Способ восстановления функциональных свойств тканеинженерной конструкции диафрагмы

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, торакальной хирургии, педиатрии для создания тканеинженерной конструкции в качестве трансплантата для замещения врожденных и/или приобретенных дефектов диафрагмы с восстановлением функционального состояния нативного органа. Тканевая инженерия является весьма перспективным направлением в репарации или замещении поврежденных органов и тканей и включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) и/или искусственных каркасов (носителей), а также оценку и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними. Для исключения развития реакции отторжения биологические каркасы подвергают децеллюляризации при условии сохранения исходной трехмерной структуры ткани и внеклеточного матрикса (ВКМ). В течение последних лет каркасы, полученные путем децеллюляризации успешно используют для замещения утраченных или поврежденных органов и тканей, в том числе, диафрагмы, сосудов и др. [Conconi М.Т. et al. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineering approach to abdominal wall-defect repair // Biomaterials. 2005. Vol. 26 (15). P. 2567-2574; Kannan R.Y. et al. The roles of tissue engineering and vascularisation in the development of micro-vascular networks: a review //Biomaterials. 2005. Vol. 26 (14). P. 1857-1875; Quint C. et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108: 9214-9219]. В настоящее время большой интерес представляет попытка создания функционирующей скелетной мускулатуры, так как именно восстановление функции и отсутствие фибротического перерождения является основной проблемой регенерации мышцы. Тканевая инженерия мышечной ткани потенциально может быть использована для замещения крупных врожденных дефектов и восстановления функционального состояния органа благодаря использованию каркасов, поддерживающих миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток, способных полноценно выполнять нативные функции.

Диафрагма представляет собой мышечный орган, главными функциями которого является участие в акте дыхания с сокращением при вдохе и расслаблением на выдохе.

В литературе описано множество малоинвазивных хирургических методов для реконструкции врожденных и приобретенных дефектов диафрагмы у детей и взрослых. К сожалению, хирургические вмешательства с использованием естественных или искусственных лоскутов ткани сопряжены с риском повторного возникновения дефекта и высоким уровнем заболеваемости и смертности.

Известен способ создания трансплантата диафрагмы таза с матрицей-носителем [Гольдштейн Д.В. и др. Трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани и способ его получения. Патент РФ №2330675. Опубл. 10.08.2008. Бюл. №22], который характеризуется исключительно восстановлением дефектов соединительной ткани, но при этом абсолютно не содержит мышечных клеток и неспособен, соответственно, осуществлять функциональную активность, связанную с сокращением, что является ключевым требованием для тканеинженерной конструкции при восстановлении мышечной диафрагмы, расположенной между грудной и брюшной полостями и участвующей в акте дыхания и других физиологических процессах.

Тканеинженерный подход, который предполагает использование биологических каркасов для замены или восстановления диафрагмальных дефектов, может избавить от необходимости использовать несоответствующие аутологичные замещающие ткани или имплантировать синтетические нежизнеспособные материалы. Применение таких конструкций позволило бы решать как этические, так и иммунологические проблемы трансплантологии. Неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру внеклеточного матрикса привела к необходимости использования децеллюляризированных естественных внеклеточных матриксов, полученных от доноров, либо матриксов, полученных из полимерных материалов, и полностью воспроизводящих структуру нативного органа. В настоящее время осуществляют попытки поиска клеток, способных дифференцироваться в мышечную ткань и выполнять сократительные функции. Результаты работы показали, что децеллюляризированный матрикс не является токсичным для клеток и способствует клеточной адгезии. Но вопрос о механизмах взаимодействия получаемых каркасов и клеток, способных сохранять не только жизнеспособность на децеллюляризированном матриксе, но и потенцию к дифференцировке в зрелую мышечную ткань, способную функционировать подобно нативной диафрагме, а также сроках появления функционирующих тканеинженерных конструкций в моделях ин витро и ин виво по-прежнему остается открытым. С учетом высокой смертности от врожденных и приобретенных дефектов диафрагмы, весьма актуальной является разработка способа создания тканеинженерной конструкции для протезирования и восстановления функциональных свойств нативного органа, особенно в педиатрической практике.

