×
16.06.2018
218.016.62d2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДЕКСА ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ У ЖИВОТНЫХ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей. Осуществляют подготовку мазка спермопробы к окрашиванию и приготовление красителя смешиванием раствора лимонной кислоты, гидрофосфата натрия и 1%-го акридин оранжевого. Погружают образец в краситель. Выполняют микроскопию. Подсчитывают сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных. Изобретение обеспечивает простой, доступный способ определения индекса фрагментации ДНК.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов в замороженной сперме животных-производителей.

Данный метод является технологически современным анализом маркеров апоптоза и играет важную роль в регуляции фертильности, которую нужно учитывать как при естественном осеменении, так и при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двухцепочечными и одноцепочечными разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков-протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирование бластоцисты в предимплантационный период эмбрионального развития (т.е. до нидации зародыша к стенке матки).

Заявленный способ позволяет определить степень повреждения нитей ДНК (измерения количества разрывов ДНК) в сперматозоидах.

Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Окрашивание сперматозоидов осуществляют акридиновым оранжевым.

Уровень техники, аналоги. Существует аналогичный метод в медицине, описанный в руководстве ВОЗ «Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека» пятое издание 2012 г., с. 164, но в ветеринарной медицине аналогов нет. Особенность заявленного изобретения заключается в том, что способ позволяет определить индекс фрагментации ДНК у животных-производителей.

В настоящее время стандартным методом для исследования фрагментации ДНК в сперматозоидах является определение структуры хроматина по Эвенсону (SCSA: Sperm Chromatin Staicture Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson and Jost, 1994). Исследование структуры хроматина проводят с помощью окрашивания ДНК флюрохромами. Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, т.е. ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде. Данный метод выбран нами в качестве ближайшего аналога.

Метод SCSA, хотя и является надежным и высоко воспроизводимым, является дорогим методом, трудным для выполнения и не очень подходящим для рутинных лабораторных исследований (De Jonge, 2002). По этой причине качество ДНК сперматозоидов до сих пор широко не определяется, несмотря на то, что подтверждено его клиническое значение при изучении бесплодия.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность определения индекса фрагментации ДНК, простота, доступная стоимость, минимальные манипуляции с клетками.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что спермопробу размораживают, подготавливают мазок к исследованию, фиксируют мазок спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°С. Приготавливают краситель смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-ного акридин оранжевого. Образцы погружают в краситель на 5-7 мин, далее мазок подсушивают на воздухе в течение 1-2 мин, микроскопируют. Проводят отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет. Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле , где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.

Заявленный способ основан на метахроматических свойствах красителя, который изменяет флюоресценцию от зеленого до красного. Он заключается в окрашивании клеток ДНК флюрохромом, после - индуцированной слабой кислотой. Клетки флюоресцируют зеленым при связывании красителя с нормальной двунитевой молекулы ДНК и красным при взаимодействии с однонитевыми ДНК и РНК. При индексе фрагментации ДНК более 30% сперматозоидов уровень фертильности семени значительно снижается.

Осуществление изобретения.

Проводят размораживание спермопробы, подготавливают мазок спермопробы к исследованию.

Капля спермы должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1-1,5 см до его края. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. Фиксацию мазка производят спиртовым раствором уксусной кислоты (1 часть уксусной кислоты ледяной и 3 части 96%-ного этилового спирта) в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре +5°C.

Приготовление красителя.

В мерной колбе вместимостью 100 см3 смешивают 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого.

Срок хранения раствора в темном месте при комнатной температуре - не более 5 дней.

Проведение анализа.

Погружаем образец в краситель на 5-7 мин. Споласкиваем дистиллированной водой 2-3 мин. Мазок подсушиваем на воздухе в течение 1-2 мин. Затем микроскопируем с использованием УФ-фильтра со спектром длины волны 530 нм при увеличении 300×, 600×. Необходимо исследовать 100 сперматозоидов, посчитывая отдельно сперматозоиды с фрагментированной ДНК и нормальные, подсчет проводится визуально. Сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет.

Проводим учет результатов.

Количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IFn, % вычисляют по формуле

,

где С+ - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт;

С- - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт.

За окончательный результат, округленный до третьего десятичного знака, принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1. Допускаемые расхождения между результатами определений не должны превышать 10%.

При выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.

Источники информации

1. ГОСТ 32277-2013 Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов.

2. Иолчиев Б.С, Багиров В.А, Кленовицкий П.М., Кононов В.П., Таджиева А.В. Индекс фрагментации ДНК хроматина сперматозоидов при оценке качества семени у быков-производителей. Сельскохозяйственная биология №4, 2012 г.

