КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НОРМАЛЬНОЙ ТКАНИ ИЗ ФИБРОЗНОЙ ТКАНИ

Область техники

Настоящее изобретение касается композиции и способа для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани.

Уровень техники

Фиброз ткани вызывается чрезмерным продуцированием и накоплением в ткани внеклеточного матрикса, который представляет собой, главным образом, коллаген. Когда ткань повреждается стимулом, таким как оксидантный стресс, гипоксия, воспаление или апоптоз, поврежденная ткань восстанавливается посредством замены внеклеточным матриксом, но в случае повреждения, являющимся серьезным или в случае такой стимуляции, которая становится хронической, накопление внеклеточного матрикса становится чрезмерным, и ткань не может выполнять свою функцию в достаточной степени. Фиброз наблюдается в различных типах органов, таких как печень, поджелудочная железа, легкое, почка, костный мозг и сердце, и считается, что продуцирующие коллаген клетки, такие как миофибробласты связаны с болезненным состоянием. Традиционно считается, что фиброз является необратимым явлением, и после того как ткань стала фиброзной, она не возвращается к ее исходному состоянию, но недавно появились сообщения, предполагающие, что фиброз является обратимым процессом, и что, когда вышеупомянутый фиброзный стимул исчезает, внеклеточный матрикс, аккумулированный в ткани, уменьшается (см. непатентные документы 1-3).

Однако не было никаких подробных отчетов относительно того, что специфически происходит в ткани после того, как патологические накопления внеклеточного матрикса уменьшаются, и было абсолютно неизвестно до сих пор, происходит ли восстановление нормальной ткани или является ли восстановление нормальной ткани возможной.

Кроме того, фиброз ткани не только включает фиброзы, для которых причина болезни ясна и может быть уничтожена, такие как фиброз, полученный вследствие вирусной инфекции, потребления спирта, лекарственных препаратов и т.д., но также и включает фиброзы, для которых непосредственная причина болезни неясна, такие как, например, криптогенный цирроз печени, идиопатический легочный фиброз, или идиопатический миелофиброз и те, для которых известна непосредственная причина болезни, но происхождение причины болезни является неясным или является трудным для элиминирования, такие как, например, первичный желчный цирроз печени, цирроз печени вследствие неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) и первичный склерозирующий холангит. Ткань с присутствием такого фиброза, для которого трудно уничтожить причину болезни, находится в состоянии, в котором она всегда подвергается фиброзному стимулу, но было абсолютно неизвестно до сих пор, что патологическое накопление внеклеточного матрикса в такой фиброзной ткани может быть восстановлено, и естественно не было известно, что ткань может быть регенерирована.

Документы известного уровня техники

Непатентные документы

Непатентный документ 1 Issa et al. Gastroenterology. 2004; 126(7):1795-808

Непатентный документ 2 Iredale, J Clin Invest. 2007; 117(3):539-48

Непатентный документ 3 Sato et al. Nat Biotechnol. 2008; 26(4):431-42

Краткое изложение сущности изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Задачей настоящего изобретения является композиция и способ для терапевтической восстановления ткани, в которой присутствует фиброз, в нормальную ткань.

Средства для решения проблем

В то время как осуществлялись интенсивные исследования для решения вышеупомянутых проблем, изобретатели настоящего патента нашли, что даже в фиброзной ткани, которая непрерывно получает фиброзный стимул, коллаген, накопленный в ткани, может быть восстановлен и, кроме того, нормальная ткань может быть регенерирована из фиброзной ткани посредством удаления коллагена, накопленного в ткани, что гарантирует, что существует пространство, в котором стволовые клетки могут расти и дифференцироваться, и таким образом было сделано настоящее изобретение. Как описано выше, хотя известно, что когда фиброзный стимул исчезает, внеклеточный матрикс, накопленный в ткани, может уменьшиться, до сих пор абсолютно неизвестно, что в фиброзной ткани, которая непрерывно получает фиброзный стимул, коллаген, накопленный в ткани, может редуцироваться, и что нормальная ткань может быть регенерирована из фиброзной ткани, посредством активного удаления коллагена, накопленного в ткани, и это является неожиданными результатами.

