Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО И СПОСОБ ДЛЯ РАННЕГО КОНТРАСТНОГО МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОГО ТОМОГРАФИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ С ПИТАЮЩИМИ ИХ СОСУДАМИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Область техники

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается получения средства и способа для раннего контрастного магнитно-резонансного томографического (МРТ) выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте.

Уровень техники

Известны комбинации контрастных МРТ нанопрепаратов: аскорбатферрит-магневист (АФ-МВ), цитратферрит-магневист (ЦФ-МВ) и способ обнаружения сосудов, питающих опухоль [патент РФ №2382596, опубликовано 27.02.2010, кл. А61В 5/055, A61K 49/06]. На 6-14 день после прививки аденокарциномы молочной железы Са755, последовательно вводят в хвостовую вену комбинации: АФ-МВ или ЦФ-МВ. Контрастные МРТ изображения сосудов, питающих капсулу и опухоль аденокарциномы молочной железы Са755, визуализируют через 3,0-30,0 час после введения АФ-МВ или ЦФ-МВ [Брусенцов Н.А., Пирогов Ю.А., Брусенцова Т.Н., Учеваткин А.А., Никитин П.И., Никитин М.П. и др. Выявление сосудов, питающих опухоль. Российский биотерапевтический журнал, 9(4), с. 6, 2010].

Недостатки способа обнаружения сосудов, питающих опухоль:

- неустойчивость золей АФ и СФ в полиглюкине;

- окисление Fe²⁺ до Fe³⁺, которое приводит к уменьшению удельной намагниченности (M_s) магнитных наночастиц (МН) АФ-МВ и ЦФ-МВ, изменению их физико-химических свойств, с утратой визуализации сосудов, питающие опухоль, при КМРТ сканировании молочной железы на 3-5 день после прививки аденокарциномы Са755;

Прототипом способа синтеза МРТ контрастного средства для выявления глиальных опухолей с питающими их сосудами является способ синтеза декстранферрита [Гуляев М.В., Пирогов Ю.А., Брусенцова Т.Н., Брусенцов Н.А. Синтез декстранферрита и раннее магнитно-резонансное томографическое выявление опухоли, капсулы и сосудов, питающих опухоль, в эксперименте in vivo. Сборник тезисов докладов участников Второго международного форума по нанотехнологиям 6-8 октября 2009. Нанотехнологии в медицине. Онкология и кардиология, с. 9-11].

К недостаткам способа синтеза декстранферрита относят:

- неустойчивость золей магнетита, которые спонтанно окисляются и агрегируют в водной среде;

- окисление Fe²⁺ до Fe³⁺ в нанокристаллах магнетита, которое приводит к уменьшению удельной намагниченности (M_s) и изменению физико-химических свойств;

- неустойчивость золей декстранферрита в полиглюкине, которая приводит к образованию микротромбов в крови.

Прототипом способа раннего контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей является метод контрастного МРТ сканирования мозга на 7-14 день после прививки с внутривенным (ВВ) введением комбинации декстран магнетит-магневист (ДМ-МВ) крысам, с получением магнитно-резонансных T₁, Т₂ и Т₂* взвешенных контрастных МРТ изображений глиальных опухолей [М.В. Гуляев, Н.В. Анисимов, Г.М. Юсубалиева, Н.А. Брусенцов, А.А. Самойленко, Ю.А. Пирогов. Применение методов ЯМР в исследованиях глиальных опухолей у лабораторных животных. Технологии живых систем, 10(1), с. 35-40 (2013)].

К недостаткам данного способа выявления злокачественных глиальных опухолей относят позднюю визуализацию контрастных МРТ изображений злокачественных глиом, которая происходит лишь на 7-14 день после прививки.

Ранняя визуализация контрастных МРТ изображений злокачественных глиом с питающими их сосудами, после ВВ или интраперитонеального (ИП) введения комбинации ДМ-МВ на 3-5 день после прививки не происходит.

Магнитные наночастицы ДМ в полиглюкине неустойчивы при хранении в виде золей, они быстро слипаются и выпадают в осадок. Кроме того, в составе ДМ содержатся ионы Fe²⁺, которые окисляются кислородом воздуха. При окислении Fe²⁺ до Fe³⁺ уменьшается намагниченность МН ДМ и изменяются физико-химические свойства.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является создание средства и способа для раннего (на 3-4 день после прививки) контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами.

Техническим результатом является избирательно увеличивающее число вокселей для ранней контрастной МРТ визуализации взвешенных 3D контрастных МРТ изображений путем понижения сигнала протонов нормальных тканей до гипоинтенсивного и повышения сигнала протонов опухолевых глиальных тканей с питающими их сосудами до гиперинтенсивного через 3-4 дня после прививки, что на 3-4 дня раньше известных способов выявления глиальных опухолей.

Технический результат достигается за счет средства способа. Средство получают следующим способом: смесь Fe(OH)₂, Fe(OH)₃ и Со(ОН)₂ при следующем соотношении компонентов: 1,1÷1,3:1,7÷1,9:0,1, нагревают при рН 11-12 в отсутствии кислорода при перемешивании; полученные нанокристаллы нестехиометрического магнетита общей формулы (1)

,

высаживают в неоднородном постоянном магнитном поле, полученную суспензию активируют концентрированной хлористоводородной кислотой до получения прозрачного светло-желтого раствора, далее полученные нанокристаллы обрабатывают декстраном до образования устойчивого в течении 15-30 минут золя в магнитном поле при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см и получают допированный Со²⁺ декстранферрит общей формулы (2): .

Активацию концентрированной хлористоводородной кислотой проводят при рН 1,2-1,4.

Высаживание в неоднородном постоянном магнитном поле проводят при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см.

Способ раннего обнаружения сосудов, питающих опухоль, включающий контрастное МРТ сканирование головного мозга, осуществляют следующим образом: за 10 мин - 48 ч до контрастного МРТ сканирования головного мозга, внутривенно или внутриартериально вводят 2-5% водный раствор допированного Со²⁺ декстранферрита общей формулы (2):

взятого из расчета 0,1-0,2 мл на 100 грамм веса, а за 3-6 мин до начала сканирования внутривенно вводят магневист из расчета 0,1-0,2 мл/кг и затем осуществляют визуализацию T1, Т2 и Т2* взвешенных 3D изображений злокачественных глиальных опухолей.