3. С.А. Руднева, Е.Е. Брагина, Е.А. Арифулин, Т.М. Сорокина, Л.В. Шилейко, С.А. Ермолева, Л.Ф. Курило, В.Б. Черных. Фрагментация ДНК в сперматозоидах и ее взаимосвязь с нарушением сперматогенеза. 2014 г.

Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей, включающий размораживание спермопробы, подготовку мазка спермопробы к исследованию, фиксацию мазка спиртовым раствором уксусной кислоты в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре, приготовление красителя смешиванием 40 мл раствора лимонной кислоты, 2,5 мл раствора гидрофосфата натрия и 10 мл 1%-го акридин оранжевого, погружение образца в краситель, микроскопию, отдельный подсчет сперматозоидов с фрагментированной ДНК и нормальных, при этом сперматозоиды с фрагментированной ДНК окрашиваются в красный, желтый или оранжевый цвета, нормальные - в зеленый цвет, количество сперматозоидов с фрагментированными участками ДНК IF, % вычисляют по формуле , где С - количество сперматозоидов, окрашенных в красный, желтый и оранжевые цвета, шт; С - количество сперматозоидов, окрашенных в зеленый цвет, шт., при этом за окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов не менее чем трех измерений, при выявлении индекса фрагментации более 30% спермопроба выбраковывается и не допускается для искусственного осеменения животных.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДЕКСА ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК СПЕРМАТОЗОИДОВ У ЖИВОТНЫХ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 58.
20.11.2015
№216.013.90c9

Способ стимуляции эритропоэза у эмбрионов кур в процессе инкубации яиц

Изобретение относится к птицеводству. Для стимуляции эритропоэза у эмбрионов кур в процессе инкубации яиц путем профилактики стрессовых воздействий, восполнения дефицита микроэлементов и аминокислот, повышения интенсивности вывода при высокой жизнеспособности молодняка в течение длительного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002568681
Дата охранного документа: 20.11.2015
20.01.2016
№216.013.a2c7

Способ стимуляции роста и развития эмбрионов яичных кур путем йодированного трансовариального питания

Изобретение относится к птицеводству, в частности к способу стимуляции роста и развития эмбрионов яичных кур путем йодированного трансовариального питания. Способ включает однократную обработку инкубационных яиц за 3-4 часа до инкубации 0,001 % раствором “Кламина”, при этом раствор наносят на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002573313
Дата охранного документа: 20.01.2016
10.02.2016
№216.014.c435

Способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия. Способ включает воздействие на образцы крови объемом от 1 мл до 1,5 мл, помещенные в кювету, непрерывной бегущей ультразвуковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002574881
Дата охранного документа: 10.02.2016
20.04.2016
№216.015.3758

Способ трансовариального питания эмбрионов яичных кур на стадии инкубации яиц препаратом "селен-актив"

Изобретение относится к сфере сельского хозяйства, в частности к птицеводству. Обработку яиц осуществляют путем орошения скорлупы из пульверизатора водным раствором препарата «Селен-актив» в концентрации 0,1%. Осуществление изобретения обеспечивает стимулирование роста и развитие зародышей,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002581198
Дата охранного документа: 20.04.2016
13.01.2017
№217.015.7b9c

Способ биоиндикации состояния двухстворчатых моллюсков в условиях техногенного загрязнения среды обитания

Изобретение относится к экотоксикологии, а именно к исследованию особенностей развития оксидативного стресса у двухстворчатых моллюсков, и может быть использовано для выявления влияния техногенного загрязнения среды на состояние популяций речных и морских моллюсков. Для этого пробы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600445
Дата охранного документа: 20.10.2016
13.01.2017
№217.015.7d23

Способ определения жира и белка в молоке по результатам динамического поверхностного натяжения

Изобретение относится к области молочной промышленности и касается способа определения содержания жира и белка в молоке, характеризующегося тем, что у пробы молока измеряют динамическое поверхностное натяжение на тензиометре, работающем по принципу максимального давления в пузырьке, по...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002600820
Дата охранного документа: 27.10.2016
25.08.2017
№217.015.a96c

Среда для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к репродукции животных. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС - 6,06 г, лимонную кислоту - 3,4 г, фруктозу - 2,5 г, глицерин - 16 мл, альбумин человека 10% - 40 мл, воду для инъекций - 184 мл. При разбавлении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611827
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.a9b4

Состав среды для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, в частности к составу среды для разбавления и хранения спермы кобелей. Среда содержит ТРИС - 6.06 г, лимонную кислоту - 3.4 г, фруктозу - 2.5 г, глицерин - 16 мл, альбумин человека 10% - 40 мл, сыворотку крови собаки 0,1-0,2 мкг, энроген - 25 мг,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611822
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.aa56

