СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В НОГТЕВЫХ ПЛАСТИНКАХ

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в дерматовенерологии, клинической фармакологии, клинической лабораторной диагностике, биофизике, биохимии для определения активности перекисного окисления липидов в ногтевых пластинках живых людей.

Известен способ определения активности перекисного окисления липидов в биологических тканях с помощью метода хемилюминесценции, заключающийся в том, что 500 мг исследуемой ткани, исключая кровь, предварительно гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 3-4 минут в присутствии 5 мл 0,05 М фосфатного буфера (pH 7,4). Гомогенат центрифугируют 10 мин при 3000 оборотов/мин для получения супернатанта, который затем исследуют методом хемилюминесценции, добавляя в темную камеру люминометра 0,2 мл супернатанта гомогенизированной ткани, 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,1 мл двухвалентного железа, а на 8-м цикле 0,1 мл 3% перекиси водорода с последующей регистрацией хемилюминесценции в течение 50-ти циклов при 37°C с учетом фоновой хемилюминесценции (Климкина Е.И. Влияние производных 3-оксипиридина и 4-тиосульфокислоты на функциональное состояние печени при ее токсическом поражении: дис. … канд. мед. наук.: 14.00.25 / Климкина Елена Ивановна. - Смоленск, 2005. - 148 с.).

Вышеуказанный метод не позволяет исследовать интенсивность хемилюминесценции гомогената ногтевых пластинок, т.к. они не подлежат подобной гомогенизации, и при данном способе липиды ногтевых пластинок не переходят в среду гомогенизации.

Существует способ определения перекисного окисления липидов в эпидермисе, где исследуемый материал (эпидермис) получают с поверхности кожи путем соскоба предметным стеклом в химически чистые чашки Петри, затем проводят экстракцию липидов хлороформ-метанольной смесью. Полученный супернатант используют для определения уровня веществ с изолированными двойными связями, диеновых конъюгатов, кетодиенов, сопряженных триенов, а также ТБК-активных продуктов (Хышиктуев Б.С. Изменения перекисного окисления липидов при псориазе / Б.С. Хышиктуев, Е.В. Фалько // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №7. - С. 12-14).

Данный способ трудоемок, применим только к эпидермису, но не к ногтевой пластинке, которая представляет собой плотные роговые чешуйки. К тому же вышеупомянутый способ не позволяет регистрировать непосредственно кинетику процессов перекисного окисления липидов в тканях, а также регистрировать самые активные радикалы, концентрация которых в изучаемой системе исчезающе мала.

Из способов определения активности перекисного окисления липидов в биологических тканях известен способ определения активности перекисного окисления липидов скелетированных трупов (Патент №2350956 РФ, МПК G01N 33/52. Способ определения активности перекисного окисления липидов в биологических тканях / Федоров Г.Н., Леонов С.Д.; ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию; заявка №2007129325/15 от 30.07.2007; опубликовано 27.03.2009. Бюл. №9).

Сущность данного способа состоит в том, исследуют костную ткань скелетированных трупов в количестве 500 мг, которую измельчают механическим способом, высушивают при 37°C, экстрагируют раствором, содержащим 5 мл фосфатного буфера (0,015 М K₂HPO₄, 0,105 М KCl) и 1 мл 96° этилового спирта, выдерживают на кипящей водяной бане 10 минут, фильтруют, полученный экстракт исследуют методом хемилюминесценции, добавляя в кювету хемилюминометра 0,2 мл экстракта, 0,1 мл сульфата железа (12 мМ), на 5-м цикле вводят 0,1 мл 3% перекиси водорода и регистрируют хемилюминесценцию в течение 50 циклов, оценивая интенсивность быстрой вспышки, время полузатухания, интенсивность ингибирования, светосумму хемилюминесценции.

Недостатком данного способа является трудоемкость, продолжительность исследования, необходимость большого количества клинического материала, исследование трупного, а не живого материала.

Цель изобретения состоит в разработке способа определения активности перекисного окисления липидов в дериватах кожи - ногтевых пластинках живых людей.

Сущность предлагаемого способа состоит в том, что ногтевые пластинки живых людей, которые перед состриганием обрабатывают смесью диэтиловый эфир - этанол в соотношении 1:1, состригают, механически измельчают; 30 мг измельченных ногтевых пластинок экстрагируют раствором, содержащим 5 мл фосфатного буфера (pH 7,4) и 1 мл 96° этилового спирта, выдерживают на кипящей водяной бане в течение 10 мин, смесь фильтруют, регистрируют хемилюминесценцию полученного экстракта в течение 20 циклов, оценивают интенсивность быстрой вспышки (Ф max, отн. ед.), время достижения максимума кинетической кривой хемилюминесценции (Т max, с), тангенс угла подъема кинетической кривой хемилюминесценции (tg подъема), тангенс угла падения кинетической кривой хемилюминесценции (tg спада) и светосумму хемилюминесценции (S, отн. ед.); по совокупности данных параметров определяют наличие или отсутствие активности перекисного окисления липидов в ногтевых пластинках.