В частности, известен способ децеллюляризации диафрагмы [Conconi М.Т. et al. Homologous muscle acellular matrix seeded with autologous myoblasts as a tissue-engineering approach to abdominal wall-defect repair // Biomaterials. 2005 Vol. 26 (15). P. 2567-2574]. Протокол включает в себя обработку биологического матрикса фосфатным буфером, очищенной водой, детергентами и ферментами: 4% раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой типа I в течение 93 часов. Контроль качества полученного каркаса определяют рутинными гистологическими методами. Основными недостатками данного способа являются:

1) длительность проведения децеллюляризации, повышающая риск бактериальной контаминации;

2) отсутствие комплексного подхода при оценке качества выполненной децеллюляризации, так как способ предусматривает контроль получаемого биоинженерного каркаса диафрагмы только по данным гистологического исследования, что влечет за собой повышенный риск послеоперационных осложнений, вплоть до летальности;

3) недостаточная «функциональность» получаемого трансплантата, так как указанная конструкция не способствует восстановлению функциональных свойств нативного органа (сокращения, участия в акте дыхания, поддержания оптимального физиологического газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, участия в качестве одного из ключевых элементов, формирующих и регулирующих внутрибрюшное давление), а может только механически замещать имеющийся дефект;

4) отсутствие регламентированного алгоритма создания и оценки качества получаемой тканеинженерной конструкции приводит к широкой вариабельности механических свойств трансплантата, что в свою очередь может приводить к рецидиву грыжевых выпячиваний и нарушению герметичности грудной полости, требуя повторных оперативных вмешательств, увеличивающих вероятность неблагоприятного исхода при лечении пациентов с дефектами диафрагмы.

Способ неэффективен из-за указанных выше недостатков, поэтому остается актуальной задачей разработка способа создания тканеинженерных конструкций, обеспечивающих восстановление функциональных качеств диафрагмы.

За ближайший аналог принят способ создания тканеинженерной конструкции диафрагмы [Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В. и др. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2012, Том VII, №4, С. 20-27], заключающийся в щадящем способе получения качественного матрикса диафрагмы крыс при обработке нативной диафрагмы очищенной водой, детергентами и ферментами (4% раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой типа 1) при совмещении перфузии и ротации диафрагмы в биореакторе в течение 24 часов. Контроль качества тканеинженерных каркасов проводят путем проведения рутинных гистологических методов окраски, оценки сохранности адекватных биомеханических свойств, жизнеспособности клеток на каркасах [RU 2547799 С1, 10.04.2015].

Основными недостатками данного способа являются:

1) выполнение полученными тканеинженерными конструкциями только механического замещения дефекта, без восстановления функциональных свойств и физиологической целостности органа;

2) определение исключительно тканеспецифической функциональности, заключающейся в оценке проходимости сосудистого русла, но абсолютно без учета функциональных свойств целостной нативной диафрагмы, включая ее сокращение, участие в акте дыхания, способность поддержать оптимальный физиологический газовый состав крови и кислотно-щелочной баланс, а также участие в качестве одного из ключевых элементов в формировании и регуляции внутрибрюшного давления. Таким образом, способ отличается отсутствием функциональных качеств у получаемой тканеинженерной конструкции и неэффективен из-за указанных выше недостатков.

Задача: восстановление функциональных качеств диафрагмы путем создания тканеинженерной конструкции, обладающей функциональными свойствами целостной нативной диафрагмы, включая ее сокращение, участие в акте дыхания, способность поддержать оптимальный физиологический газовый состав крови и кислотно-щелочной баланс, а также участие в качестве одного из ключевых элементов в формировании и регуляции внутрибрюшного давления.

Сущностью предложенного изобретения является то, что после децеллюляризации матрикс последовательно: рецеллюляризируют путем нанесения на него суспензии аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных стволовых клеток (ММСК) костномозгового происхождения, ин витро подтверждают адгезию, жизнеспособность, пролиферацию и способность клеток к направленной дифференцировке на децеллюляризированном матриксе в динамике, после чего тканеинженерную конструкцию ортотопически имплантируют в место предварительно хирургически смоделированного дефекта, через 21 день ин виво проводят функциональные исследования: спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, патоморфологическое исследование эксплантированного графта и их соответствие должностным показателям, а также сократимость мышечной ткани оценивают как восстановление функционального состояния полученной тканеинженерной конструкции, полноценное участие диафрагмы в акте дыхания.

