между каждой буквенно-цифровой парой в блоке составлял 3 секунды, представляя общую продолжительность всего блока в 15 секунд; затем следовало переключение внимания в течение 12 секунд (исходное состояние). Блоки представляли поочередно (т.е. блок 'переключение', блок 'без переключения', блок 'переключение', блок 'без переключения' и т.д.). Представление буквенно-цифровых пар в блоке помогает увеличить цену переключения и, таким образом, также повысить величину ответа fMRI BOLD, в то время как 12-секундный интервал между блоками позволяет BOLD-ответу вернуться к исходному состоянию.

До fMRI-исследования субъектов обучали для приобретения ими достаточной квалификации (частота появления ошибок ниже 5%) в задании путем выполнения пяти блоков испытаний 'переключение' и 'без переключения'. Во время fMRI-исследования выполняли двадцать блоков испытаний 'переключение' и 20 блоков испытаний 'без переключения', в сумме в течение 18 минут.

Сканирование с помощью fMRI

Сконструированный для специальных целей сканер 3,0 Т использовали с катушкой для головы ТЕМ и градиентной катушкой для головы со вкладышем. Т₂ ^*-взвешенные корональные эхо-планарные изображения (EPI) с матрицей размером 128×64, 3 мм плоскостным разрешением и 9 мм толщиной срезов были получены с использованием захвата импульсной последовательности MBEST со временем эхо (ТЕ) 30 мс и 1,9 кГц частотой градиентного переключения. Шестнадцать соседних корональных срезов снимали каждые 3 секунды (TR = 3 с). Во все время исследования субъектов записывали время реакции и частоту появления ошибок. Кроме того, контролировали частоту сердечных сокращений у субъектов. После fMRI-исследования получали EPI-изображения 64 срезов для установления анатомической локализации.

Обработка данных fMRI

Данные fMRI были обработаны с помощью SPM99 (Frieton KJ et al., Neuroimage 1995; 2:166-172)(Statistical Parametric Mapping, Wellcome Department of Imaging Neuroscience, UK). Данные, полученные с помощью сканера, были скорректированы с учетом движения, чтобы соотнести все функциональные срезы с первоначальным объемом набора данных, пространственно упорядоченных до стандартной модели EPI. Было применено восемь миллиметров FWHM (длительность импульса на уровне половины амплитуды) пространственного сглаживания и 128 с отключения фильтра высоких частот.

Общая линейная расчетная модель матрицы была создана с использованием SPM99 (статистических параметрических карт), которые моделировали парадигму. Блоки 'переключение' и 'без переключения' были моделированы как 12 с функциональные блоки. Затем, период действия парадигмы сопоставляли с канонической традиционной гемодинамической функцией ответа и ее временной производной. Были созданы статистические параметрические карты (SPM) состояния 'переключение' и состояния 'без переключения' по сравнению с исходным состоянием. Кроме того, прямое сравнение между двумя состояниями активации (т.е., 'переключение' в сравнении с исходным уровнем и 'без переключения' в сравнении с исходным уровнем) также осуществляли при скорректированном уровне значимости Р < 0,05, с соответственной активацией в сравнении с исходным уровнем ('переключение' по сравнению с исходным уровнем и 'без переключения' по сравнению с исходным уровнем), используемым в качестве шаблона.

Измерения мозгового кровотока (CBF) и анализ

В данном исследовании авторы изобретения оценивали динамику влияния флаванолов на мозговой кровоток у четырех субъектов (от 24 лет до 31 года). Карта мозгового кровотока (CBF) была получена при использовании EPISTAR (Echo-Planar MR Imaging and Signal Targeting with Alternating Radiofrequency) последовательности импульсов артериальной спиновой метки (ASL) на пяти аксиальных срезах в 7 мм. Диффузионное взвешивание (b= 5 мм²/с) применяли для подавления спинов внутри артерии. Импульс в виде гиперболического секанса использовали для введения метки, и маркерные и контрольные полоски имели 9 мм в ширину со временем инверсионной задержки (TI) 1400 мс. Последовательность импульсов EPISTAR была обеспечена со временем повтора (TR) 3 секунды между маркерными и контрольными изображениями, и всего было получено 60 маркерных и контрольных пар. Каждый субъект подвергался CBF-визуализации до и через 2, 4 и 6 часов после потребления напитка какао с высоким содержанием флаванола (450 мг флаванола) или напитка какао с низким содержанием флаванола, в двух разных опытах. В данном исследовании, в отличие от изучения с помощью fMRI, только в одном случае использовали однократную дозу напитков. За каждым измерением CBF следовало получение карты Т₁ для разделения на сегменты разных типов тканей мозга и участков серого вещества мозга. (CBV обычно используют как показатель объема крови).

