Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ РАННЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РИСКА РАЗВИТИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и позволяет прогнозировать риск развития СД 2 типа.

В современной медицине проблема абдоминального ожирения является одной из наиболее приоритетных и социально значимых. Абдоминальное ожирение (АО) и сахарный диабет 2 типа (СД 2 типа) занимают лидирующие позиции среди причин смертности населения [1]. Известно, что отягощенная наследственность является основным фактором риска развития СД 2 типа [2]. Выявление пациентов с предрасположенностью к АО и СД 2 типа имеет большую клиническую значимость, поскольку это заболевание может быть обратимым, а при ранней диагностике и лечении можно снизить выраженность основных его проявлений.

На продукцию инсулина, помимо постпрандиальной стимуляции глюкозой, влияют гормоны желудочно-кишечного тракта - инкретины [3]. Глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) секретируется в ответ на пероральное поступление жиров и углеводов [4]. Одна из основных функций инкретинов - стимуляция секреции инсулина Р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы [5]. Согласно данным научной периодики у пациентов с СД 2 типа снижается чувствительность клеток к инсулину и нарушается его секреция в ответ на стимуляцию питательными веществами [6]. Так, доклинические исследования показали, что снижение ответа на инкретиновую терапию может быть связано с пониженной экспрессией или дефектами их рецепторов [7].

Лучшее понимание функционирования инкретинов открывает возможности индивидуально подобранной терапии и профилактики ожирения, ассоциированного с СД 2 типа и его осложнений.

Из уровня техники известен ряд способов определения риска развития СД 2 типа «Способ лабораторной диагностики гипертонической болезни и сахарного диабета» (RU 2007116611 А), основанный на исследовании состава и структурных свойств ротовой жидкости.

Принципиально похожим изобретением является «Способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у больных» (патент RU 2264170 С2, 7 А61В 10/00, G01N 33/92 (2005.11.20)), согласно которому рассчитывается коэффициент метаболической дислипидемии по формуле (ТГ+ХС-ЛПНП)/ХС_ЛПВП и антропометрический коэффициент - ИМТ/ОТ/ОБ и при ИМТ менее 37,9 кг/м² и коэффициенте дислипидемии более 9,2 у.е. прогнозируется наибольший риск развития заболевания. Недостатком данного решения является недостаточный учет многих информативных показателей при прогнозировании, в том числе генетических особенностей.

Схожим изобретением является «Способ прогнозирования риска развития метаболического синдрома (МС) у пациента с абдоминальным ожирением» (патент Россия RU 2010149541 А, МПК G01N 33/50 (2006.01)), основанный на выделении ДНК с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа для идентификации полиморфизма T-45G гена адипонектина. Недостатками данного способа является длительное выполнение этапов исследования, в отличие от способа детекции ПЦР в режиме реального времени, а также диагностика целого кластера метаболических нарушений, подразумевающих МС, а не его компонентов.

Аналогом заявляемому является «Способ прогнозирования эффективности терапии пероральным сахароснижающим препаратом метформином у больных сахарным диабетом 2 типа» (патент RU 2602663), который выявляет полиморфизм А>С rs622342 гена ОСТ1. Способ подразумевает диагностику эффективности приема метформина для терапии СД 2 типа. Недостатком данной методики является использование только одного полиморфного варианта гена, и она не учитывает комплексное влияние других генетических особенностей показателей: отягощенная наследственность, биохимические показатели крови.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является ранняя диагностика риска развития СД 2 типа методом ПЦР.

Поставленная задача решается за счет того, что способ ранней генетической диагностики риска развития сахарного диабета 2 (СД) типа, включающий экстракцию ДНК из периферической крови с последующим проведением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, характеризуется тем, что проводят анализ полиморфизма гена рецептора к инкретинам GLP-1R и прогнозируют пониженный риск развития СД 2 типа в результате выявления генотипа GG полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R.

Детекция однонуклеотидных полиморфизмов может быть осуществлена методом ПЦР в режиме реального времени.

Способ осуществляется следующим образом.

Геномную ДНК выделяют из цельной крови пациента при помощи набора «ДНК-Экстран-1», согласно протоколу производителя (ЗАО «Синтол»), либо другим известным методом. Генотипирование проводят методом ПЦР в режиме реального времени с использованием праймеров, фланкирующих полиморфизм, и конкурирующих TaqMan-зондов. На 3'-конце зонда находится флуоресцентная метка - флуорофор (FAM, HEX), а на 5'-конце «гаситель» флуоресценции (RTQ1; BHQ-1). При близком расположении «гасителя» и флуорофора энергия, которая поглощена флуорофором, по принципу флуоресцентно-резонансного переноса переходит на «гаситель». Вследствие этого сигнал флуоресценции отсутствует. В процессе ПЦР при повышении температуры до 95°С происходит плавление ДНК и праймерами с зондами, отжигаются на комплементарном участке ДНК при 63°С. В процессе амплификации ДНК-полимераза расщепляет зонд, при этом расстояние между «гасителем» и флуорофором увеличивается, как и флуоресценция. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флюорофора. Зонд с меткой FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем НЕХ-аллелю А для полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R. Анализ полиморфизмов производят с использованием наборов для определения полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R (ЗАО «Синтол»). В эппендорф/лунку объемом 0,2 мкл вносят 20 мкл смеси, включающей 10 мкл реакционной смеси, 10 мкл разбавителя, и 0,5 мкл (2,5 Ед) Taq-полимеразы, и 5 мкл ДНК образца. Емкость помещают в блок амплификатора LightCycler 480 Instrument II ("Roche", Швейцария) в котором проводят считывание результатов ПЦР. Протокол ПЦР состоит из следующих этапов: нагрев реакционной смеси при 95°С - 3 мин и амплификация в течение 40 циклов в следующем режиме: 95°С - 15 сек, 63°С - 40 сек.