Таким образом, настоящее изобретение касается следующего.

(1) Фармацевтическая композиция для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани, содержащая вещество, уменьшающее коллаген.

(2) Фармацевтическая композиция по п. (1), приведенному выше, в которой вещество, уменьшающее коллаген, выбирается из группы, состоящей из супрессора продуцирования коллагена продуцирующими коллаген клетками, стимулятора разложения коллагена и супрессора ингибитора разложения коллагена.

(3) Фармацевтическая композиция по п. (1) или (2), приведенных выше, в которой она дополнительно содержит нацеливающее вещество для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани.

(4) Фармацевтическая композиция по п. (3), приведенному выше, в которой нацеливающий агент является ретиноидом.

(5) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (1)-(4), приведенных выше, в которой фиброзная ткань непрерывно получает фиброзный стимул.

(6) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (1)-(5), приведенных выше, предназначенная для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани в пространстве для роста и дифференцировки стволовых клеток, причем пространство формируется посредством уменьшения коллагена, накопленного в фиброзной ткани.

(7) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (2)-(6), приведенных выше, в которой супрессор продуцирования коллагена продуцирующими коллаген клетками выбирается из группы, состоящей из ингибитора TGFβ, HGF или вещества, способствующего продуцированию вышеперечисленного, лиганда PPARγ, ингибитора ангиотензина, ингибитора PDGF, релаксина или вещества, способствующего продуцированию вышеперечисленного, вещества, которое ингибирует продуцирование и секрецию компонента внеклеточного матрикса, супрессора клеточной активности, супрессора роста клеток, и вещества, индуцирующего апоптоз.

(8) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (2)-(6), приведенных выше, в которой стимулятором разложения коллагена является коллагеназа или стимулятор продуцирования коллагеназы.

(9) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (2)-(6), приведенных выше, в которой супрессором ингибитора разложения коллагена является ингибитор TIMP.

Эффекты изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, становится очевидным, что нормальная ткань может быть регенерирована из фиброзной ткани, причем до сих пор считалось, что восстановление нормальной ткани из нее произойти не может. Это позволяет нормальной ткани быть терапевтически регенерированной из фиброзной ткани, и становится возможной новая регенеративная терапия для фиброзной болезни.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, становится возможным лечить фиброзную ткань, которая непрерывно подвергается фиброзному стимулу, и так как лечение реализуется для всех типов фиброзных болезней, включая фиброзную болезнь, для которой не существует никакой обычной эффективной терапии, и фиброзной болезни, для которой существует только лечение, включающее трансплантацию органа, может ожидаться огромный вклад в медицинское и ветеринарное лечение.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является фотографической диаграммой, показывающей общий внешний вид печени, полученной от подопытных крыс и окрашенных азаном изображений их репрезентативных срезов.

Фиг. 2 является фотографической диаграммой, показывающей локализацию α-SMA в репрезентативных срезах печени, полученных от подопытных крыс.

Фиг. 3 является флуоресцентным изображением, показывающим локализацию DAPI и GFP в местах трансплантации стволовых клеток печени.

Фиг. 4 показывает светлопольные изображения и флуоресцентные изображения GFP в местах трансплантации стволовых клеток печени.

Фиг. 5A является фотографической диаграммой, сравнивающей флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное с помощью антитела GFAP в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (200× увеличение).

Фиг. 5B является фотографической диаграммой, сравнивающей флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом GFAP в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (400× увеличение).

Фиг. 6 является фотографической диаграммой с 200× увеличением, сравнивающая флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное α-SMA антителом в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46.

Фиг. 7 является фотографической диаграммой с 200× увеличением, сравнивающая флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное альбуминовым антителом в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46.

Фиг. 8 представляет собой фотографическую диаграмму с 200× увеличением, сравнивающую флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом СК19 в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46.

