Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам получения вакцин, может быть использовано в учреждениях, занимающихся созданием вакцинных препаратов для профилактики смешанных кишечных инфекций у телят и поросят.

Установлено, что в последние годы в нозологическом профиле инфекционных заболеваний молодняка крупного рогатого скота и свиней превалируют колибактериоз, стрептококкоз и энтерококковая инфекция (Арбузова А.А. Этиологические аспекты возникновения желудочно-кишечных заболеваний телят раннего постнатального периода / Ученые записки Казанской ГАВМ. - 2010. Т. 200. С. 11-17; Спиридонов А.Г., Махмутов А.Ф. Этиология инфекционных диарей новорожденных поросят и телят / Ветеринарная медицина. 2011. В. 95. С. 264-265; Терехов В.И., Иванов А.В. Видовой состав бактерий, выделенных от поросят при острых кишечных заболеваниях / Ветеринария Кубани, 2011. №3. С. 23-25; Ефанова Л.И., Манжурина О.А., Степанов А.В. Этиологическая структура факторных инфекций свиней и крупного рогатого скота в хозяйствах ЦЧЗ России / Вестник Курской ГСХА, 2012. №12. С. 71-72; Терехов В.И. Этиология и эпизоотология желудочно-кишечных болезней новорожденных телят / Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2012. №1. С. 15). Данные заболевания протекают, как правило, в ассоциации, поэтому применение ассоциированных вакцин, включающих антигены разных возбудителей, является более предпочтительным, чем использование моновакцин, поскольку в этом случае одновременно создается напряженный иммунитет в отношении возбудителей сразу нескольких инфекционных болезней. Кроме того, в связи с вариабельностью и постоянным изменением антигенного состава возбудителей кишечных инфекций у молодняка крупного рогатого скота и свиней применяемые ассоциированные вакцины должны содержать антигены, соответствующие антигенам возбудителей, выделяемых из конкретного эпизоотического очага, либо содержать набор антигенов, общих для большинства основных возбудителей.

Известна вакцина, ассоциированная против диареи телят (патент РФ на изобретение №2035916 от 17.06.1993, МКИ A61K 39/116), которая содержит смесь микробных суспензий энтеробактерий Escherichia coli 09: K99, Е. coli 0138: K88, Е. coli 200, Salmonella typhimurium 195, S. dublin 196, S. enteritidis 197, Klebsiella pneumoniae 201, 202, Proteus vulgaris 198 и P. mirabilis 199, инактивированных этанолом и депонированных на гидроокиси алюминия. Данная вакцина предназначена для специфической профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции только у телят, однако она не защищает животных от стрептококковой и энтерококковой инфекций, кроме того, она не предназначена для защиты поросят.

Известна вакцина, ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят (патент РФ на изобретение №2129441 от 10.12.97, МКИ А61К 39/116, К39/08, К39/108). Эта вакцина содержит клостридиозный компонент, представленный антигенами клостридий (суспензией клеток и В-токсином штамма Clostridium perfingens типа С N3), а также сложный эшерихиозный компонент, включающий набор соматических антигенов (078, 0141), белковых адгезивных антигенов (К88, К99, 987Р, F41), полисахаридных капсульных антигенов (К80, К87), термостабильные и термолабильные анатоксины в соотношении 1:1, инактивированные формалином, с добавлением адъюванта - геля гидроокиси алюминия. Данная вакцина обеспечивает широкий спектр иммуногенности против энтеротоксемии и эшерихиоза, но не создает иммунитета против стрептококкоза и энтерококковой инфекции. К тому же она предназначена только для защиты поросят, но не телят.

Известна вакцина, ассоциированная против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий (патент РФ на изобретение №2316344 от 19.07.2006, МПК А61К 39/112, 116, 108, 09, А61Р 31/04). Данная вакцина в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистых культур Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus faecalis, полученных путем отбора пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготовления суспензии с последующим посевом на дифференциально-диагностические среды. Выделенные чистые культуры раздельно выращивают в мясопептонном бульоне с добавлением глюкозы до концентрации микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³ и смешивают в равных соотношениях. Инактивируют формалином до 0,4-0,6%-ной конечной концентрации. Выдерживают при температуре 37°С в течение 72-96 часов. Смешивают культуры в равных соотношениях. Вакцина также содержит формалин, глюкозу, гидроокись алюминия и обладает высокой специфичностью и иммуногенностью. Однако представленная вакцина против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции применима в качестве средства специфической профилактики только для нутрий и не предусматривает использование для профилактики обозначенных инфекций у телят и поросят.