Информация, касающаяся мозгового кровотока, вначале была разделена на участки, соответствующие областям серого и белого вещества мозга, используя маски, полученные на основании карты Т₁. Затем, карты CBF серого вещества также разделяли на участки, соответствующие участкам, питающимся главными сосудами (Yen Y-F et al., Magn. Reson. Med. 2001:47: 921-928); публикация включена в данное описание посредством ссылки). Средние величины мозгового кровотока затем рассчитывали для областей белого и серого вещества мозга. Величины перфузии целого серого вещества мозга представлены в данном описании.

Результаты

Данные поведения для парадигмы переключения заданий

Наблюдали устойчивые цены задания на переключение во время ответа. Каждый из субъектов больше замедлялся при исполнении числового задания в состоянии 'переключение', чем в состоянии 'без переключения' в обоих случаях: и при буквенном и при числовом заданиях, постоянное переключение от одного правила задания на другое вызывало трудности. Среднее время отклика по всей группе для блоков 'переключение' и 'без переключения' представлено на фигуре 1. Значение цены на переключение составляло р = 5×10^-6 для “низкого флаванола” и р = 1×10^-6 для “высокого флаванола”. Значительных различий в цене на переключение между двумя напитками (р = 0,30) не наблюдали. Средняя цена временных затрат на переключение составляла 224 ± 25 миллисекунд (мс).

Кроме того, исследовали эффекты утомления/обучения при проведении 40 блоков испытаний 'переключение' и 'без переключения' в изучении с помощью fMRI по количеству допущенных ошибок. Анализ времени ответных реакций обнаружил, что значительных эффектов утомления/обучения не наблюдали в течение курса сеансов fMRI (р = 0,74). Также очередность принятия напитка была рандомизирована, и было проведено сравнение времен ответных реакций между первым и вторым сеансами сканирования, которое вновь не обнаружило значительных различий (р = 0,73).

Данные частоты сердечных сокращений для парадигмы переключения заданий

Среднюю частоту сердечных сокращений измеряли для состояний 'переключение' и 'без переключения' для напитков с низким и высоким содержанием флаванола, как представлено в таблице 1. Парные t-тесты осуществляли для определения каких-либо различий в частоте сердечных сокращений между состояниями 'переключение' и 'без переключения'; для обоих напитков отмечали значительное увеличение в частоте сердечных сокращений для состояния 'переключение' по сравнению с состоянием 'без переключения' (“низкий флаванол“: 'переключение' > 'без переключения' р = 0,01; “высокий флаванол”: 'переключение' > 'без переключения' р = 0,0009). Никакого значительного различия в частоте сердечных сокращений между напитками с низким и высоким содержанием флаванола не обнаружили.

Данные fMRI для парадигмы переключения заданий

На фигуре 2а представлена статистическая параметрическая карта для задания на переключение по сравнению с исходным состоянием при корректированной вероятности Р < 0,05. Сравнение состояния 'переключение' и 'без переключения' с исходным состоянием обнаружило активацию в медиальной и латеральной префронтальной коре головного мозга (включая дорсолатеральную префронтальную кору головного мозга (DLPFC)), париетальной коре головного мозга, передней поясной коре головного мозга (АСС) и мозжечке. Состояние 'без переключения' не представлено на фигуре 2а, однако состояние 'без переключения' по сравнению с исходным состоянием демонстрирует зоны, подобные для состояния 'переключение' по сравнению с исходным состоянием.

Ранее было показано, что описанные выше участки мозга связаны с переключением заданий (Lewis PA et al., Curr Opin Neurobiol 2003; 13:250-255; Sohn MH et al, Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 13448-53; Swainson R et al., J Cogn Neurosci 2003; 15:785-99). Кроме того, ряд исследований когнитивной функции посредством нейровизуализации, помимо переключения заданий, обнаружили подобные картины активации. Указанные исследования относятся к кратковременной памяти (Cabeza et al., Neuroimage 2002: 16:317-330; Postle B et al, Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:12959-12964), восстановлению памяти (Thompson-Schill SL et al, Proc Natl Acad Sci USA 1997: 94:14792-14797; Wagner AD et al, Neuroimage 2000; 14:1337-1347) и решению сложных арифметических задач (Anderson JR et al, Psychonom Bull Rev 2003; 10:241-261; Dehaenae S et al, Science 1999; 284:970-974). Все такие задания демонстрируют прочные взаимосвязи между префронтальной и париетальной корой головного мозга (Petrides M et al., J Comp Neurol 1984; 228: 105-116; Schwartz ML et al., J Comp Neurol 1984; 226:403-420), что дает возможность предположить, что эти две области могут играть комплементарные роли в познании на высоком уровне.

