Модификации структуры направляющей нуклеазу SpCas9 молекулы РНК для обеспечения импорта в митохондрии клеток человека

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с РНК-направляемой нуклеазой SpCas9, быть использовано для элиминирования определенных гаплотипов митохондриальной ДНК (мтДНК).

Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент Канады № CA 2678572 2008 г. A61K 48/00 D2, C12N 15/864 A, C12N 15/90 B4). В основе данной технологии лежит использование вирусных конструкций, что накладывает ряд ограничений на работу с клетками человека, в частности с яйцеклетками. Кроме того, заявленные конструкции выполнены на основе аденоассоциированного вируса, геном которого представлен молекулой ДНК.

Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известны модификации направляющих нуклеазу SpCas9 молекул РНК, способных функционально взаимодействовать с нуклеазой и при этом эффективно импортироваться в митохондрии клеток человека. Представленные в данной заявке модификации структуры направляющей РНК не влияют на взаимодействие с нуклеазой SpCas9 и обеспечивают их импорт внутрь митохондрий клеток человека.

Отличительным признаком изобретения является модификация структуры направляющей нуклеазу SpCas9 молекулы РНК, обеспечивающая импорт РНК в митохондрии, где объединяясь с нуклеазой SpCas9, формируется функциональный комплекс белок-РНК для элиминации определенных гаплотипов митохондриальной ДНК. Новизну представляют нуклеотидные последовательности направляющих нуклеазу SpCas9 молекул РНК.

Задачей заявляемого изобретения является элиминирование определенных гаплотипов митохондриальной ДНК. Это может быть использовано как для сдвига уровня гетероплазмии патогенных мутаций мтДНК (патогенный гаплотип), так и для элиминации «старых» мтДНК, захваченных в ходе процедуры донации митохондрий.

Поставленная задача решается тем, что модификации направляющей нуклеазу SpCas9 молекулы РНК, после попадания последней в цитоплазму клеток, обеспечивают ее импорт в митохондрии клеток человека. Для этого в структуру направляющей РНК, вместо двух последовательностей GAAA были интегрированы детерминанты импорта РНК, представляющие собой субдомены транспортной РНК лизина (HF и HD). В результате были разработаны четыре варианта модификаций структуры направляющей РНК, названные нами gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD.

Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации определенных гаплотипов мтДНК RGEN/SpCas9 и способа доставки ее РНК-части в органеллы.

Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы RGEN/SpCas9. Нуклеаза SpCas9 (патент на изобретение РФ №2634395) взаимодействует с представленными в данной заявке направляющими молекулами РНК образуя функциональный комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональные домены SpCas9 вносят разрывы в обе цепи ДНК. Двухцепочечные разрывы в мтДНК, полученные таким образом, приводят к ее элиминации ферментами системы репликации митохондрий. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не подверженных элиминации.

Каждая из представленных направляющих РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD), в силу своих структурных особенностей, взаимодействует с митохондриальной тРНК-лизил синтазой (pre-KARS2) и белком ENO2, которые импортируются в митохондрии совместно с направляющей РНК (ко-импорт). В митохондриях направляющая РНК связывается с нуклеазой SpCas9 для элиминации определенных гаплотипов мтДНК.

На фиг. 1 представлены нуклеотидные последовательности разработанных модификаций. Первая модификация (gRNA-HF-HF) включает детерминанты импорта HF в положениях 13-19 и 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Вторая модификация (gRNA-HF-HD) включает детерминанту импорта HF в положении 13-19 и HD в положении 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Третья модификация (gRNA-HD-HF) включает детерминанту импорта HD в положении 13-19 и HF в положении 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК. Четвертая модификация (gRNA-HD-HD) включает детерминанты импорта HD в положениях 13-19 и 66-82 нуклеотидной последовательности направляющей РНК.

На фиг. 2 представлена функциональная активность модифицированных направляющих РНК. Для этого были синтезированы четыре двух-цепочечные ДНК, кодирующие модифицированные направляющие РНК и не модифицированная направляющая РНК в качестве положительного контроля. Направляющие РНК были фланкированы Т7 промотором и последовательностью для узнавания определенного сайта ДНК с одной стороны, и Т7 терминатором - с другой, для проведения in vitro транскрипции, используя Т7-полимеразу и рибо-нуклеотиды. Используя полученные модифицированные молекулы РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD), не модифицированную контрольную направляющую РНК и коммерчески доступный белок SpCas9 была поставлена реакций in vitro разрезания матрицы ДНК. Было показано, что модификации структуры направляющей РНК не влияют на ее функциональную активность. На фиг. 2 слева направо: gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HD, gRNA-HD-HF, gRNA и ДНК маркер.

Для детекции модифицированной направляющей РНК в митохондриях проводили трансфекцию клеток линии Phoenix, полученной в ходе реакции in vitro транскрипции РНК. Для этого клетки выращивали в 6 луночном планшете. Первую лунку трансфецировали липофильным агентом Lipofectamine 3000 молекулами РНК gRNA-HF-HF, вторую - gRNA-HF-HD, третью - gRNA-HD-HF, четвертую - gRNA-HD-HD, пятую -немодифицированой gRNA, шестую - Lipofectamine 3000 без РНК (Мосk-трансфекция). Через 48 часов после трансфекции выделяли митохондрии, используя коммерческий набор Qproteome Mitochondria Isolation Kit (QIAGEN), согласно протоколу производителя. Из митохондрий выделяли РНК, используя стандартный фенол-хлороформный метод. Полученную РНК использовали для постановки реакции капельной цифровой полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией, используя коммерческий набор One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes (Life Science), согласно протоколу производителя. Для детекции направляющих РНК использовали следующие праймеры и пробы: For GACTCGGTGCCACTTCTC; Rev TTATGGCGTCAGCGAGTTT; Probe FAM-CCCGAAAGTTGATAACGGACTAGCCT-BHQ1. Выявили, что модифицированная детерминантами импорта РНК (gRNA-HF-HF, gRNA-HF-HD, gRNA-HD-HF и gRNA-HD-HD) детектируется в количестве 650-700 копий на реакцию, тогда как не модифицированная РНК и Мосk-трансфекция не показывают наличие РНК в митохондриях клеток.