Фиг. 9A является фотографической диаграммой, сравнивающей флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом ve-CAD в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (200× увеличение).

Фиг. 9B является фотографической диаграммой, сравнивающей флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом ve-CAD в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (400× увеличение).

Фиг. 10 является фотографической диаграммой с 200× увеличением, сравнивающая флуоресцентные изображения DAPI и GFP и изображение, флуоресцентно окрашенное альбуминовым антителом в месте группы, обработанной VA-lip миPHKgp46, куда стволовые клетки печени не трансплантировали.

Фиг. 11 является флуоресцентным изображением, показывающим внутриклеточное распределение миРНК, меченной FAM, в звездчатых клетках крысиной поджелудочной железы.

Фиг. 12 является графиком, показывающим результат FACS-анализа относительно миРНК, включенной в звездчатые клетки поджелудочной железы крысы. Соответственно показанные в последовательности сверху являются результатами необработанной группы, группы, обработанной Lip siRNAgp46-FAM, группы, обработанной VA-lip siRNAgp46-FAM, группы, обработанной VA-lip siRNAgp46-FAM + RBP антитела, и группы, обработанной Lip siRNAgp46-FAM + RBP антитела.

Фиг. 13 является изображением Вестерн-блоттинга, показывающим супрессию экспрессии gp46 в звездчатых клетках крысиной поджелудочной железы посредством миPHKgp46. А показывает различие в эффекте подавления в зависимости от концентрации VA-lip siRNAgp46 и В показывает продолжительность эффекта подавления.

Фиг. 14 является графиком, показывающим количественные величины коллагена, продуцированного через 72 часа необработанными клетками, и клетками, обработанными каждой из VA-lip миPHKgp46 и VA-lip миРНК случайным образом.

Фиг. 15 является фотографической диаграммой, показывающей специфическую доставку VA-lip миPHKgp46 к звездчатым клеткам поджелудочной железы у DBTC-обработанных крыс. А и В являются изображениями иммуноокрашенных посредством анти-/U03B1/SMA антитела и анти-FITC антитела срезов поджелудочной железы крысы, которые обрабатывали три раза через день VA-lip миPHKgp46-FITC и Lip миPHKgp46-FITC соответственно. Окрашенные изображения а-d справа является увеличенными изображениями областей, обозначенных соответствующими символами на окрашенном изображении слева. С показывает изображения, окрашенные посредством окрашивания по Azan-Mallory, посредством окрашивания анти-/U03B1/SMA антителом и посредством окрашивания анти-FITC антителом срезов печени крысы, которые обрабатывали три раза через день VA-lip миPHKgp46-FITC. D-F являются окрашенными изображениями посредством окрашивания антителом анти-CD68 и антителом анти-FITC легкого крысы, селезенки и сетчатки спустя 24 часа после внутривенного введения VA-lip миPHKgp46-FITC.

Фиг. 16 является диаграммой, показывающей экспрессию белка gp46 в поджелудочной железе спустя 0, 1, 2, 3 и 4 дня после введения VA-lip миPHKgp46 крысам, в которые ввели VA-lip миPHKgp46 (миРНК 0,75 мг/кг) на 14-ый день после обработки DBTC. А показывает результат Вестерн-блоттинга клеточного дебриса поджелудочной железы, и В показывает результат количественного концентрационного анализа с использованием β-актина для нормирования.

Фиг. 17 является диаграммой, показывающей эффект VA-lip миPHKgp46 при DBTC-вызванном фиброзе поджелудочной железы. А показывает изображения, окрашенные по Azan-Mallory, срезов поджелудочной железы крысы, обработанной DBTC, в которую вводили 10 раз каждого из VA-lip миPHKgp46, Lip миPHKgp46 и PBS. В является графиком, показывающим количественное определение с помощью компьютерного анализа изображения областей, которые показали положительное окрашивание по Azan-Mallory изображения А. Данные были вычислены от 6 областей, случайным образом выбранных от шести крыс каждой группы, и выражены как средние значения ± стандартные отклонения. С является графиком, показывающим содержание гидроксипролина в поджелудочной железе. Данные выражены как средние значения ± стандартные отклонения.