Таким образом, образец считается положительным на наличие полиморфного аллеля G rs6923761 гена GLP-1R, если выявлено увеличение флуоресценции по каналу HEX (зонда, специфичного для аллеля А).

- Если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналу FAM, то генотип гомозиготен по аллелю G (GG), при этом регистрируют генотип GG в участке rs6923761 гена GLP-1R.

- Если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналам FAM и HEX, генотип гетерозиготен (GA), при этом регистрируют генотип GA в участке rs6923761 гена GLP-1R.

- Если в результате ПЦР зарегистрирована флуоресценция по каналу HEX, то генотип гомозиготен по аллелю А (АА), при этом регистрируют генотип АА в участке rs6923761 гена GLP-1R.

Оборудование: амплификатор LightCycler 480 Instrument II ("Roche", Швейцария) со стандартным программным обеспечением, дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл (Biohit, Финляндия); эппендорфы на 0,2 мл, 1,5 мл. Реактивы: набор для выделения ДНК «ДНК-Экстран-1»; набор реагентов для определения однонуклеотидного полиморфизма rs6923761 G/A гена GLP-1R, состоящий из реагентов: 2,5х Разбавитель, 2,5× Реакционная смесь, Taq ДНК-полимераза, отрицательный контроль и положительный контроль для генотипов G/G, G/A А/А. Реактивы хранят при температуре -20°С.

В исследование было включено 87 пациентов в возрасте от 32 до 58 лет с метаболическим синдромом (ИМТ от 30 до 48,8 кг/м²) и СД 2 типа, диагноз которого был установлен согласно критериям Международной федерации диабета (Alberti K.G., et al., 2005). Контрольную группу составили 109 здоровых донора в возрасте от 29 до 51 года с нормальными антропометрическими и биохимическими показателями. Набор пациентов в группы исследования проводился на базе областной клинической больницы г. Калининграда. Данные группы были сопоставимы по возрастным и тендерным характеристикам. Все лица, принимавшие участие в эксперименте, относились к славянской популяции, со всеми было подписано информированное согласие. Получено разрешение на проведение исследования в локальном этическом комитете (протокол №4 заседания Локального этического комитета Инновационного парка БФУ им. И. Канта от 23 октября 2013 года).

Материалом для исследования служила венозная кровь, из которой были выделены образцы геномной ДНК с использованием коммерческих наборов «ДНК-Экстран-1» согласно протоколу производителя (ЗАО «Синтол»). Генотипирование проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием амплификатора LightCycler 480 Instrument II ("Roche", Швейцария) и наборов для определения полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R с праймерами GLP1R_Forw (CGCACTCTCCTTCTCT) GLP1R Rev (GTTGGGCTGCTTCATTCCTC) и зондами GLP1R_Wt (FAM-CCTCGGCTTCAGGTAAGGT-RTQ1) и GLP1R M (R6G-GATCCTCCTCAGCTTCA-BHQ2) (ЗАО «Синтол»).

Для оценки инсулинорезистентности рассчитывали индекс HOMA-IR по формуле: HOMA-IR = (Инс × Гл)/22,5, где Инс - инсулин (мкЕД/мл); Гл - глюкоза сыворотки натощак (ммоль/л). Сывороточные уровни инсулина определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом анализаторе Lazurite при помощи тест-систем DRG® Insulin ELISA (EIA-2935). Биохимические показатели исследовались на автоматическом биохимическом анализаторе Furuno СА-180 («Furuno Electric Company», Япония) с применением тест-систем DiaSys («DiaSys Diagnostic Systems», Германия).

Статистическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью программы Statistica 10. Проверку на соответствие распределению частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга, а также сравнение частот аллелей и генотипов в выборках проводили с применением критерия χ2, принимая уровень статистической значимости за 95% (р<0,05). Об ассоциации аллелей или генотипов (частоты которых в группах обследуемых достоверно отличались) с риском развития СД 2 типа судили по величине отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95%С1). Значения OR рассчитывали с помощью программы «Калькулятор для расчета отношения шансов» (http://gen-exp.ru/calculator_or.php). Ассоциация с высоким риском определялась, если значение OR было больше (>) 1, соответственно, при величине OR меньше (<1) аллель или генотип был ассоциирован с пониженным риском развития СД 2 типа.