На фигуре 2b представлена групповая статистическая карта областей активации, которая демонстрирует в значительной степени увеличенный BOLD-ответ в процессе выполнения задания на 'переключение' относительно задания 'без переключения'. Исходя из данных сравнения, можно увидеть, что указанные области мозга, активированные предпочтительно при условии 'переключение', в значительной степени локализованы в правом полушарии, в дорсалатеральной префронтальной и париетальной коре головного мозга, а также в передней поясной коре головного мозга и мозжечке.

На фигуре 2а представлены области для состояния 'переключение' относительно исходного состояния покоя. Представленные области являются такими участками мозга, которые связаны с выполнением задания на 'переключение', и, таким образом, не являются исключительными относительно переключения заданий, поскольку они могут включать области, связанные с различными аспектами задания, такими как двигательная реакция при нажатии кнопки.

Обращаясь к фигурам 2а-b, на фигуре 2b можно увидеть области, которые являются большими для состояния 'переключение', чем для состояния 'без переключения'. Следовательно, это может быть представлено как (состояние 'переключение' относительно исходного состояния покоя) - (состояние 'без переключения' относительно исходного состояния покоя). Это является важным состоянием, поскольку аспекты задания, которые не представляют важности, такие как двигательная реакция при нажатии кнопки, находятся в обоих состояниях 'переключение' и 'без переключения', и, таким образом, путем вычитания состояния 'без переключения' из состояния 'переключение' указанные области мозга, ассоциированные с двигательной реакцией при нажатии кнопки, удаляются. В состоянии 'переключение' минус 'без переключения' только данные области, которые полностью вовлечены в переключение заданий, являются видимыми.

Полагают, что при переключении заданий передняя поясная кора головного мозга (АСС) регистрирует конфликт в постановке задания (Gehring WJ and Knight RT, Nat Neurosci 2000; 3:516-20), правая фронтальная кора головного мозга играет роль, родственную ингибированию несоответствующих (предшествующих) ответов (Aron et al., Trends Cogn Sci 2004:8:170-7), и активному сохранению информации, которая вновь загружается в кратковременную память (Goldman-Rakic PS, Annu Rev Neurosci 1988; 11:137-156). Правая задняя париетальная кора головного мозга, как было показано, ответственна за пространственное или зрительное внимание (Rushworth MFS et al., J Neurosci 2001; 21: 5262-5271), в то время как мозжечок, как полагают, первоначально активируется со временем неравномерно при задании на переключение, что соответствует его роли как внутренней системы отметок времени (Ivry RB, Curr Opin Neurobiol 1996;6:851-7).

Статистическое сравнение изменения BOLD-сигнала между состояниями “низкий флаванол” и “высокий флаванол” обнаружило, что “высокий флаванол” производил значительно большее изменение BOLD-сигнала для обоих условий активации ('переключение' и 'без переключения') по сравнению с исходными состояниями, а также для сравнения 'переключение' с исходным состоянием с 'без переключения' с исходным состоянием. В таблице 2 показано среднее изменение сигнала в процентах для BOLD-ответа на 'переключение' относительно исходного состояния для выбранных интересующих областей после употребления напитков с “низким” и “высоким” флаванолом.

Данные зависимости мозгового кровотока (CBF) от времени

На фигуре 3 представлена временная зависимость среднего показателя мозгового кровотока через серое вещество после употребления напитков с низким и высоким содержанием флаванола. Из фигуры видно повышение мозгового кровотока в ответ на напиток с высоким содержанием флаванола, с пиком ответа мозгового кровотока, наблюдающимся приблизительно после двух часов после употребления напитка, и CBF, возвращающимся к исходному состоянию приблизительно после шести часов. Следует отметить, что в данном исследовании была дана большая доза флаванолов в отличие от повторной дозы, данной при FMRI-исследовании.