Фиг. 18 является диаграммой, показывающей эффект VA-lip миPHKgp46 при DBTC-вызванном фиброзе поджелудочной железы. А показывает изображения α-SMA окрашивания поджелудочной железы DBTC-обработанных крыс после обработки VA-lip миPHKgp46. В является графиком, показывающим количественное определение посредством компьютерного анализа изображения α-SMA-позитивных областей в А. Данные были вычислены от 6 областей, случайным образом выбранных от шести крыс каждой группы, и выражены как средние значения ± стандартные отклонения.

Фиг. 19 является диаграммой, показывающей восстановление нормальной ткани из фиброзной ткани поджелудочной железы с помощью VA-lip миPHKgp46. А показывает окрашенные гематоксилином-эозином изображения поджелудочной железы DBTC-обработанных крыс, в которые VA-lip миPHKgp46 (справа) и Lip миPHKgp46 (слева) были введены 10 раз. Нижние диаграммы являются увеличенными диаграммами каждой области а и b верхних диаграмм. В является графиком, показывающим массу поджелудочной железы DBTC-обработанных крыс.

Фиг. 20 является графиком, показывающим эффект на дифференцировку стволовых клеток в присутствии или отсутствии пространства вокруг стволовых клеток. Ордината показывает альбумин-положительную область колонии.

Фиг. 21 является графиком, показывающим эффект на дифференцировку стволовых клеток в присутствии или отсутствии пространства вокруг стволовых клеток. Ордината показывает индекс скорости роста стволовых клеток.

Способы выполнения изобретения

Настоящее изобретение касается композиций, содержащих вещество, уменьшающее коллаген, для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани.

В настоящем изобретении «вещество, уменьшающее коллаген» означает любое вещество, которое может уменьшить количество коллагена, накопленного в ткани. Хотя не подразумевается, что нижесказанное связано с конкретной теорией, так как считается, что одной из причин накопления коллагена в фиброзной ткани, является изменение баланса между продуцированием и разложением коллагена в сторону продуцирования, вещество, уменьшающее коллаген, может включать не только супрессор продуцирования коллагена, но также и стимулятор разложения коллагена и супрессор ингибитора стимулятора разложения коллагена. Поэтому примеры вещества, уменьшающего коллаген, включают, но не ограничиваются этим: супрессор продуцирования коллагена продуцирующими коллаген клетками, стимулятор разложения коллагена и супрессор ингибитора разложения коллагена. Хотя не существует никакого особого ограничения, коллаген в настоящем изобретении предпочтительно является коллагеном, вовлеченным в фиброз, таким как коллаген типа I, III или V, и особенно предпочтительно коллаген типа I, который присутствует в фиброзной ткани в наибольшем количестве.

В настоящем изобретении продуцирующие коллаген клетки означают любые клетки, которые продуцируют коллаген в фиброзной ткани, и примеры включают, но не ограничиваются этим: активированные звездчатые клетки и миофибробласты. Считается, что активированные звездчатые клетки и миофибробласты являются главными источниками, продуцирующие коллаген в фиброзной ткани, и они характеризуются экспрессией α-SMA (гладкомышечного α-актина). Поэтому активированные звездчатые клетки и миофибробласты в настоящем изобретении идентифицируются посредством иммуноокрашивания и т.д. с использованием анти-/U03B1/SMA антитела, которое является детектируемо меченным.

Супрессор продуцирования коллагена продуцирующими коллаген клетками включает любой препарат, который прямо или косвенно подавляет физические, химические и/или физиологические и т.п. действия тех же самых клеток, вовлеченных в накопление коллагена в фиброзной ткани, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: ингибитор TGFβ (трансформирующий фактора роста-бета), HGF (фактор роста гепатоцитов) или вещество, способствующее продуцированию вышеперечисленного, лиганд PPARγ (гамма рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), ингибитор ангиотензина, ингибитор PDGF (фактора роста тромбоцитов), релаксин или вещество, способствующее продуцированию вышеперечисленного, вещество, которое ингибирует продуцирование и секрецию компонента внеклеточного матрикса, супрессор клеточной активности, супрессор роста клеток и вещество, индуцирующее апоптоз.