Осуществление изобретения

Способ получения допированного ионами кобальта (Со²⁺) декстранферрита (ДФСо²⁺) включает нагрев смеси Fe(OH)₂, Fe(OH)₃ и Со(ОН)₂ при следующем соотношении компонентов: 1,1-1,3:1,7-1,9:0,1, с допустимой величиной погрешности, при рН 11-12 в отсутствии кислорода при перемешивании получают нанокристаллы нестехиометрического магнетита общей формулы (1)

,

полученные нанокристаллы высаживают в неоднородном постоянном магнитном поле. Полученную суспензию активируют концентрированной хлористоводородной кислотой до получения прозрачного светло-желтого раствора, далее полученные нанокристаллы обрабатывают декстраном до образования устойчивого в течении 15-30 минут золя в магнитном поле при 0,2-3,0 Тл, градиент 0,003 Тл/см - 0,04 Тл/см и получают дотированный Со²⁺ декстранферрит общей формулы (2)

.

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита (зависит от объема и концентрации реакционной смеси);

m - количество активированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

r-m - количество неактивированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%

f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

общее число остатков молекул глюкозы в молекуле декстрана 432;

q-f - число остатков глюкозы, неимеющих химические связи с молекулами допированного Со²⁺ магнетита от 95 до 65%

Заявляемое средство (ЗС) получают следующим образом

Водную суспензию смеси гидроксидов 1,2Fe(OH)₂+1,8Fe(OH)₃ (моль) перемешивают при рН 11-12, нагревают при 80°С и перемешивают до прекращения роста нанокристаллов вследствие понижения концентрации ионов железа, затем добавляют Со(ОН)₂ и перемешивают 40 мин при 80-90°С. Получают водную суспензию черного цвета.

Далее суспензию очищают от исходных веществ в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией 0,2 Тл, градиент 0,003 Тл/см. Получают допированный кобальтом нестехиометрический магнетит состава Fe²⁺_1,2 Fe³⁺_1,8O₄ Co²⁺_0,1O общей формулы:

,

который представляет собой нанокристаллы диаметром от 7 до 11 нм. Нанокристаллы активируют концентрированной хлористоводородной кислотой и обрабатывают декстраном.

Получают декстранферрит, допированный Со²⁺ (ДФСо²⁺), общей формулы (2):

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита (зависит от объема и концентрации реакционной смеси); m - количество активированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

r-m - количество неактивированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%

f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

q-f - число остатков глюкозы, не имеющих химические связи с молекулами допированного Со²⁺ магнетита от 95 до 65%.

Оно представляет собой кристаллическое вещество от темно-коричневого до черного цвета.

Далее лиофилизацией получают порошок, который в воде образует устойчивые коллоидные растворы.

ζ - потенциал наночастиц до покрытия декстраном соответствовал - 18 мВ, Т2 релаксивность (Relaxivity) 456 с^-1млМ^-1.

После покрытия ζ-потенциал наночастиц - 36 мВ. Релаксивность, отражающая способность контрастного МРТ препарата изменять времена протонной ядерной магнитной релаксации в зависимости от концентрации магнитных центров, понижалась после покрытия нанокристаллов декстраном до 410 с^-1млМ^-1.

В процессе физико-химического изучения ДФСо²⁺ определили два основных фактора, которые определяют усиление сигнала магнитного резонанса протонов воды в магнитном поле в присутствии контрастного препарата, ДФСо²⁺:

- ядро наночастицы из нестехиометрического магнетита (размер ядра и его химический состав);

- покрытие ядра наночастицы (толщина слоя и химический состав), которые могут повышать или понижать Т2 релаксивность за счет изменения интенсивности диффузии молекул воды в неоднородном магнитном поле, создаваемом МН.

Декстрановое покрытие понижает интенсивность диффузии молекул воды в неоднородном магнитном поле, создаваемом МН ДФСо²⁺.

Удельную намагниченность насыщения (M_s) ДФСо²⁺ 7,8 кА/м увеличивают введением в структуру ядра ионов Со²⁺, содержащих атомы с неспаренными электронами, удельная абсорбция энергии ((SAR) 280 Вт/г Fe).

Острая токсичность при внутривенном введении:

ЛД₅₀ мышей C57B1/6j 1,03 г/кг; ЛД₅₀ крыс Вистар 1,75 г/кг.

Декстранферрит допированный Со²⁺ образует устойчивые в течение 1 месяца водные золи, которые используют в качестве магнитных носителей для биомедицинских целей.

К настоящему времени решены многие технологические проблемы, связанные с технологией получения суперпарамагнитных наночастиц (СМН) [1-3]. Однако, до сих пор, не опубликована методика получения устойчивых водных золей суперпарамагнитных наночастиц нестехиометрического магнетита допированных ионами Со²⁺, покрытых декстраном.

Магнитные наночастицы ДФСо²⁺, успешно используемые in vivo, состоят из нестехиометрического магнетита (Fe₃O₄Co²⁺O), нестехиометрического магнетита (γ-Fe₂O₃ Со²⁺О) и применяются с учетом их магнитных свойств, низкой токсичности и известным путям метаболизма [1-4].

В основном СМН используются в биомедицинских исследованиях на культурах клеток и на линейных экспериментальных животных. Гидродинамический диаметр наночастиц от 30 до 700 нм. Полученный фильтрат декстранферрита, допированного ионами Со²⁺ (ДФСо²⁺), концентрируют на роторном испарителе. Получают 10% водный золь, рН 7,2, стерилизуют при температуре +100°С 1 час, разливают по 10 мл в стеклянные флаконы и используют по назначению или лиофилизируют.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом:

- для анестезии крысам вводят интраперитонеально 0,01 г/кг «Zoletil 100», (фирмы Virbac);

- перед прививкой глиальных опухолей проводят предварительное контрастное МРТ сканирование головного мозга 4 нормальных крыс;

- находят участки мозга, в которые планируют имплантировать опухолевые клетки;

- определяют переносимые млекопитающими дозы МН ДФ и МН ЗС, достаточные для визуализации КМРТ изображений тканей мозга высокого разрешения и контраста;

- 2 крысам вводят ВВ от 0,1 до 1,0 мл/кг 5% золь МН декстранферрита в полиглюкине в комбинации с магневистом (МВ) (ДФ-МВ), другим 2 крысам вводят ВВ от 0,1 до 1,0 мл/кг 5% водный золь МН заявляемого средства в комбинации с магневистом (ЗС-МВ), от 0,1 до 0,2 мл/кг. Контрастным МРТ сканированием мозга визуализируют КМРТ изображения (КМРТИ), фиг. 1 (а, b);

- сравнивают информативность и качество КМРТ изображений нормального головного мозга, полученных с помощью ДФ-МВ и ЗС-МВ до прививки опухолей.