Технический результат способа обусловлен строгой последовательностью получения тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированной диафрагмы, заселенной аллогенными мультипотентными мезенхимными стромальными стволовыми клетками (ММСК) костномозгового происхождения с последующим ин витро подтверждением адгезии, жизнеспособности, пролиферации и дифференцировочного потенциала клеток на децеллюляризированном матриксе в динамике, способной как протезировать анатомический дефект органа, так и восстанавливать его функциональную активность и сократительную способность. Другие использовавшиеся протоколы способствовали созданию конструкций, обеспечивающих лишь механическое замещение дефекта, предлагаемые ранее тканеинженерные конструкции не обеспечивали полноценного участия в актах сокращения и расслабления диафрагмы при дыхании. Также, важным в способе создания тканеинженерной конструкции, в отличие от ближайшего аналога, был выбор наиболее безопасных и приближенных к клиническому использованию клеток, таких как ММСК костномозгового происхождения, которые не только способствуют рецеллюляризации каркаса, но и в предлагаемом способе создают микроокружение, позволяющее привлекать собственные клетки реципиента для более полноценной интеграции тканеинженерного имплантата. После проведения ортотопической трансплантации тканеинженерную конструкцию тщательно проверяют на способность поддерживать функциональную активность, контрактильные свойства, поддержание барьера между грудной и брюшной полостями без выпячиваний, эвентрации, оценивают степень дыхательной недостаточности, а также изменения в газовом составе крови (с целью исключения гиперкапнии и гипоксемии). Еще одним из важнейших особенностей способа является всесторонний патоморфологический анализ эксплантата на степень фиброза, направленности дифференцировки клеток, неоангиогенеза, иннервации, мезотелизации. Технический результат, получаемый от использования данного способа, обеспечен только за счет соблюдения именно такой последовательности приемов.

Способ восстановления целостности и функционального состояния диафрагмы с использованием тканеинженерной конструкции осуществляют следующим образом, в строгой последовательности с разработанным алгоритмом. Для децеллюляризации диафрагмы используют предварительно гепаринизированных крыс (интраперитонеально вводят 100 ЕД гепарина). Диафрагму очищают от жира и промывают стерильным раствором фосфатного буфера. При децеллюляризации диафрагмы применяют ротационный метод с обработкой очищенной водой, стерильными растворами дезоксихолата натрия 4%, фосфатного буфера, свиной панкреатической ДНКазы I, ЭДТА. Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами рутинного гистологического исследования, иммуногистохимического окрашивания и сканирующей электронной микроскопии для подтверждения сохранности архитектоники и компонентов внеклеточного матрикса диафрагмы и отсутствия клеточных элементов на децеллюляризированном матриксе, путем определения предельных биомеханических параметров на одноосное растяжение и циклические испытания на двухосное нагружение с целью обеспечения соответствия биомеханических свойств матрикса нативной ткани. Оценку иммуногенности полученного каркаса проводят с использованием количественного анализа ДНК в децеллюляризированных матриксах, иммуногистохимического исследования на определение компонентов главного комплекса гистосовместимости (MHCI и МНСII класса) по стандартным протоколам, проведением гетеротопических трансплантаций (подкожные тесты) и последующей патоморфологической оценкой эксплантата. Для определения токсичности каркасов и их адгезионных свойств проводят статичное засеивание децеллюляризированных образцов аллогенными ММСК костномозгового происхождения: ММСК культивируют до 3-4 пассажа и используют для засеивания полученных децеллюляризированных матриксов. Жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют путем колориметрического анализа с использованием ХТТ-реагента в целях установления биосовместимости полученного каркаса и проведения последующих экспериментов по рецеллюляризации (Cell proliferation assay ХТТ, AphliChem GmbH, Германия). Также оценивают способность клеток к спонтанной дифференцировки после 3-недельного культивирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуногистохимическим окрашиванием с использованием специфических антител. Рецеллюляризированные матриксы диафрагмы ортотопически трансплантируют крысам с замещением предварительно хирургически смоделированного дефекта около 80% левого купола диафрагмы. Группой сравнения являются ложнооперированные животные, которым дефект замещают нативной тканью. Через 21 день животным проводят функциональные исследования, включающие в себя спирометрию, электромиографию, рентгенологическое исследование, компьютерную томографию, изучение газового состава крови и кислотно-щелочного баланса, а также проводят патоморфологическoе исследование эксплантированного графта. Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (диафрагмы) экспериментальных животных (крысах). Результаты полностью подтверждают решаемые задачи. Получены естественные матриксы органов, с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур, проведена рецеллюляризация, аллогенными ММСК, получена тканеинженерная конструкция, ортотопически имплантированная животным для замещения 80% левого купола. Для создания полноценно функционирующей диафрагмальной мышцы принципиально важным является восстановление не только барьерной функции между грудной и брюшной полостью (адекватная биомеханика тканеинженерной конструкции, отсутствие пневмоторакса, нормальное расположение оси сердца, отсутствие выпячиваний и инвентраций), что обнаружено при проведении компьютерной томографии и рентгенологического исследования, но и принципиально важным является восстановление контрактильных свойств, необходимых для осуществления активного дыхания. Появление мышечных сокращений, сопоставимых с нативной тканью в трансплантате через 21 день после операции, является ключевым результатом предлагаемого способа. При этом в нашем исследовании подчеркивается различие между восстановлением функции в моделях ин витро и ин виво. Под действием естественного микроокружения быстрее происходят процессы регенерации, что способствует адекватному восстановлению функции. Диафрагма должна быть покрыта мезотелием, что обнаружено при проведении биотинового теста. Кроме того, тканеинженерная конструкция должна способствовать сохранности целостности компонентов дыхательной системы, не вызывать развитие дыхательной недостаточности и респираторной и гемодинамической гипоксии. При сравнении спирометрии крысы после ортотопической трансплантации видно, что через 21 день показатели дыхания, отраженные в петле частота-объем статистически не отличаются от интактных (неоперированных) животных.