Известен способ изготовления ассоциированной вакцины против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят (патент РФ на изобретение №2429012 от 20.09.2011, МПК А61К 39/116, 108, 09 - прототип), согласно которому вакцина, ассоциированная против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят, включает получение антигенов и инактивацию их формалином, при этом предварительно проводят выделение из пораженных органов телят и поросят эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus fecalis, раздельно их выращивают на питательном бульоне при температуре 37°С, при этом культуры Escherichia coli в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus fecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных тел в 1 мл, раздельно инактивируют формалином до концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, после чего смешивают культуры в равных объемах, фасуют и укупоривают.

Недостатком известного способа является то, что в полученной вакцине содержится большое количество балластных клеток Escherichia coli, несущих лишнюю антигенную нагрузку, что негативно сказывается на формировании у животных иммунной защиты против токсинов кишечной палочки, стрептококков и энтерококков, кроме того, данная вакцина может быть реактогенна.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности специфической профилактики колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции у телят и поросят, повышение безопасности и безвредности вакцины.

Технический результат достигается тем, что в способе получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят, включающем получение антигенов путем выделения из пораженных органов телят и поросят эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивание которых проводят раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, затем их инактивируют формалином до его конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, согласно изобретению после инактивации формалином антигенов осуществляют стерилизующую фильтрацию бульонной культуры Escherichia coli для получения бесклеточной культуральной среды, содержащей токсины Escherichia coli, которую смешивают с культуральными средами, содержащими клетки гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Новизна технического решения заключается в том, что за счет использования бесклеточных культур эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитических штаммов Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, инактивированных формалином, обеспечивается повышение эффективности профилактики кишечных инфекций у телят и поросят, а также безвредность биопрепарата за счет отсутствия после применения поствакцинальных реакций.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.

Предложенный способ получения вакцины соответствует критерию «промышленная применимость», поскольку легко воспроизводим, не требует сложного технологического оборудования и условий.

Способ получения вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции осуществляют следующим образом.

Первоначально среди эпизоотических штаммов Escherichia coli, изолированных от павших телят и поросят, проводят отбор тех из них, которые обладают генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов. Для этого можно использовать тест-системы «АмплиСенс E. coli-tox» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва) либо определить наличие токсинообразования с помощью биотеста на инфузориях-стилонихиях (патент РФ на изобретение 2262529 от 20.10.2005, МПК C12N 1/10, C12Q 1/10). А среди эпизоотических штаммов стрептококков и энтерококков отбирают гемолитические варианты Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis. Отобранные штаммы по отдельности засевают в пробирки с 10 мл питательного бульона, в состав которого входят кислотный гидролизат крови (9-11%), аутолизат пекарских дрожжей (9-11%), пептон (0,9-1,1%), натрия хлорид (0,4-0,6%), двузамещенный фосфорнокислый натрий (0,05-0,15%) и калия хлорид (0,01-0,03%) (патент РФ на изобретение 2342425 от 27.12.2008, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04), после чего их помещают в термостат и культивируют при 37°С в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Затем полученные культуры переносят в колбы с 200-300 мл аналогичного питательного бульона и инкубируют при 37°С: штаммы Escherichia coli в течение 7 дней, а штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до достижения концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивают. По окончании инкубации в культуры добавляют формалин до концентрации 0,3-0,4% и инактивируют в течение 14 суток при температуре 37°С с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур Escherichia coli объединяют и с помощью стерилизующей фильтрации отделяют микробную массу от среды культивирования, получая, таким образом, бесклеточную культуральную среду Escherichia coli (колибактериозный антигенный компонент). Далее бесклеточную культуральную среду Escherichia coli и бульонные культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis соединяют при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Полученную вакцину фасуют по 100 мл в стерильные флаконы, укупоривают и проверяют на стерильность и безвредность. По внешнему виду готовая вакцина представляет собой жидкость светло-коричневого цвета с рыхлым беловато-серым осадком, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Срок хранения в сухом и темном помещении при температуре 4-10°С 1 год.