Внутрисосудистым введением ЗС-МВ визуализируют более информативные КМРТИ высокого разрешения и контраста, фиг. 1 (b).

Для разработки способа раннего, контрастного МРТ выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами отбирают 80 половозрелых самок крыс Вистар весом 180-200 г разводки вивария ФГБНУ "РОНЦ им Н.Н. Блохина", делят их на 2 партии 1 и 2, по 40 особей в каждой. Стереотаксически, в стерильных условиях 40 самкам крыс 1 партии имплантируют интрацеребрально на глубину 3 мм суспензию 10⁶ жизнеспособных клеток глиобластомы 101/8 в 0,015 мл питательной среды 199 при рН 7,4.

Глиому С6 имплантируют 40 самкам крыс 2 партии и изучают развитие опухолей аналогично глиоболастоме 101/8.

Из 40 крыс Вистар с опухолями глиобластомы 101/8 выбирают 25 крыс, делят на 4 группы: 1, 2, 3, 4. В 1 контрольной группе - 10 крыс, в опытных группах - по 5 крыс.

Из 40 крыс Вистар с опухолями глиомы С6 выбирают 25 крыс, делят на 4 группы: 1', 2', 3', 4'. В 1' контрольной группе - 10 крыс, в опытных группах - по 5 крыс.

Через 72 час после прививки опухолей 10 крысам 1 и 10 крысам 1' контрольных групп до проведения раннего контрастного МРТ сканирования в период от 6 мин до 30 час внутривенно вводят 0,9% раствор NaCl от 0,1 до 1,0 мл/кг, проводят МРТ сканирование мозга. Мозг сканируют in vivo на биоспектротомографе (Bruker) в режимах получения Ti взвешенных {500/15 (время повторения, мс/время эхо, мс), Т₂ взвешенных (1900/80) спин-эхо и Т₂-взвешенных градиент-эхо (500/15)} изображений, Т₂* взвешенных {500/15 [время повторения, мс/время эхо, мс]. МРТ изображения ранних форм глиальных опухолей не визуализируются, см. фиг. 2 (а', b'). Однако через 7-14 дней в местах прививки визуализируются МРТИ распространенных форм глиальных опухолей - фиг. 3 (а', b', с') и фиг. 4. В процессе МРТ сканирования мозга осуществляют мониторинг частоты сердечных сокращений и ритма дыхания крыс с помощью Model 1025 smol Animal Monitoring and Gating System (Operation Mammal SA Instruments, Inc.).

В опытных группах 2, 2'; 3, 3'; и 4, 4' за такой же период времени перед ранним контрастным МРТ сканированием внутривенно вводят:

- крысам 2, 2' групп от 0,1 до 0,2 мл/кг магневист;

- крысам 3, 3' групп от 0,1 до 2,0 мл/кг комбинации 5% золя декстранферрита в полиглюкине, магневист (МВ), (ДФ-МВ);

- крысам 4, 4' групп от 0,1 до 2,0 мл/кг комбинации 5% водного золя заявляемого средства и от 0,1 до 0,2 мл/кг - магневист, см. табл. 1.

Контрастные магнитно-резонансные томографические изображения (КМРТИ) глиальных опухолей визуализируют на 3-5 день после прививки опухоли внутрисосудистым введением комбинации заявленного средства с магневистом, фигуры: 5 (b'); 6 (b'); 7 (b); 8 (b); 9 (а', b', с', d'); 10 (a', b', с', d'); 11 (а, b, с); 12 (а', b', с'); 13 (а, b, с, d); 14 (a', b', с') и 15.

Через 60-168 час после прививки злокачественных глиальных опухолей, через 1-24 час после внутрисосудистого введения заявляемого средства в комбинации с МВ, мозг 50 самок крыс Вистар сканируют с визуализацией КМРТ изображений злокачественных глиальных опухолей, с питающими их сосудами. Визуализируют МРТ и КМРТ изображения мозга крыс с привитыми опухолями, которые точнее отражают изменения, тканей мозга, вызванные опухолевой малигнизацией, чем комбинации ДФ-МВ, фигуры 5 (b'), 6 (b'), 7 (b), 8 (b). Визуализируют МРТИ ранних, а также распространенных форм глиальных опухолей с питающими их сосудами 9 (а', b', с', d'); 10 (а', b', с', d'); 11 (a, b, с); 12 (а', b', с'); 13 (а, b, c, d); 14 (а', b', с'), 15.

Визуализируют КМРТ изображения ранних форм опухолей глиомы С6, фиг. 5 (а', b') и фиг. 6 (а', b') и глиобластомы 101/8, фиг. 7 (а, b) и фиг. 8 (а, b).

По результатам сравнения КМРТ изображений определяют, что ВВ введение магневиста или комбинации ДФ-МВ приводит к изображениям низкого контраста и разрешения, фигуры: 5 (а'); 6 (а'); 7 (а); 8 (а). ВВ введение комбинации ЗС-МВ приводит к МРТ изображениям высокого разрешения и контраста, фигуры: 5 (b'); 6 (b'); 7 (b); 8 (b).

Таким образом, внутрисосудистое введение комбинации ЗС-МВ визуализирует КМРТИ глиальных опухолей более высокого разрешения и контраста.

Оптимальные количества заявленного средства, визуализирующие КМРТ изображения: от 0,1 до 1,0 мл/кг в виде водного 5% золя заявляемого средства, в комбинации с 0,2 мл/кг магневиста определяют по таблицам 1-4.