Способ осуществляется следующим образом.

Ногтевые пластинки живых людей, не покрытые косметическим лаком, лекарственными средствами, перед состриганием обрабатывают смесью диэтиловый эфир - этанол в соотношении 1:1, состригают, измельчают механическим способом (ножницами), 30 мг измельченных ногтевых пластинок экстрагируют раствором, содержащим 5 мл фосфатного буфера (20 мМ KH₂PO₄, 10 мМ KCl pH 7,4) и 1 мл 96° этилового спирта, выдерживают на кипящей водяной бане в течение 10 минут, смесь фильтруют через фильтровальную бумагу. Полученный экстракт исследуют методом хемилюминесценции на программно-аппаратном комплексе «Биохемилюминометр 3606-М» (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, г. Красноярск, Россия) с учетом фоновой хемилюминесценции, для чего в термостатируемую силиконизированную кювету помещают 0,2 мл полученного экстракта, 0,2 мл фосфатного буфера (20 мМ KH₂PO₄, 10 мМ KCl, pH 7,4), 0,05 мл 12,5 мМ FeSO₄*7H₂O и на 7-м цикле вводят 0,1 мл 3% H₂O₂. Регистрируют хемилюминесценцию в течение 20 циклов, что соответствует 20 секундам, оценивают интенсивность быстрой вспышки (Ф max, отн. ед.), время достижения максимума кинетической кривой хемилюминесценции (Т max, с), тангенс угла подъема кинетической кривой хемилюминесценции (tg подъема), тангенс угла падения кинетической кривой хемилюминесценции (tg спада) и светосумму хемилюминесценции (S, отн. ед.). По совокупности параметров (Ф max, Т max, tg подъема, tg спада, S) в сравнении с фоновой хемилюминесценцией делают вывод о наличии или отсутствии активности перекисного окисления липидов. При этом на 30 мг измельченных ногтевых пластинок берут 6 мл экстрагирующего раствора (5 мл фосфатного буфера (pH 7,4) и 1 мл 96° этилового спирта). Минимальное количество исследуемого материала (30 мг) определено экспериментально. При увеличении массы навески измельченных ногтевых пластинок соответственно увеличивается количество экстрагирующего раствора (фосфатный буфер и 96° этиловый спирт в соотношении 5:1 соответственно). При количестве ногтевых пластинок меньше 30 мг (25 мг; 20 мг) хемилюминесценция не регистрировалась (фиг. 1; 2).

Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером. Проводили исследование хемилюминесценции экстрактов ногтевых пластинок 16 практически здоровых добровольцев в возрасте 20-23 лет.

Исследованию подвергались состриженные ногтевые пластинки кистей, не покрытые косметическим лаком, лекарственными препаратами, которые перед состриганием обрабатывали смесью диэтиловый эфир - этанол в соотношении 1:1. 30 мг ногтевых пластинок, измельченных механическим способом, помещали в колбу с вытянутым горлышком, экстрагировали раствором, содержащим 5 мл фосфатного буфера (20 мМ KH₂PO₄, 10 мМ KCl pH 7,4) и 1 мл 96° этилового спирта, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 10 минут, затем фильтровали через фильтровальную бумагу. Получали около 3 мл экстракта.

Хемилюминесцентный анализ проводили на программно-аппаратном комплексе «Биохемилюминометр 3606-М» (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, г. Красноярск, Россия), для чего в термостатируемую силиконизированную кювету помещали 0,2 мл полученного экстракта, 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4), 0,05 мл 12,5 мМ FeSO₄*7H₂O и на 7-м цикле вводили 0,1 мл 3% H₂O₂. Регистрировали хемилюминесценцию в течение 20 циклов, что соответствовало 20 секундам.

Затем оценивали параметры хемилюминесцентной кривой: интенсивность быстрой вспышки (Ф max, отн. ед.), время достижения максимума кинетической кривой хемилюминесценции (Т max, с), тангенс угла подъема и падения кинетической кривой хемилюминесценции (tg подъема, tg спада) и светосумму хемилюминесценции (S, отн. ед.) - и по совокупности этих параметров делали вывод о наличии или отсутствии активности перекисного окисления липидов в ногтевых пластинках. При исследовании образца №9 Ф max составила 2480 отн. ед., Т max 9 с, tg подъема 257,8, tg спада - 134,4, S 11590 отн. ед., что свидетельствует о наличии активности перекисного окисления липидов в ногтевых пластинках данного пациента (фиг. 3).

Таким образом, предлагаемый способ неивазивный, прост и быстр в выполнении, позволяет определять наличие активности перекисного окисления липидов в дериватах кожи - ногтевых пластинках, может применяться в дерматовенерологии, клинической фармакологии, клинической лабораторной диагностике, биофизике, биохимии для хемилюминесцентного анализа ногтевых пластинок с целью определения уровня свободнорадикальных процессов при различных патологических состояниях, скорости окисления липидов, общей антиоксидантной активности, скорости ингибирования свободнорадикальных процессов, изучения действия фармакологических препаратов с антиоксидантными и прооксидантными свойствами.