Полученная вакцина предназначена как для профилактики колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции у телят и поросят, протекающих как в виде мононоинфекций, так и в виде ассоциированных инфекций. Вакцина ареактогенна и безвредна. Вакцину применяют в неблагополучных по кишечным инфекциям телят и поросят хозяйствах.

Вакциной прививают стельных коров и нетелей дважды подкожно первый раз за 30, а второй раз за 15 дней до отела в дозе 5 и 10 мл соответственно; телят также прививают дважды, первый раз в возрасте 15-20 дней, а второй через 10-14 дней в дозе 1 и 2 мл соответственно.

Супоросным свиноматкам вакцину вводят внутримышечно дважды, первый раз за 30 дней, а второй раз за 20 дней до опороса в дозе 5 мл; поросят прививают первый раз в возрасте 15-17 дней, а второй в возрасте 28-30 дней в дозе 0,25 и 0,5 мл соответственно.

Использование вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции позволяет обеспечить защиту телят и поросят сразу от трех опасных инфекционных болезней: колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции, продолжительностью не менее 10 месяцев (срок наблюдения).

Эффективность вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции зависит от свойств подобранных эпизоотических штаммов Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, последовательности приготовления и процентного соотношения компонентов, входящих в ее состав.

Приведено пять примеров зависимости эффективности вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции телят и поросят от соотношения заявленных компонентов из расчета на 100 мл вакцины и два примера демонстрирующих сравнительную эффективность использования заявляемого изобретения.

Пример 1

Берут эпизоотические штаммы Escherichia coli, продуцирующие термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитические штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивают раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, отделяют бактериальную массу Escherichia coli с помощью стерилизующей фильтрации, после чего полученные культуры смешивают при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При данном соотношении компонентов вакцина обладает слабой протективной активностью и защищает от кишечной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, телят в 77%, а поросят в 70% случаев.

Пример 2

Берут эпизоотические штаммы Escherichia coli, продуцирующие термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитические штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивают раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, отделяют бактериальную массу Escherichia coli с помощью стерилизующей фильтрации, после чего полученные культуры смешивают при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При данном соотношении компонентов вакцина защищает от кишечной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, телят в 88%, а поросят в 84% случаев.

Пример 3

Берут эпизоотические штаммы Escherichia coli, продуцирующие термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитические штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивают раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, отделяют бактериальную массу Escherichia coli с помощью стерилизующей фильтрации, после чего полученные культуры смешивают при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При данном соотношении компонентов вакцина защищает от кишечной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, телят в 93%, а поросят в 88% случаев.

Пример 4

Берут эпизоотические штаммы Escherichia coli, продуцирующие термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитические штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивают раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, отделяют бактериальную массу Escherichia coli с помощью стерилизующей фильтрации, после чего полученные культуры смешивают при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При данном соотношении компонентов вакцина защищает от кишечной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, телят в 96%, а поросят в 92% случаев.

Пример 5

Берут эпизоотические штаммы Escherichia coli, продуцирующие термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, гемолитические штаммы Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, выращивают раздельно на питательном бульоне, при этом культуры Escherichia coli выращивают в течение 7 дней, а культуры Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis в течение 24 ч до концентрации 5-6 млрд микробных клеток в 1 мл, после чего их инактивируют формалином до конечной концентрации 0,3-0,4% в течение 14 суток, отделяют бактериальную массу Escherichia coli с помощью стерилизующей фильтрации, после чего полученные культуры смешивают при следующем соотношении компонентов, мас. %:

При данном соотношении компонентов вакцина защищает от кишечной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, Streptococcus bovis и Enterococcus faecalis, телят в 89%, а поросят в 82% случаев. На месте введения у отдельных животных, особенно из числа поросят, развились плотные болезненные припухлости.

Пример 6

В хозяйстве Краснодарского края, неблагополучном по острым кишечным заболеваниям телят, провели производственное испытание заявляемой вакцины. По данным ветеринарной лаборатории диарею у молодняка крупного рогатого скота в данном хозяйстве вызывают патогенные штаммы кишечной палочки и стрепто- и энтерококки. Эффективность вакцины, изготовленной по заявляемому способу, сравнивали с эффективностью прототипа, для этого было сформировано 3 группы стельных коров по 25 голов в каждой.