Таблица 2. Зависимость контраста, разрешения и яркости КМРТ изображений ранних форм опухолей глиобластомы 101/8 от времени, прошедшего после прививки и количества введенного заявляемого средства в комбинации с магневистом.

КМРТ изображения злокачественных глиальных опухолей, с питающими их сосудами, визуализируют у 12 крыс через 72-96 час после прививки опухолей, путем внутрисосудистого введения от 1,0 до 2,0 мл/кг 5% водного золя заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста за 3-6 мин до КМРТ сканирования мозга крыс.

Таблица 3. Зависимость контраста, разрешения и яркости контрастных МРТ изображений ранних опухолей глиомы С6 от количества введенного заявляемого средства и магневиста.

КМРТ изображения злокачественных глиальных опухолей, с питающими их сосудами, визуализируют у 9 крыс с привитыми опухолями через 1-24 час после внутрисосудистого введения заявляемого средства и за 3-10 мин до КМРТ сканирования опухоли путем введения магневиста от 0,1 до 0,2 мл/кг.

Таблица 4. Зависимость контраста, разрешения и яркости МРТ изображений опухолей от времени, прошедшего после введения 1,0 мл/кг водного золя 5% заявляемого средства в комбинации с 0,2 мл/кг магневиста.

КМРТ изображения злокачественных глиальных опухолей, с питающими их сосудами, визуализируют у 9 крыс с привитыми опухолями через 1-24 час после внутрисосудистого введения заявляемого средства и за 5 мин до КМРТ сканирования опухоли вводят магневист от 0,1 до 0,2 мл/кг.

Раннее контрастное МРТ сканирование проводят на 3-5 день после прививки опухолей с получением T₁ взвешенных изображений (ВИ) 600/15 (время повторения / время эха, GRE), Т₂ взвешенных 1,900/80 спиновое эхо, Т₂ взвешенных градиентное эхо (GRE) 600/15 и Т₂* взвешенных 500/15 контрастных МРТ изображений.

С увеличением плотности опухолевых клеток в мозге на 7-14 день после прививки глиома С6 и глиобластома 101/8 хорошо визуализируются на Т₂ взвешенных изображениях, благодаря разнице во временах поперечной релаксации Т₂ по сравнению с белым веществом мозга. Различия в протонной плотности (PD) и времени продольной релаксации T₁ для глиальных опухолей и здоровых тканей на 7-14 лень после прививки менее выражены. Это четко проявляется на параметрических картах, построенных по изображениям, полученным методом спинового эха при варьировании параметров TR и ТЕ в пределах - 0,95-5,0 мс и 13-170 мс, соответственно.

На 3-5 день после прививки опухолей из-за низкой плотности опухолевых клеток в мозге не удается визуализировать МРТИ глиомы С6 и глиобластомы 101/8. Для их визуализации в хвостовую вену крыс вводят 1,0 мл/кг 5% золь декстранферрита в полиглюкине, измеряют интенсивность сигнала и проводят визуальный анализ изображений.

Определяют:

- для глиобластомы 101/8 отсутствие МРТ визуализации ранних форм опухолей с питающими их сосудами;

- для глиомы С6 отсутствие МРТ визуализации ранних форм опухолей с питающими их сосудами.

Внутрисосудистым ведением комбинации заявляемого средства с магневистом визуализируют:

- на 3-5 день после прививки опухолей КМРТИ ранних форм опухолей, фигуры: 9 (а', b'); 10 (а', b') и ранних форм опухолей с питающими их сосудами, 11 (а); 12 (а'); 13 (а); 14 (а', b', с');

- на 7-14 день после прививки опухолей - КМРТИ распространенных форм глиальных опухолей, 9 (с', d'); 10 (с', d');

- распространенных форм глиальных опухолей с питающими их сосудами, 11 (b, с); 12 (b', с'); 13 (b, с, d); 15.

Кроме того, КМРТ изображения опухолей, полученные в результате внутрисосудистого введения комбинации ЗС-МВ, точнее отражают изменения, тканей мозга, вызванные опухолевой малигнизацией, чем комбинации ДФ-МВ, фигуры 5 (b'), 6 (b'), 7 (b), 8 (b).

В опытах in vivo до 10 часов сохраняется высокое разрешение КМРТ изображений опухолей с питающими их сосудами. Информативность КМРТИ, после введения комбинации ЗС-МВ, выше информативности КМРТИ, которые визуализируют крысам ДФ-МВ.

Введением комбинации ЗС-МВ в сонную артерию на 3-5 день после прививки визуализируют контрастные МРТ изображения ранних форм опухолей глиобластомы 101/8 и глиомы С6 с питающими их сосудами, фигуры: 11 (а); 12 (а'); 13 (а).

Введением комбинации ЗС-МВ в сонную артерию на 7-14 день после прививки визуализируют контрастные МРТ изображения распространенных форм глиобластомы 101/8 и глиомы С6 с питающими их сосудами, фигуры: 11 (b, с); 12 (b', с'); 13 (b, с, d).

Внутривенным введением комбинации ЗС-МВ через 72 час после прививки визуализируют контрастные МРТ изображения ранних форм опухолей глиомы С6 с питающими их сосудами, фиг. 14 (а', b', с').

Внутривенное введение комбинации ЗС-МВ через 168 час после прививки визуализирует контрастные МРТ изображения распространенной формы глиомы С6 с питающими сосудами, фиг. 15.

Все упомянутые КМРТИ визуализируют при ослаблении сигналов протонов нормальных тканей заявляемым средством и при усилении сигналов протонов опухолевых тканей магневистом.

Визуализируют контрастные МРТ изображения высокого разрешения, контраста и яркости, фигуры: 5 (а', b'), 6 (а', b'), 7 (а, b), 8 (а, b); 9 (а', b', с', d'); 10 (а', b', с', d'); 11 (а, b, с); 12 (а', b', с'); 13 (а, b, с, d); 14 (а', b', с') и 15.