В группе с СД 2 типа уровень глюкозы натощак составил 7,80 (6,64-10,39) ммоль/л, уровень инсулина 39,15 (25,41-56,01) мкЕД/мл, HbA1c=7,94±2,1%, индекс HOMA-IR=12,4(9,7-23,5) усл. ед. В контрольной группе уровень глюкозы натощак составил 5,23 (4,90-5,45) ммоль/л, инсулина 18,63 (10,93-20,70) мкЕД/мл, HbA1c=5,6±0,7%, HOMA-IR=1,17 (0,79-1,65) усл. ед.

При сравнении всех пациентов с СД 2 типа (87 человек) с группой здоровых доноров (109 человек) была установлена взаимосвязь полиморфизма rs6923761 гена GLP-1 с риском развития СД 2 типа.

В группе пациентов, страдающих СД 2 типа, были получены следующие частоты аллелей полиморфизма rs6923761 гена GLP-1 G - 62,7% А - 37,3% и генотипов: GG - 44,8%, GA - 35,8%, АА - 19,4%, что соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (χ2=3,68, р=0,06). У группы здоровых доноров распределение частот аллелей оказалось G - 73,9% А - 26,1% и генотипов составило: GG - 55,4%, GA - 37,0%, АА - 7,6%, что соответствовало равновесию Харди-Вайнберга (χ2=0,16, р=0,69).

В ходе анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R выявлено, что в группе пациентов с СД 2 типа чаще, чем в контрольной встречается аллель А. Установлена ассоциация аллеля A (OR=1,69, 95% CI: 1,04-2,73, р=0,03) и генотипа АА (OR=2,92, 95% CI: 1,10-7,79, р=0,026) полиморфизма rs6923761 гена GLP-1 с повышенным риском развития СД 2 типа.

Носители генотипа GG в группе пациентов с АО без СД 2 типа встречались чаще, чем в группе с СД 2 типа. При сравнении пациентов с и без СД 2 типа был установлен пониженный риск развития СД 2 типа при наличии генотипа GG (OR=0,52, 95% CI: 0,27-0,99, р=0,046) SNP rs6923761 гена GLP-1R, тогда как с генотипом АА связан повышенный риск (OR=2,75, 95% CI: 1,03-7,34, р=0,027) развития СД 2 типа.

Таким образом, приведенные результаты исследования подтверждают то, что определение полиморфизма rs6923761 в гене GLP-1R позволяет прогнозировать риск развития СД 2 типа.

При этом было обнаружено, что наличие аллеля А и генотипа АА полиморфизма rs6923761 гена GLP-1 ассоциировано с повышенным риском развития СД 2 типа (в два раза) (OR=1,69; OR=2,92; OR=2,75), а генотипа GG - с пониженным (в два раза) (OR=0,52).

Сущность изобретения заключается в определении полиморфизма гена рецептора к инкретинам GLP-1R и прогнозе пониженного риска развития СД 2 типа в случае выявления генотипа GG полиморфизма rs6923761 гена GLP-1R.

Способ прост в осуществлении, в его основе лежит ПЦР анализ полиморфизмов генов рецепторов к инкретинам с последующим расчетом отношения шансов развития СД 2 типа, что позволяет разрабатывать тактику лечения СД 2 типа с учетом индивидуальных (генетических) особенностей пациента.

Список использованной литературы

1. World Health Organization - database [electronic resource]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/ru. (cited 08.05.2016).

2. Polychronakos C., Alriyami M. Diabetes in the post-GWAS era // Nat Genet. - 2015. - Vol. 47, №12. - P. 1373-4.

3. Shestakova E.A., Il'in A.V., Shestakova M.V, Dedov I.I. Secretion of incretin hormones in people having risk factors for type 2 diabetes mellitus // Ter Arkh. - 2014. - Vol. 86, №10. - P. 10-4.

4. Baggio L.L., Drucker D.J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP // Gastroenterology. - 2007. - Vol. 132, №6. - P. 2131-57.

5. Campbell J.E., Ussher J.R., Mulvihill E.E., Kolic J., Baggio L.L., Cao X., Liu Y., Lamont B.J., Morii Т., Streutker C.J., Tamarina N., Philipson L.H., Wrana J.L., MacDonald P.E., Drucker D.J. TCF1 links GIPR signaling to the control of beta cell function and survival // Nat Med. - 2016. - Vol. 22, №1. - P. - 84-90.

6. Nielsen S.T., Janum S., Krogh-Madsen R., Solomon T.P., K. The incretin effect in critically ill patients: a case-control study // Crit Care. - 2015. - Vol. 16, №19. - P. 402.

7. Yabe D, Seino Y. Incretin actions beyond the pancreas: lessons from knockout mice // Curr Opin Pharmacol. - 2013. - Vol. 13, №6. - P. 946 - 53.