Исследования ASL предварительно были проведены для измерения эффектов гиперкапнии, которая индуцирует расширение кровеносных сосудов мозга и повышения CBF. Такие исследования выявили повышение CBF от 30% до 87% в ответ на выдох после задержки дыхания, что приводит к мгновенному повышению РаСО₂ (Li TQ et al., Neuroimage 1999; 10:562-9; Li TQ et al., Neuroimage 1999; 9:243-9; Kastrup A et al., AJNR Am J Neuroradiol 1999; 20:1233-8). Прямые эффекты вдыхания CO₂ как сосудорасширяющего стимулирующего вещества обнаружили глобальные повышения CBF до 87% (Kastrup A et al., Magn Reson Imaging 2001; 19:13-20). Изменения CBF на 60%, представленные в описании, после двух часов после употребления напитка с высоким содержанием флаванола имеют подобный данным эффектам порядок величин.

Пример 2: Оценка поведенческих эффектов в ответ на полифенолы какао

Методы

Постановка опыта

Изучение проводили согласно двойному слепому, плацебо-контролируемому, уравновешенному перекрестному исследованию, и проверяли когнитивные эффекты мульти-дозы полифенолов в напитке какао. Участниками исследования (N=30; 13 мужчин и 17 женщин, средний возраст 21,93 года, SEM 0,61, диапазон 18-35 лет) были здоровые совершеннолетние молодые люди, которых тестировали в отношении потенциально опасных состояний здоровья и пищевых факторов. Участники исследования посещали лабораторию пять раз. Первый визит был днем тренировки, когда субъектов знакомили с методикой, данный визит также служил для подтверждения того, что все показатели выполнения работы для всей батареи тестов были в пределах нормы. Последующие посещения составили четыре дня исследования, которые проводили с интервалом не менее чем в 3 дня, чтобы максимально нивелировать индивидуальные различия, где субъекты были наугад размещены по схеме латинского квадрата, определяющей порядок обработки.

Участники исследования воздерживались от употребления кофеина и алкоголя в течение минимум 12 часов до первого сеанса тестирования и в продолжение утра вплоть до завершения последнего сеанса тестирования. Испытуемым был предоставлен дневник для записи всей потребляемой пищи и напитка в течение 24 часов до первого сеанса тестирования каждого дня исследования. Участникам было рекомендовано избегать потребления пищи и напитков, которые имеют высокое содержание флаваноидов, в течение 24 часов, предшествующих каждому дню изучения.

Обработки

Испытуемые получали три напитка, содержащие: 1) 36,4 мг полифенолов какао (контроль), 2) 469,3 мг полифенолов какао (среднее содержание полифенолов какао (СР)), 3) 902,2 мг полифенолов какао (высокое содержание СР), в разных случаях. В каждом случае обработка состояла из двух пакетов-саше порошка, смешанного с 200 мл горячей воды. Кроме 33% какао-порошка, напитки также содержали следующие ингредиенты: порошок обезжиренного сухого молока (59,0%); волокно (5,6%); эмульгатор (0,8%); гель целлюлозы (0,55%); ксантановую камедь (0,55%); искусственную и природную ваниль (0,1%) и сукралозу (0,1%). Пять минут отводили для употребления напитка.

Композиция пакета-саше для каждой обработки или для контрольного пакета-саше была следующей:

Для контроля микро/макро-питательных элементов и алкалоидов, каждый раз употребляли два пакета; для напитка с высоким содержанием полифенолов СР, было дано два пакета продукта с высоким содержанием полифенолов СР; для напитка со средним содержанием полифенолов СР, давали один пакет продукта с высоким содержанием полифенолов СР и один пакет контрольного продукта; и для контроля СР, давали два пакета контрольного продукта.

Оценка

Батарея тестов на определение познавательной способности

В настоящем исследовании авторы изобретения осуществляли тестирование посредством “батареи тестов на определение познавательной способности” (“Cognitive Demand Battery”) (CDB). Участники получали три напитка, содержащие (i) 36,4 мг полифенолов какао (контроль), (ii) 469,3 мг полифенолов какао (среднее содержание СР) и (iii) 902,2 мг полифенолов какао (высокое содержание СР). Дни исследования включали батарею тестов CDB, состоящую из серии последовательных вычитаний от заданного числа по три (Serial Threes) (2 мин), серии последовательных вычитаний от заданного числа по семь (Serial Sevens) (2 мин), задания на скорость обработки зрительной информации (Rapid Visual Information Processing task) (RVIP, 5 мин) и зрительной аналоговой шкалы умственных способностей (1 мин). Для предоставления материала в лабораторию был взят на анализ образец слюны для определения уровней кофеина. Каждый день исследования испытуемые выполняли каждое из заданий один раз, чтобы уменьшить эффект практики. Затем вводили суточную дозу напитка, на что отводилось 5 минут, после чего определяли исходное состояние. Время окончания потребления напитка соответствует Т=0. В течение 90 мин напиток усваивался, затем участники подвергались CDB шесть раз в прямой последовательности, с последующим взятием второго образца слюны для определения уровней кофеина. Цель данных заданий (в CDB) состояла в оценке влияния обработки на постоянную познавательную способность. Общая когнитивная нагрузка в сеансе повышается по мере того, как участники завершают три таких испытания повторно в течение приблизительно одного часа.