Среда для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к репродукции животных. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС - 2,4 г, лимонную кислоту - 1,3 г, фруктозу - 1,0 г, альбумин человека 10% - 20 мл, воду для инъекций - 72,2 мл. При разбавлении свежеполученной спермы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611828
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.aabf

Состав среды для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится ветеринарии и биологии. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС, лимонную кислоту, фруктозу, альбумин человека, воду для инъекций, сыворотку крови собаки, энроген. Изобретение позволяет сохранить жизнеспособными половые гаметы кобелей на протяжении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611826
Дата охранного документа: 01.03.2017
Показаны записи 1-10 из 11.
10.04.2015
№216.013.39ac

Способ получения белкового гидролизата из мясного или мясокостного сырья тушек норок для парентерального питания

Изобретение относится к области ветеринарии, биотехнологии. Отбирают и измельчают мясное или мясокостное сырье из тушек норок. Гомогенизируют сырье с водой в соотношении 1,0:0,5, обезжиривают и термообрабатывают. Осуществляют ферментативный гидролиз поджелудочной железой свиньи в количестве...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002546252
Дата охранного документа: 10.04.2015
10.05.2016
№216.015.3d64

Состав жидкости для изучения и демонстрации артериального русла животных

Изобретение относится к ветеринарии и биологии. Состав жидкости для изучения и демонстрации артериального русла животных включает смесь желатина пищевого, зубного порошка, акриловой краски для окрашивания массы до желаемого оттенка, сернокислого бария и воды дистиллированной (t 80°С)....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002583074
Дата охранного документа: 10.05.2016
13.01.2017
№217.015.682e

Способ повышения репродуктивных функций пушных зверей и жизнеспособности их приплода

Изобретение относится к звероводству и может быть использовано, в частности, для повышения продуктивности пушных зверей. В качестве биологически активной кормовой добавки используют белковый гидролизат из мышечной ткани норок или соболей, который вводят животным в течение 30 дней до начала...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002591521
Дата охранного документа: 20.07.2016
25.08.2017
№217.015.a96c

Среда для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к репродукции животных. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС - 6,06 г, лимонную кислоту - 3,4 г, фруктозу - 2,5 г, глицерин - 16 мл, альбумин человека 10% - 40 мл, воду для инъекций - 184 мл. При разбавлении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611827
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.a9b4

Состав среды для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, в частности к составу среды для разбавления и хранения спермы кобелей. Среда содержит ТРИС - 6.06 г, лимонную кислоту - 3.4 г, фруктозу - 2.5 г, глицерин - 16 мл, альбумин человека 10% - 40 мл, сыворотку крови собаки 0,1-0,2 мкг, энроген - 25 мг,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611822
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.aa56

Среда для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к репродукции животных. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС - 2,4 г, лимонную кислоту - 1,3 г, фруктозу - 1,0 г, альбумин человека 10% - 20 мл, воду для инъекций - 72,2 мл. При разбавлении свежеполученной спермы...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611828
Дата охранного документа: 01.03.2017
25.08.2017
№217.015.aabf

Состав среды для разбавления и хранения спермы кобелей

Изобретение относится ветеринарии и биологии. Среда для разбавления и хранения спермы кобелей содержит ТРИС, лимонную кислоту, фруктозу, альбумин человека, воду для инъекций, сыворотку крови собаки, энроген. Изобретение позволяет сохранить жизнеспособными половые гаметы кобелей на протяжении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002611826
Дата охранного документа: 01.03.2017
13.02.2018
№218.016.1f14

Способ прогнозирования вывиха коленной чашки у собак

Изобретение относится к ветеринарии, диагностике патологий коленного сустава у собак. Прогнозирование вывиха коленной чашки у собак проводят путем анализа компьютерных томограмм коленного сустава. Вычисляют парапателлярно-чашечный коэффициент – отношение площади парапателлярного хряща к площади...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641157
Дата охранного документа: 16.01.2018
17.08.2018
№218.016.7cc9

Способ прогнозирования вывиха височно-нижнечелюстного сустава у собак

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ортопедии и травматологии, и может быть использовано для прогнозирования вывиха височно-нижнечелюстного сустава у собак. Проводят рентгенографическое исследование костей черепа в боковой проекции в положении центральной окклюзии. На полученной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002663936
Дата охранного документа: 13.08.2018
21.05.2023
№223.018.6953

Способ проведения мандибулярной анестезии у собак

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к стоматологии мелких домашних животных. Способ проведения мандибулярной анестезии у собак заключается во введении раствора анестетика в подбородочное отверстие в аборальном направлении и нижнечелюстное отверстие с язычной стороны в аборальном...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002794430
Дата охранного документа: 18.04.2023
+ добавить свой РИД