Зависимость разрешения, контраста и яркости, контрастных МРТ изображений ранних форм опухолей от времени, прошедшего после введения комбинации 1,0 мл/кг водного 5% золя заявляемого средства, и оптимальное время визуализации контрастных МРТ изображений высокого разрешения для ранних форм злокачественных глиальных опухолей от 30 минут до 30 часов после ВВ введения заявляемого средства определяют на крысах, табл. 2-4.

Полученные результаты обрабатывают статистически. За достоверные принимают различия при ρ<0,05 [О.Ю. Реброва. Статистический анализ медицинских данных. Медиа Сфера, Москва (2002)].

Заявляемый способ иллюстрируется: примерами 1-5 и таблицами 1-4.

Пример 1. Приготовление растворов солей и синтез декстранферрита, допированного Со²⁺, проводят в дистиллированной, свежепрокипяченной воде в атмосфере азота. Готовят раствор смеси 1,2FeCl₂ 6Н₂О и 1,8FeCl₃ 7H₂O в 250 мл воды, фильтруют через стеклянный фильтр, получают фильтрат №1.

Растворяют 0,1CoCl₂⋅6Н₂О в 50 мл воды и фильтруют через стеклянный фильтр, получают фильтрат №2.

К фильтрату №1 прибавляют рассчитанное количество 25% раствора гидроксида аммония, перемешивают при рН 10-11 30 мин с контролем образовавшихся кристаллов, при перемешивании прибавляют фильтрат №2, перемешивают, при перемешивании прибавляют 20% водный раствора гидроксида натрия до рН 11-12 и перемешивают до полного превращения соли кобальта в гидроксид Со(ОН)₂:

.

Водную суспензию смеси полученных гидроксидов нагревают 40 мин при 80-90°С. Получают допированный кобальтом нестехиометрический магнетит состава:

который представляет собой нанокристаллы диаметром от 7 до 11 нм. Размеры нанокристаллов определяют просвечивающей электронной микроскопией. При хранении нанокристаллы спонтанно превращаются в конгломераты, поэтому 2(Fe₃O₄Co_0,1O) активируют концентрированной хлористоводородной кислотой рН 1,2-1,4 и обрабатывают декстраном.

где r - общее число магнитных кластеров допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита (зависит от объема и концентрации реакционной смеси);

m - количество активированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

r-m - количество неактивированных молекул допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 95 до 65%

f - число остатков глюкозы в молекуле декстрана, имеющих прямые химические связи с молекулами допированного Со²⁺ нестехиометрического магнетита от 5 до 35%;

общее число остатков молекул глюкозы в молекуле декстрана 432;

q-f - число остатков глюкозы, неимеющих химические связи с молекулами допированного Со²⁺ магнетита от 95 до 65%

При взаимодействии поверхности нанокристаллов допированного кобальтом нестехиометрического магнетита (Fe₃O₄Co_0,1°) с концентрированной хлористоводородной кислотой происходит окисление nFe²⁺, находящихся на поверхности, до nFe³⁺ с образованием наночастиц допированного кобальтом активированного нестехиометрического магнетита (Fe₃O₄Co_0,1O)_r-m (Fe₂O₃Co_0,1OFeOCl)_m.

К 200 мл 2,1% суспензии наночастиц допированного кобальтом активированного нестехиометрического магнетита (диаметр наночастиц от 5 до 11 нм, рН суспензии 1,5) прибавляют раствор 28,0 г декстрана Т 70, фирмы Sigma, в 150 мл H₂O. Реакционную смесь интенсивно перемешивают при 100°С в атмосфере азота в течение 50 мин. На поверхности наночастиц допированного кобальтом нестехиометрического магнетита образуются химические связи между молекулами γ - окиси железа и декстрана с выделением HCl и образованием устойчивого водного золя наночастиц заявляемого средства (ДФСо²⁺). Ионы Со²⁺ более устойчивы к окислению кислородом воздуха чем ионы Fe²⁺, защищают поверхность допированных нанокристаллов от окисления и увеличивают релаксивность при получении Т2 взвешенных контрастных МРТ изображений. Полученный золь обрабатывают на роторном испарителе. Золь, содержащий от 5% до 15% ДФСо²⁺, концентрируют в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией 0,2 Тл, градиент 0,012 Тл/см, разбавляют водой в 10 раз и центрифугируют 5 мин при 2000 оборотов/мин. Полученный супернатант фильтруют через бумажный фильтр и систему фильтров Миллипор (диаметр пор от 200 до 1000 нм). 0,01 мл полученного фильтрата разбавляют до содержания МН от 0,01 до 0,0001% и определяют гидродинамический диаметр наночастиц, который составляет от 30 до 700 нм.

Полученный фильтрат декстранферрита, допированного ионами Со²⁺ (ДФСо²⁺), концентрируют на роторном испарителе. Получают 10% водный золь, рН 7,2 стерилизуют при температуре +100°С 1 час, разливают по 10 мл в стеклянные флаконы объемом 20 мл, замораживают при температуре - 80°С, лиофильно высушивают, заполняют азотом, закрывают резиновыми пробками с металлическими колпачками. Острая токсичность на самках мышей BDFi LD 50 4,1 г/кг, на крысах 3,4 г/кг. Хранят при комнатной температуре во флаконах. Срок хранения 10 лет.

Низкая острая токсичность заявляемого средства на млекопитающих и высокая эффективность при ранней диагностике злокачественных глиальных опухолей являются основанием для планирования ограниченных предклинических испытаний средства и способа для раннего выявления злокачественных глиальных опухолей с питающими их сосудами в эксперименте.

Приготовление 5% золя декстранферрита, допированного ионами Со²⁺ (ДФСо²⁺). К 0,5 г декстранферрита, допированного ионами Со²⁺, прибавляют 1,5 мл воды, выдерживают в ультразвуковой бане 10 мин, доводят объем полученного золя до 10 мл, получают 5% водный золь, черного цвета, рН 7,2, удельная намагниченность, Ms 5,8 кА/м. 1%-5% золь ДФСо²⁺ вводят крысам Вистар с привитыми глиальными опухолями внутриартериально (ВА), ВВ или интраперитонеально (ИП) в качестве негативного МРТ контрастного препарата - заявляемого средства.