Серия последовательных вычитаний

Описанные выше задания позволяют оценить взаимосвязь между указанным вмешательством и “умственными способностями”.

Использовали модифицированную компьютеризированную версию теста, состоящего из последовательных вычитаний от заданного числа по семь, (Haskell, C.F. et al., Psychopharmacology, 2005, 179:813-825). Первоначальный вербальный тест, состоящий из серии последовательных вычитаний от заданного числа по семь, был представлен разными формами, включающими, в том числе, часть краткой шкалы оценки психического статуса для деменции. Он был использован для оценки нарушения познавательной способности при гипогликемии, и также был использован для исследования взаимосвязи между повышенными уровнями глюкозы в крови и познавательной способностью (Kennedy D.O. and Scholey, A.B., Psychopharmacology, 2000, 149:63-71; Scholey, A.B., et al., Physiology & Behavior, 2001, 73:585-592).

В ходе исследований были предоставлены компьютеризированные версии серии вычитаний с использованием тестов продолжительностью 2 минуты. Для задания, состоящего из серии последовательных вычитаний по семь, стандартный экран команд предлагал участнику сосчитать в обратном направлении по семь от данного числа, как можно быстрее и точнее, используя цифровую клавиатуру для фиксирования каждого ответа. Участников также устно инструктировали, что если они сделали ошибку, то они должны выполнить вычитание из нового, неправильного, числа. Произвольное исходное число между 800 и 999 было представлено на экране компьютера, которое исчезало путем ввода первого ответа. Каждый трехзначный ответ был введен через цифровую клавиатуру с каждым знаком, представленным на экране звездочкой. Нажатие клавиши ввода сигнализировало о конце каждого ответа и убирало три звездочки с экрана. Задание оценивали по общему числу вычитаний и уровню ошибочных ответов. В случае неправильных ответов, последующие ответы оценивают как положительные, если их корректируют в отношении нового числа.

Задание, состоящее из серии последовательных вычитаний от заданного числа по три, было идентично заданию, состоящему из серии вычитаний по семь, за исключением того, что оно включало серию вычитаний по три.

Задание на скорость обработки зрительной информации

Данное задание было широко использовано для изучения когнитивных эффектов при вмешательстве в психическую деятельность. Испытуемые следили за непрерывной серией чисел для мишеней из трех последовательных нечетных чисел или трех последовательных четных чисел. Числа были представлены при скорости 100 в минуту, и участник отвечал при обнаружении цепочки мишеней путем нажатия клавиши ответа так быстро, как только возможно. Задание было непрерывным и длилось 5 минут, с 8 правильными цепочками мишеней, представленными в каждую минуту. Задание было оценено относительно процента правильно обнаруженных цепочек мишеней, среднего времени реакции для правильных обнаружений и уровня ошибочных ответов.

Субъективные шкалы (зрительная аналоговая шкала умственных способностей)

В конце каждого набора заданий участников просили указать, насколько чувствовали они умственное утомление путем отметки на 100 мм линии с конечными точками, обозначенными “ни в малейшей степени” и в высшей степени.

Результаты

Результаты представлены на фигуре 4(a-d). Результаты свидетельствуют о благотворном влиянии напитка какао, обогащенного флаванолами/процианидинами, на некоторые аспекты эффективности познавательного процесса/познавательных способностей.

Пример 3: Оценка сильных поведенческих эффектов в ответ на полифенолы какао при заданиях, не требующих умственного напряжения

Метод

Данное исследование позволяет выявить влияние полифенолов какао независимо от ситуаций, требующих умственного напряжения, и позволяет оценить, было ли влияние полифенолов какао ограничено только ситуациями, требующими умственной деятельности.