Примеры ингибитора TGFP включают, но не ограничиваются этим: усеченный рецептор типа II TGFp (Qi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (5):2345-9), растворимый рецептор типа IITGFP ((George et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96 (22):12719-24), ингибитор активности TGFβ, такой как анти-TGFβ антитело, ингибитор продуцирования TGFβ, такой как молекула РНКи, рибозим или антисмысловая нуклеиновая кислота, комплементарная к TGFβ, векторы, экспрессирующие их, и клетки, трансформированные ими. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор TGFβ ингибирует активность и/или продуцирование TGFβ1.

Примеры веществ, способствующих продуцированию HGF или релаксина, включают, но не ограничиваются этим: нуклеиновая кислота, кодирующая HGF или релаксин, экспрессионная конструкция, содержащая вышеперечисленное, экспрессионные векторы, содержащие их, и клетки, трансформированные посредством их.

Примеры лиганда PPARγ включают, но не ограничиваются этим: эндогенный лиганд, такой как 15-дезокси-Δ12, 14 простагландин 32, нитролинолевая кислота, окисленные ЛПНП (липопротеины низкой плотности), длиноцепочечная жирная кислота, или эйкозаноид и экзогенный лиганд, такой как тиазолидиндион, лекарственный препарат, такой как троглитазон, пиоглитазон, росиглитазон, балаглитазон или ривоглитазон или нестероидный противовоспалительный препарат.

Примеры ингибитора ангиотензина включают, но не ограничиваются этим: антагонист рецептора ангиотензина, такой как телмисартан, лосартан, валсартан, кандесартан цилексетил, олмесартан медоксомил или ирбесартан. Ангиотензин включает ангиотензины I, II, III и IV. Кроме того, примеры рецептора ангиотензина включают, но не ограничиваются этим рецептор типа 1 ангиотензина (AT1).

Примеры ингибитора PDGF включают, но не ограничиваются этим: ингибитор активности PDGF, такой как анти-PDGF антитело, ингибитор продуцирования PDGF, такой как молекула РНКи, рибозим или антисмысловая нуклеиновая кислота, комплементарная PDGF, векторы, экспрессирующие их, и клетки, трансформированные посредством их.

Примеры вещества, которое ингибирует продуцирование и секрецию компонента внеклеточного матрикса, включают, но не ограничиваются этим: вещество, такое как молекула РНКи, рибозим или антисмысловая нуклеиновая кислота, которые подавляет экспрессию компонента внеклеточного матрикса, такого как коллаген, протеогликан, тенасцин, фибронектин, тромбоспондин, остеопонтин, остеонектин или эластин, вещество, имеющее доминирующий отрицательный эффект, такой как доминирующий отрицательный мутант, векторы, экспрессирующие их, и клетки, трансформированные посредством их. Примеры лекарственных препаратов, которые ингибируют продуцирование и секрецию коллагена, включают, но не ограничиваются этим: ингибиторы HSP (белок теплового шока) 47, который является специфическим для коллагена молекулярным шапероном, важным для внутриклеточного транспорта и молекулярного созревания, характерных для синтетических процессов для различных типов коллагена, например ингибиторы экспрессии HSP47, такие как молекула РНКи, рибозим или антисмысловая нуклеиновая кислота, комплементарная HSP47, вещество, имеющее доминирующий отрицательный эффект, такой как доминирующий отрицательный мутант HSP47, векторы, экспрессирующие их, и клетки, трансформированные посредством их.