Первую группу коров иммунизировали заявляемой вакциной первый раз за 30 дней до отела в дозе 5 мл, второй раз за 15 дней до отела в дозе 10 мл. Полученных от этих коров телят также иммунизировали заявляемой вакциной первый раз в возрасте 15-20 дней в дозе 1 мл, а второй через 10-15 дней в дозе 2 мл. Вакцину вводили подкожно в область верхней трети шеи.

Вторую группу коров и полученных от них телят иммунизировали прототипом по схеме и в дозах, аналогичных в первой группе.

Третья группа коров была контрольной, они и полученные от них телята не иммунизировались.

Эффективность вакцин оценивали по достижении телятами 3-месячного возраста и перевода их в другой корпус на групповое содержание. Критериями оценки служили показатели заболеваемости и летальности.

Результаты опыта отражены в таблице, из материалов которой видно, что в первой группе острая кишечная инфекция была зарегистрирована у 2 телят, при этом диарею у них удалось купировать в течение 3 дней, а на 5 день телята полностью выздоровели. Таким образом, профилактическая эффективность заявляемой вакцины составила 92%.

Во второй группе острая кишечная инфекция была зарегистрирована у 5 телят, причем у одного теленка она протекала очень тяжело и закончилась гибелью животного. Профилактическая эффективность прототипа составила 80%.

В третьей группе из 25 телят заболело 18 животных, из которых 5 пали. Таким образом, в 3 группе заболеваемость составила 72%, а летальность - 27,8%, что свидетельствует о значительной тяжести болезни.

Следовательно, применение вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции, полученной по заявляемому способу, позволило более эффективно профилактировать заболевание телят острыми кишечными инфекциями. Заболеваемость телят, привитых заявляемой вакциной, составила 8%, а сохранность 100%, тогда как при использовании прототипа заболеваемость телят составила 20%, а сохранность 96%. В контрольной группе заболеваемость телят острой кишечной инфекцией составила 72%, а сохранность 80%.

Пример 7. Обоснование эффективности использования вакцины для профилактики острых кишечных заболеваний поросят

В хозяйстве длительно неблагополучном по острым кишечным заболеваниям поросят сформировали 3 группы супоросных свиноматок по 5 животных в каждой.

В первой группе (опытная) свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали предлагаемой вакциной. Свиноматок иммунизировали первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5 мл, второй раз - за 20 дней в дозе 5 мл внутримышечно в область основания ушной раковины. Поросят иммунизировали дважды первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 дней внутримышечно в области внутренней поверхности бедра.

Свиноматок второй группы (положительный контроль) вакцинировали вакциной ОКЗ производства ООО «АГРОВЕТ» (г. Москва) согласно инструкции, а именно двукратно за 30 и 40 дней до опороса в дозе 5 мл подкожно. Поросят, полученных от данных свиноматок, вакцинировали первый раз в возрасте 25-27 дней, второй раз в возрасте 35-37 дней подкожно в дозе 1,0 мл.

В третьей группе (отрицательный контроль) ни свиноматок, ни полученных от них поросят не вакцинировали.

За поросятами в течение 90 дней вели клиническое наблюдение, учитывали количество заболевших и павших животных. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 2. Из материалов таблицы видно, что в 1-й группе от 5 свиноматок было получено 53 поросенка, из которых заболело 8 голов и пало 2. Заболеваемость по группе составила 15,1%, смертность 3,8%. Следовательно, профилактическая эффективность заявляемого способа составила 84,9% при сохранности поросят в группе 96,2%.

Во 2-й группе, где свиноматки иммунизировались вакциной ОКЗ, родилось 52 поросенка, из которых 17 заболело и 5 пало. Заболеваемость по этой группе составила 32,7%, смертность 9,6%, профилактическая эффективность вакцины ОКЗ 67,3% при сохранности 90,4%.

В 3-й группе было получено 53 поросенка, из них 28 заболело, 9 пало. Заболеваемость составила 52,8%, смертность 17%, а сохранность 83%.

Следовательно, заявляемый способ профилактики острых кишечных заболеваний позволил снизить заболеваемость по сравнению с прототипом на 17,6%, а в сравнении с группой отрицательного контроля на 37,7%, при этом падеж сократился в 2,5-4,5 раз, что свидетельствует о его высокой эффективности.