До принятия участия в исследовании, добровольцы подписывали бланк информированного согласия и заполняли анкету о состоянии здоровья. Все участники сообщили, что они здоровы и не принимали лекарственные средства и не подвергались лечению, за исключением противозачаточной таблетки. Заядлые курильщики были исключены из исследования.

Тридцать участников в исследовании были заняты и проинформированы, что целью исследования является изучение воздействия на познавательную способность и настроение напитка какао, содержащего активные компоненты (один из которых может быть кофеином). Испытуемые воздерживались от употребления кофеина и алкоголя в течение минимум 12 часов до первого сеанса тестирования и на протяжении утра вплоть до завершения последнего сеанса тестирования. Был предоставлен дневник, чтобы участники могли записать информацию о потреблении всей пищи и напитков в течение 24 часов до первого сеанса тестирования каждого дня исследования и на протяжении посещений для исследований. Участникам рекомендовали избегать потребления пищи и напитков, в которых отмечается высокое содержание флавоноидов, в течение 24 часов, предшествующих каждому дню исследования. Это требование ограниченной флавоноидами диеты позволяет контролировать резкие изменения уровней флаванола в плазме.

Уровни кофеина в слюне

Образцы слюны получали, используя контейнеры для сбора слюны. Образцы были взяты немедленно после определения исходного состояния с целью подтверждения отсутствия состояния абстиненции в течение ночного периода, и немедленно после каждого сеанса обработки, для подтверждения равномерного усвоения кофеина. Образцы слюны немедленно замораживали при -20°С и в дальнейшем размораживали для проведения анализа, используя систему Emit (Syva, Palo Alto, США). Анализ представляет собой иммунно-ферментный анализ, предназначенный для измерения кофеина как метаболита и основанный на конкуренции за антитело-связывающие участки между кофеином и меченным ферментом лекарственным средством.

Уровни флаванола в плазме

Непосредственно перед оценкой исходного состояния и перед сеансом обработки в течение 90 минут, 2 мл образца венозной крови отбирали для определения уровней флаванола. Данные образцы крови собирали путем венепункции, используя шприц для отбора крови, содержащий ЭДТА. Затем, образцы держали на льду до центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 10 минут при температуре 5⁰С. Пипетку Gilson использовали для измерения 1485 мкл образующейся плазмы в желтой пробирке. Также готовили свежий раствор аскорбиновой кислоты (570 мМ/100,4 мг/мл), который выдерживали на льду и в темноте. Затем, 15 мкл данного раствора добавляли к 1485 мкл плазмы, перемешивали и хранили при -70°С. К сожалению, вследствие технических трудностей анализы данных образцов не удалось выполнить.

Оценка

Батарея тестов для исследования действия лекарственного средства на познавательную способность (CDR)

Система CDR прошла более 500 испытаний лекарственных средств в Европе и Северной Америке (European and North American drug trials), и, как было показано, она оказалась весьма информативной в плане ее чувствительности к улучшению познавательной способности и ее ухудшению в ответ на широкий ряд веществ.

Использовали специальную версию “батареи” тестов, которая, как ранее было обнаружено, чувствительна к улучшению когнитивной функции в результате приема многочисленных пищевых добавок. Выбор контролируемых компьютером заданий системы был осуществлен с параллельными типами тестов, представленных при каждом сеансе тестирования. Презентация была осуществлена на цветных мониторах небольших портативных компьютеров, и, за исключением тестов на воспроизведение написанных слов, все ответы были записаны посредством двухкнопочных (да/нет) блоков ответа.

Полный выбор тестов занял приблизительно 20 минут, и тесты были выполнены в следующем порядке:

Словесная презентация: Пятнадцать слов, подобранных по частоте и конкретности, были представлены в последовательности на мониторе для запоминания участником. Продолжительность стимула составляла 1 секунду, таким же был интервал между стимулами.

Немедленное воспроизведение слов: Участникам оставляли 60 секунд для записывания стольких слов, сколько возможно. Задание оценивали относительно правильного количества ответов и ошибок.

Презентация изображения: Участнику на мониторе было представлено последовательно двадцать фотографических изображений на предмет запоминания при скорости 1 каждые 3 секунды, с продолжительностью стимулов 1 секунда.

Время простой реакции: Участника инструктировали нажать кнопку ответа “да” так быстро, как только возможно, каждый раз слово “да” было представлено на мониторе. Пятьдесят стимулов было представлено с интервалом между стимулами, который различается беспорядочно между 1 и 3,5 секундами. Время реакции записывали в миллисекундах.