За 30 мин - 30 часов до КМРТ сканирования головного мозга млекопитающим вводят внутривенно или внутриартериально заявляемое средство от 0,1 до 1,0 мл/кг в виде 1,5-5% водного золя наночастиц диаметром от 30 до 900 нм самостоятельно, или в комбинации с магневистом. Магневист вводят за 3 мин - 6 мин до проведения контрастного МРТ сканирования.

Пример 2. Через 3-5 дней после прививки глиобластомы 101/8, за 6 минут до проведения магнитно-резонансного сканирования, в хвостовую вену крыс 1 группы вводят от 0,1 до 1,0 мл 0,9% NaCl, периодически проводят МРТ сканирование мозга T₁, Т₂ и Т₂* взвешенные 3D МРТИ последовательностей ранних форм опухолей с питающими их сосудами не визуализируются, табл. 1, фигуры 2 (а', b'). Однако через 7-14 дней в результате увеличения протонной плотности (PD) опухолевых тканей происходит визуализация распространенных опухолей, фигуры 3 (а', b', с') и 4.

Пример 3. Мониторинг развития глиобластомы 101/8 путем внутриартериального (в общую сонную артерию) введения комбинации заявляемого средства и магневиста. Через 72 час после прививки глиобластомы 101/8, за 15 мин до раннего контрастного МРТ сканирования, в общую сонную артерию крыс вводят 1,0 мл/кг 1,5% водного золя заявляемого средства (0,015 г/кг), (диаметр наночастиц 30-900 нм), ЛД₅₀ 1,0 г/кг, и за 5 мин до сканирования вводят магневист 0,2 мл/кг с последующим проведением T₁, Т₂ и Т₂* взвешенных 3D сканирований.

Визуализируют МРТ изображения ранних форм опухолей высокого разрешения, яркости и контраста с питающими их сосудами. При анализе структуры опухолей и мозга выявляют расширенные артерии, питающие опухолевые ткани, этим на 3-4 дня сокращают время постановки диагноза.

Через 120 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 12 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста, на КМРТИ, в местах скопления опухолевых клеток, сосуды расширены в результате вазогенного отека и малигнизации. Опухолевые ткани соединены с множеством питающих сосудов.

Через 144 час после прививки и через 13 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды расширены в результате вазогенного отека и малигнизации, опухоль состоит из тканей, соединенных с множеством питающих сосудов.

На ранних стадиях развития глиальных опухолей параллельно с увеличением объема опухолей увеличивается число и диаметр сосудов, питающих центры опухолевой пролиферации, табл. 1, фигуры: 11 (а, b, с) и 13 (а, b, с, d).

Пример 4. Мониторинг развития глиомы С6 путем внутриартериального введения комбинации заявляемого средства и магневиста. Через 72 час после прививки глиомы С6, за 5 мин до раннего контрастного МРТ сканирования в общую сонную артерию крыс вводят 1,0 мл/кг 1,5% водного золя заявляемого средства (0,015 г/кг), (диаметр наночастиц 30-900 нм), ЛД₅₀ 1,0 г/кг, и за 6 минут до сканирования вводят магневист 0,2 мл/кг с последующим проведением T₁, Т₂ и Т₂* взвешенных 3D сканирований.

Визуализируют МРТ изображения ранних форм опухолей высокого разрешения, яркости и контраста с питающими их сосудами. При анализе структуры опухолей и мозга выявляют расширенные артерии, питающие опухолевые ткани, этим на 3-4 дня сокращают время постановки диагноза.

На ранних стадиях развития глиальных опухолей (72 час) параллельно с увеличением объема опухолей увеличивается число и диаметр сосудов, питающих центры опухолевой пролиферации, табл. 1, фигура 12 (а'), этим на 3-4 дня сокращают время постановки диагноза. Через 7-14 дней после прививки в результате внутриартериального введения комбинации заявляемого средства и магневиста, увеличивающих контраст, пространственное разрешение и яркость МРТ изображений, визуализируют опухоли глиомы С6 в виде T₁, Т₂ и Т₂* взвешенных 3D изображений с питающими их сосудами, фигура 12 (b', с').

Пример 5. За 25 часов до раннего контрастного МРТ сканирования в хвостовую вену крыс вводят 1,0 мл/кг 5% водного золя заявляемого средства 1,0 мл/кг 5% водного золя заявляемого средства (0,05 г/кг), (диаметр наночастиц 30-900 нм), ЛД₅₀ 4,0 г/кг, и за 5 минут до сканирования внутривенно вводят 0,2 мл/кг магневиста, визуализируют T₁, Т₂ и Т₂* взвешенные изображения. Ранняя контрастная МРТ визуализация глиальных опухолей с питающими их сосудами достигается ослаблением сигналов протонов нормальных тканей заявляемым средством и усилением сигналов протонов опухолевых тканей магневистом. Разрешение, контраст и яркость МРТ изображений высокие, фигуры: 14 (а', b', с').

Для получения высокоинформативных контрастных МРТ изображений ранних форм глиальных опухолей коррекцию количества вводимых в организм крысы контрастных МРТ средств, времени введения и выдержки животного после введения комбинанантов заявляемого средства и магневиста проводят по таблицам 2-4.

При МРТ сканировании мозга крыс на 3-5 день после прививки опухолей, после внутрисосудистого введения заявляемого средства и магневиста происходит усиление контрастных МРТ изображений и визуализация ранних форм опухолей с питающими их сосудами: глиобластомы 101/8, фигуры: 7 (b); 8 (b); 11 (а); 13 (а), и глиомы С6, фигуры, 5 (b'); 6 (b'); 9 (а', b'); 10 (а', b'); 12 (а'); 14 (а', b', с').

На 7-14 день после прививки опухолей на контрастных МРТ изображениях ГМ выявляют распространенные формы глиальных опухолей с питающими их сосудами, фигуры: 9 (с', d'), 10 (с', d'); 11 (b, с); 12 (b', с'); 13 (b, с, d) и 15.

Краткое описание чертежей

Фигуры: 1 (а, b). Контрастные Т₂ взвешенные МРТ изображения головного мозга крысы Вистар до прививки опухоли: (а) через 24 час после ВВ последовательного введения комбинации 1,0 мл/кг декстранферрита в полиглюкине, и за 5 минут до КМРТС 0,2 мл/кг магневиста визуализируют КМРТИ мозга низкого контраста, разрешения и яркости; (b) через 24 час после ВВ последовательного введения комбинации 1,0 мл/кг заявляемого средства, и за 5 минут до КМРТС вводят магневист 0,2 мл/кг, визуализируют структуру головного мозга высокого контраста, разрешения и яркости in vivo.