Пример: диафрагма эксплантирована у крыс-самцов линии Lewis весом 250±20 грамм после предварительного введения летальной дозы барбитуратов (150 мг/кг) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1972 г.), «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986). Сначала диафрагму фиксировали в биореакторе, после чего начали проведение децеллюляризации: в течение 24 часов проводили последовательную обработку децеллюляризирующими растворами: фосфатным буфером, 4% водным раствором дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазой I, очищенной водой, с равной продолжительностью воздействия, что являлось важным для осуществления следующего этапа предлагаемого способа. Далее контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляли методами рутинного гистологического исследования (окрашивание гематоксилин-эозином, по Массону, окрашивание по Ван Гизону); путем биомеханических испытаний при моделировании физиологических условий; определяли способность каркаса вызывать иммунологическое отторжение путем проведения гетеротопических трансплантаций (подкожные тесты) с последующей патоморфологической оценкой степени воспалительной реакции, что является облигатным условием перед проведением следующего этапа рецеллюляризации. Установлено, что в результате экспериментов по децеллюляризации получен каркас диафрагмы с сохранением гистологической архитектоники и белков внеклеточного матрикса, который продемонстрировал биосовместимость и нетоксичность по отношению к клеткам, которыми он был засеян. Рецеллюляризацию децеллюляризированного матрикса проводили с использованием аллогенных ММСК, полученных из костного мозга крыс-доноров и культивированных до 3-4 пассажа. После проведения ин витро тестирования и контроля адгезии, жизнеспособности, пролиферации и способности клеток к направленной дифференцировке, рецеллюляризированный матрикс ортотопически трансплантировали крысе-реципиенту линии Lewis весом 250±20 грамм с хирургически моделированным дефектом левого купола диафрагмы. Далее, через 21 день, выполняли комплексный функциональный контроль ин виво:

- спирометрию - выполнялась на оборудовании Spirometer Power Lab 8/35 (ADInstruments, Австралия),

- электромиографию - выполнялась на оборудовании NeuroBioLab (NeuroBioLab LTD, DL312АМ-401, Россия),

- рентгенологическое исследование - проводилось во фронтальной проекции на оборудовании Axion Icon R200 (Германия),

- компьютерную томографию - выполнялась в положении лежа на конусно-лучевом томографе Rayscan Symphony V (Samsung Electronics, Южная Корея),

- регистрацию газового состава крови и кислотно-щелочного баланса - проводили на оборудовании Radiometer ABL800 Flex (Radiometer Medical ApS, Дания),

- патоморфологическое исследование эксплантированного графта. Таким образом, на основании совокупности выполненных в строгой последовательности действий по созданию тканеинженерной конструкции и комплексной оценки качества полученного трансплантата удалось достичь положительного (эффективного технического) результата, как в механическом восстановлении целостности диафрагмы данного животного с хирургически моделированным дефектом ее левого купола, так и функциональном соответствии сократительной и дыхательной активности восстановленного органа нативной ткани диафрагмы.