Задание на внимательность относительно чисел: Число-мишень было выбрано наугад и постоянно появлялось справа на экране монитора. Серия чисел была представлена в центре экрана при скорости 80 чисел в минуту, и участнику требовалось нажать кнопку “да” так быстро, как только возможно, когда каждый раз число в серии подходило под число-мишень. Задание длилось три минуты, и было 45 стимул-мишень соответствий. Критериями заданий были точность (%), время реакции (мсек) и число сигналов ложной тревоги.

Выбор времени реакции: Либо слово “нет”, либо слово “да” было представлено на мониторе, и испытуемому требовалось нажать соответствующую кнопку так быстро, как только возможно. Было 50 испытаний, из которых слово-стимул было выбрано наугад с равной вероятностью, с беспорядочно изменяющимся интервалом между стимулами между 1 и 3,5 секундами. Записывали время реакции (мсек) и точность (%).

Пространственная кратковременная память: На экране было представлено графическое изображение дома с четырьмя из девяти освещенных окон. Участника инструктировали запомнить положение освещенных окон. В 36 последующих презентациях дома, одно из окон было освещено, и участник решал, присутствует или нет это одно окно из освещенных окон в оригинальной презентации. Участник отвечал путем нажатия кнопки ответа “да” или “нет” так быстро, как только возможно. Среднее время реакции измеряли в мсек, и точность ответов на оригинальный и новый (дистрактор) стимулы записывали в виде процентов.

Кратковременная память на числа: Участнику для запоминания было представлено последовательно пять чисел. За этим следовала серия из 30 пробных чисел, для каждого из которых участник решал, это число было или нет в оригинальной серии, и нажимал кнопку ответа “да” или “нет”, соответственно, так быстро, как только возможно. Эта операция повторялась два последующих раза с разными стимулами и пробными числами. Среднее время реакции измеряли в мсек, и точность ответов как на оригинальный, так и новый (дистрактор) стимулы записывали в виде процентов.

Отсроченное воспроизведение слов: Участнику вновь давали 60 секунд, чтобы записать так много слов, как только возможно.

Отсроченное распознавание слов: Первоначальные слова плюс 15 отвлекающих вариантов слов были представлены одновременно в случайном порядке. Для каждого слова участник показывал, распознает он или нет слово, как включенное в первоначальный перечень слов, путем нажатия кнопки ответа “да” или “нет”, соответственно, так быстро, как только возможно. Среднее время реакции измеряли в мсек, и точность ответов как на первоначальный, так и новый (дистрактор) стимулы записывали в виде процентов.

Отсроченное распознавание изображения: Первоначальные изображения плюс 20 отвлекающих вариантов изображений было представлено одновременно в случайном порядке. Для каждого изображения участники показывали, распознавали они или нет изображение, как представленное в первоначальной серии, путем нажатия кнопки ответа “да” или “нет”, соответственно, так быстро, как только возможно. Среднее время реакции измеряли в мсек, и точность ответов как на оригинальный, так и новый (дистрактор) стимулы записывали в виде процентов.

Следующие таблицы указывают, какую стадию обработки информации каждое задание оценивает:

Зрительные аналоговые шкалы Bond-Lader (Bond A., and Lader M., 1974, The use of analogue scales in rating subjective feelings, British Journal of Psychology, 47:211-218).

Данный критерий был составлен из 16 зрительных аналоговых шкал с конечными точками - антонимами: проворный-вялый, спокойный-возбужденный, сильный-слабый, сбитый с толку-здравомыслящий, хорошо координированный-неповоротливый, апатичный-энергичный, довольный-недовольный, беспокойный-спокойный, медленно-быстро соображающий, напряженный-расслабленный, внимательный-мечтательный, некомпетентный-квалифицированный, веселый-грустный, враждебный-дружелюбный, заинтересованный-скучающий, замкнутый-общительный. Они были объединены с образованием трех факторов “настроения”: 'тревога', 'спокойствие' и 'довольство'.

Задание на психомоторную вигильность (Dinges D.F. and Powell J.W., 1985, Microcomputer analyses of performance on a portable, simple visual RT task during sustained operations. Behavior Research, Methods, Instruments and Computers, 17:652-655).