Фигуры 2 (a', b'). МРТ изображение головного мозга самки крысы Вистар через 3 дня после интрацеребральной прививки глиомы С6: (а') место введения опухолевых клеток (стрелка); (b') место введения опухолевых клеток, Х2 (стрелка). После ВВ введения 0,9% раствора натрия хлорида МРТИ ранних форм опухолей не визуализируются. До введения ДФ и заявляемого средства МРТ изображения ранних форм опухолей глиомы С6 не визуализируются.

Фигуры 3 (а', b', с'). МРТ изображения мозга самки крысы Вистар через 7 дней после интрацеребральной прививки глиомы С6: (a') PD (протонная плотность) изображение глиомы С6 (пунктирная стрелка); (b') Ti взвешенное изображение глиомы С6 (пунктирная стрелка); (с') Т₂ взвешенное изображение глиомы С6 (пунктирная стрелка). На полученных МРТ изображениях 1/3 объема мозга малигнизирована, структура остального мозга разрушена.

Фигура 4. МРТ изображение мозга самки крысы Вистар на 14 день после интрацеребральной прививки глиобластомы 101/8: распространенная форма глиобластомы до введения заявляемого средства (стрелка); инвазия опухоли в нормальные ткани мозга (пунктирные стрелки). На полученном изображении 1/4 объема мозга малигнизирована (большая стрелка), 1/4 - пролиферирует (между двумя короткими стрелками), остальной мозг инфильтрирован клетками глиобластомы (пунктирные стрелки).

Фигуры: 5 (а', b'). Контрастные Т₂ взвешенные МРТ изображения головного мозга крысы Вистар через 72 час после прививки злокачественной глиомы С6: (а') с последующим ВВ введением комбинации 1,0 мл/кг 5% декстранферрита в полиглюкине и 0,2 мл/кг магневиста; (b') через 72 час после ВВ введения комбинации 1,0 мл/кг заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста, визуализируют центры опухолевой пролиферации (между 2 пунктирными стрелками). В отличие от (а') на (b') дополнительно визуализируют центры опухолевой пролиферации.

Фигуры: 6 (a', b'). Контрастные МРТ T₁ взвешенные изображения головного мозга крысы Вистар через 96 час после прививки злокачественной глиомы С6: (а') с последующим ВВ введением комбинации 1,0 мл/кг 5% декстранферрита в полиглюкине; (b') через 24 час после ВВ введения комбинации 1,0 мл/кг 5% заявляемого средства, и 0,2 мл/кг магневиста визуализируют опухолевые инфильтраты и центры пролиферации (между 2 пунктирными стрелками). В отличие от (а') на (b') дополнительно визуализируют опухолевые инфильтраты и центры пролиферации (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 7 (а, b). Контрастные МРТ Ti взвешенные изображения головного мозга крысы Вистар через 96 час после прививки злокачественной глиобластомы 101/8: (а) с последующим ВВ введением комбинации 1,0 мл/кг 5% декстранферрита в полиглюкине; (b) через 24 час после ВВ введения комбинации 1,0 мл/кг 5% заявляемого средства, и 0,2 мл/кг магневиста визуализируют опухолевые инфильтраты и центры пролиферации (между 2 пунктирными стрелками), в отличие от (а) на (b) дополнительно визуализируют опухолевые инфильтраты и центры пролиферации (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 8 (а, b). Контрастные Т₂ взвешенные МРТ изображения головного мозга крысы Вистар через 120 час после прививки злокачественной глиобластомы 101/8: (а) через 8 час после ВВ введения комбинации 2,0 мл/кг декстранферрита в полиглюкине и за 5 минут до КМРТ сканирования вводят 0,2 мл/кг магневиста; (b) через 8 час после ВВ введения комбинации 200 мл/кг заявляемого средства, и за 5 минут до КМРТ сканирования вводят 0,2 мл/кг магневиста. В отличие от (а) на (b) дополнительно визуализируют центр опухолевой пролиферации на месте прививки (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 9 (а', b', с', d'). Контрастные МРТ изображения ранних форм опухолей ГМ через 48-120 часов (2-5 суток) и опухолей, развившихся через 168-336 часов (7-14 суток) после прививки глиомы С6: (a') T₁ взвешенное контрастное МРТ изображение ранних форм опухолей глиомы С6, визуализируют через 30 часов после введения в хвостовую вену крыс 1,0 мл/кг 5% заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста (МВ), структура ГМ частично сохраняется, на месте прививки визуализируется светлый слой опухолевых клеток глиомы С6 2,0×2,5 мм, (белая стрелка), по границе светлого слоя визуализируются малигнизированные капилляры (черная стрелка); (b') через 72 часа после прививки визуализируются структурные изменения ГМ, (черные стрелки), вызванные вазогенным отеком, малигнизацией и пролиферацией неоплазмы в правой половине ГМ, (между белыми наружными стрелками); (с') через 98 часов после прививки увеличилась плотность клеток глиомы С6 и сигнал протонов, на месте прививки визуализировался светлый слой 7×5 мм (между белыми стрелками); (d') через 240 часов после прививки глиомы С6 продолжалась пролиферация неоплазмы и разрушение структуры ГМ (между белыми стрелками), на месте прививки визуализировался светлый слой инфильтрирующей опухоли 13×15 мм (между концами черных стрелок) и темный слой (длинная черная стрелка).

Фигуры: 10 (а', b', с', d'). Асимметрия правой и левой контралатеральных половин ГМ, на контрастных МРТ изображениях ГМ - результат прививки глиомы С6: (а') контрастное МРТ изображение структуры левой (контрольной) половины головного мозга на 3 день после прививки глиомы С6, через 20 час после ВВ введения заявляемого средства (между четырьмя белыми длинными стрелками), контрастные МРТ изображения разрушенных структур правой половины ГМ (черная стрелка), пролиферация опухолей (концы белых толстых стрелок и 2 маленькие наружные стрелки); (b') изменения опухолей левой половины ГМ под давлением опухоли, развившейся в правой половине головного мозга на 4 день после прививки глиомы С6 (между четырьмя белыми короткими стрелками), разрушение структур правой половины ГМ в результате пролиферации опухоли (между четырьмя длинными стрелками); (с') на 7 день после прививки глиомы С6 визуализируются светлые слои опухолевых клеток в правой половине ГМ (между четырьмя черными стрелками), под давлением которых разрушается структура левой половины ГМ, сосуды, снабжающие ГМ (между белыми стрелками); (d') первичная опухоль в правой контралатеральной половине ГМ на 9 день после прививки (между стрелками) и инфильтрация в нормальный мозг (пунктирные стрелки).

Фигуры: 11 (а, b, с). 3D контрастные МРТ изображения сосудов, питающих опухоль глиобластомы 101/8 в реальном времени: (а) через 72 час после прививки опухоли и через 30 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды, питающие опухоль, расширены в результате вазогенного отека и малигнизации (между 2 пунктирными стрелками); (b) через 120 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 30 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды расширены в результате вазогенного отека и малигнизации, опухолевые ткани соединены с множеством питающих сосудов, (между 2 пунктирными стрелками); (с) через 144 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 30 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды расширены в результате вазогенного отека и малигнизации, опухоль состоит из тканей, соединенных с множеством питающих сосудов, (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 12 (а', b', с'). 3D контрастные МРТ изображения сосудов, питающих опухоль, глиомы С6 в реальном времени: (а') через 72 час после прививки опухоли и через 9 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл магневиста, малигнизация сосудов и тканей мозга (между 2 пунктирными стрелками); (b') через 120 час после прививки глиомы С6 и через 9 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл магневиста, сосуды, питающие опухоль, расширены в результате вазогенного отека и малигнизации, сеть сосудов, питающих опухолевые ткани, (между 2 пунктирными стрелками); (с') через 144 час после прививки глиомы С6 и через 9 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,0 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды, питающие опухоль расширены в результате вазогенного отека и малигнизации, опухоль представлена тканями с множеством деградирующих сосудов, (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 13 (а, b, с, d). 3D контрастные МРТ изображения сосудов, питающих глиобластому 101/8 в реальном времени: (а) через 60 час после прививки опухоли и через 10 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,1 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл магневиста, (между 2 пунктирными стрелками); (b) через 96 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 30 мин после введения в общую сонную артерию комбинации 1,1 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды, питающие опухоль, расширены, опухолевые ткани пронизаны сетью питающих сосудов, (между 2 пунктирными стрелками); (с) через 120 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 3 час после введения в общую сонную артерию комбинации 1,1 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл/кг магневиста, сосуды, питающие опухоль, расширены (между 2 пунктирными стрелками); (d) через 144 час после прививки глиобластомы 101/8 и через 3 час после введения в общую сонную артерию комбинации 1,1 мл/кг 1,5% заявляемого средства (ЛД₅₀ 1,0 г/кг) и 0,2 мл магневиста, сосуды, питающие опухоль, расширены, опухоль состоит из тканей, пронизанных расширенными сосудами, (между 2 пунктирными стрелками).

Фигуры: 14 (а', b', с'). 3D контрастные МРТ изображения сосудов, питающих опухоль, через 96 час после прививки глиомы С6 и 30 час после ВВ введения заявляемого средства: (а') сосуды, питающие опухоль утолщены в результате вазогенного отека и малигнизации (между маленькими черными стрелками), ранняя опухоль состоит из разнородных тканей соединенных с множеством питающих сосудов, (между 4 большими черными стрелками); опухоль глиомы С6 находится в тонкой капсуле, вместе с которой ее можно изъять из мозга пинцетом. Капсула покрыта полупрозрачным слоем, в этом слое отсутствуют светлые пятна, образованные другими опухолями (между 4 большими белыми наружными стрелками); (b') сосуды, питающие раннюю опухоль глиомы С6, (вид справа); (с') сосуды, питающие раннюю опухоль глиомы С6, (вид слева).

Фигура 15. 3D контрастное магнитно-резонансное томографическое изображение опухоли глиомы С6 через 14 дней после прививки, через 30 часов после ВВ введения 1,0 мл/кг заявляемого средства, через 6 мин после введения 0,2 мл/кг магневиста и за 24 минуты до контрастного МТР сканирования (между двумя концами черных стрелок); сосуды, питающие опухоль и мелкие островки пролиферирующей опухоли, расположенные по периметру опухоли глиомы С6 (светлые линии и точки); тромбированные опухолевыми клетками сосуды (между тонкими стрелками); извитые опухолевые сосуды (толстая наружная стрелка); сосуды с утолщенными стенками (пунктирная стрелка); нормальные ткани и сосуды ГМ (между двумя толстыми, маленькими наружными стрелками).

Фигуры: 16 (а, b, с, d', е'). Визуальный анализ гистологических препаратов глиобластомы 101/8 (ГБ 101/8): (а) общий вид ГБ 101/8, заметны опухолевые клетки, инфильтрирующие пограничные ткани «нормального» мозга (маленькие стрелки), слой некроза ГБ 101/8, (белая стрелка), слой пролиферации (черная стрелка), слой инфильтрации клеток ГБ 101/8 в «нормальный» мозг (пунктирная стрелка), окраска, гематоксилин и эозин, Х200; (b) малигнизированные сосуды, образовавшиеся в процессе неоангиогенеза (черные стрелки), лимфоциты и моноциты (белые стрелки), окраска по Перлсу, Х600; (с) клетки ГБ 101/8 (белые маленькие стрелки), макрофаги и лейкоциты (черные стрелки); депозиты наночастиц феррита в цитоплазме клеток и в межклеточных пространствах (синие точки, линии и пятна), окраска по Перлсу, XI000. При визуальном анализе изображений гистологических препаратов тканей глиомы С6 определяют: (d') пере- и интравазальную инфильтрацию клеток глиомы С6 (между стрелками); (е') переневральную инфильтрацию клеток глиомы С6 (стрелки). Окраска, крезиловый фиолетовый и толуидиновый синий, Х200.