Задание на психомоторную вигильность (PVT) является простым доступным заданием определения времени реакции, используемым для оценки стабильного внимания. Субъекта инструктировали нажать кнопку большим пальцем доминирующей руки так скоро, как только появляется стимул (LED-цифровой счетчик). В настоящем исследовании, продолжительность единственного испытания PVT составляла 10 мин. Сонливость также была оценена с помощью данного устройства до и после задания на время реакции с использованием шкалы из 10 точек.

Обработки

Участники получали три напитка, содержащие: 1) 36,4 мг полифенолов какао (контроль), 2) 469,3 мг полифенолов какао (среднее содержание СР), 3) 902,2 мг полифенолов какао (высокое содержание СР) в разных опытах. В каждом случае обработка состояла из двух пакетов-саше с порошком, смешанным с 200 мл горячей воды. Контрольная обработка состояла из 2 пакетов-саше контроля СР, 469,3 мг дозы, состоящей из одного контрольного пакета-саше плюс один пакет-саше с высоким содержанием СР, и 902,2 мг дозы, состоящей из 2 пакетов-саше с высоким содержанием СР. Данные для 2 пакетов-саше можно найти в таблицах 3-5 примера 2. Отводилось пять минут для употребления напитка.

Каждому участнику требовалось посещать всего четыре дня исследований, которые проводились с интервалом не менее чем в 3 дня, чтобы максимально нивелировать индивидуальные различия. Тестирование проводили в комплексе лабораторий с участниками, визуально изолированными друг от друга. При прибытии на их первый сеанс в первый день испытуемых наугад размещали по режиму обработки, используя модель латинского квадрата, которая уравновешивала порядок обработок через все три активных дня исследования. Первый день включал выполнение батареи тестов четыре раза. Эта операция была предпринята для того, чтобы контролировать практические эффекты и позволить ознакомиться с батареей тестов и методологией при последующих посещениях. Данные дня тренировки не были включены в какие-либо анализы.

Каждый из трех активных дней исследования включал четыре идентичные сеансы тестирования. Первый сеанс был сеансом тестирования до принятия дозы, который позволял установить исходные характеристики для данного дня. За этим непосредственно следовала дневная обработка путем приема напитка. Следующие сеансы тестирования начинались после 90 минут, 3 часов и 6 часов после потребления дозы дневной обработки. Каждый сеанс тестирования продолжался приблизительно 30 минут и включал выполнение батареи тестов CDR, зрительные аналоговые шкалы настроения Bond-Lader, PVT в течение 10 минут и получение образца слюны с использованием контейнера для сбора слюны. Кроме того, сеанс до получения дозы и сеанс в 90 минут после получения дозы также включал взятие 2 мл образца венозной плазмы до выполнения батареи CDR.

Уровни кофеина в слюне анализировали для оценки наличия абстиненции к кофеину.

Перед первичным статистическим анализом проводили отдельные, односторонние, повторные определения ANOVAS исходных данных до получения дозы для выявления какого-либо случая различий в характеристиках исходного состояния до обработок.

Показатели по результатам индивидуальных заданий анализировали как 'изменение исходных данных', используя SPSS 12.0.1.

Данные каждого определения анализировали путем двухсторонних повторных измерений ANOVA [время (1,5, 3 и 6 часов после дозы) Х обработка (469, 3 мг СР/902,2 мг СР/контроль)].

Результаты

Средние значения исходных данных до получения дозы и изменение исходных показателей каждого измерения для каждого состояния определяли вместе с F-величинами и вероятностями эффектов обработки.

До анализа изменения исходных данных, средние необработанные показатели до получения дозы для всех трех состояний (контроль, 469,3 мг СР, 902,2 мг СР) для каждого результата измерения подвергали односторонним повторным измерениям ANOVA. Авторы изобретения не наблюдали значительных различий исходных данных для любого измерения.

Результаты анализа слюны подтвердили отсутствие абстиненции к кофеину со средними исходными величинами уровня кофеина 0,79 мкг/мл (уровни точно ниже 1 мкг/мл были сообщены для ночного отказа от потребления кофеина - Evans and Griffith, 1999, Caffeine withdrawal: a parametric analysis of caffeine dosing conditions. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 289:285-294). Исследование уровней кофеина в слюне после обработки не выявило значительных различий между условиями обработок.

Показатели после обработки

Значительных различий после обработки для любого измерения не обнаружено.

Задания, входящие в батарею тестов CDR, отличаются простотой и быстротой выполнения наряду с широким спектром возможностей для анализа. Результаты исследования не демонстрируют эффект соединений согласно изобретению в течение выполнения заданий, не требующих умственной деятельности.