Примеры супрессора роста клеток включают, но не ограничиваются этим: алкилирующий агент (например, ифосамид, нимустин, циклофосфамид, дакарбазин, мелфалан, ранимустин и т.д.), противоопухолевый антибиотик (например, идарубицин, эпирубицин, даунорубицин, доксорубицин, пирарубицин, блеомицин, пепломицин, митоксантрон, митомицин С и т.д.), антагонист метаболизма (например, гемцитабин, эноцитабин, цитабин, тегафур-урацил, комбинированный лекарственный препарат тегафур-гимерацил-отерацил калия, доксифлуридин, гидроксикарбамид, фтороурацил, метотрексат, меркаптопурин и т.д.), алкалоид, такой как этопозид, иринотекан, винорелбин, доцетаксел, паклитаксел, винкристин, виндезин или винбластин, платиновый комплекс, такой как карбоплатин, цисплатин, или недаплатин и статин, такой как ловастин или симвастатин.

Примеры супрессора клеточной активности включают, но не ограничиваются этим: ингибитор натриевого канала.

Примеры вызывающего апоптоз вещества включают, но не ограничиваются этим: соединение 861, глиотоксин, и аторвастатин.

Примеры стимулятора разложения коллагена включают, но не ограничиваются этим: различные типы коллагеназы и вещества, способствующего ее продуцированию. Примеры коллагеназы включают, но не ограничиваются этим: семейство ММР, такая как ММР (матричная металлопротеиназа) 1, 2, 3, 9, 13 и 14. Примеры стимулятора продуцирования коллагеназы включают, но не ограничиваются этим: нуклеиновая кислота, кодирующая коллагеназу, экспрессионная конструкция, содержащая ее, экспрессионные векторы, содержащие их, и клетки, трансформированные посредством их.

Примеры ингибитора стимулятора разложения коллагена включают, но не ограничиваются этим: TIMP (тканевый ингибитор металлопротеиназы, TIMP1 и TIMP2 и т.д.). Исходя из вышеизложенного, примеры супрессора вышеупомянутого ингибитора включают, но не ограничиваются этим: ингибитор активности TIMP, такой как антитело против TIMP, ингибитор продуцирования TIMP, такой как молекула РНКи, рибозим или антисмысловая нуклеиновая кислота, комплементарная TIMP, векторы, экспрессирующие их, и клетки, трансформированные посредством их.

Молекула РНКи в настоящем изобретении включает РНК, такую как миРНК (малая интерферирующая РНК), miRNA (микро РНК), кшРНК (короткая шпилечная РНК), ddRNA (ДНК, направляемая РНК), piRNA (РНК, взаимодействующие по piwi-типу), rasiRNA (ассоциированная с повторами миРНК) и их модификации. Кроме того, нуклеиновая кислота в настоящем изобретении включает РНК, ДНК, ПНК и композиции вышеперечисленного.

В настоящем изобретении, «фиброзная ткань» означает ткань, в которой внеклеточный матрикс, главным образом коллаген, накопился в количестве, большем, чем в норме. В дополнение к коллагену примеры внеклеточного матрикса включают, но не ограничиваются этим: протеогликан, тенасцин, фибронектин, тромбоспондин, остеопонтин, остеонектин и эластин. Количество коллагена, накопленного в ткани, может быть определено количественно, например, на основе количества гидроксипролина в ткани как индикатора или посредством окрашивания коллагена ткани (например, окраска трихром по Массону, окраска азаном, окраска sirius red, окрашивание эластических волокон по ВанГизону и т.д.) и посредством осуществления анализа изображения. Количество внеклеточного матрикса в фиброзной ткани в настоящем изобретении может составлять по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400% или по меньшей мере 500% по сравнению с количеством в нормальной ткани. Так как считается, что продуцирование коллагена активированными звездчатыми клетками и/или миофибробластами способствует фиброзу ткани, фиброзная ткань в настоящем изобретении, как правило, содержит активированные звездчатые клетки и/или миофибробласты. Фиброзная ткань может быть любой тканью в организме, пока у нее есть вышеупомянутые особенности, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: печень, поджелудочная железа, легкое, почка, костный мозг, голосовые связки, гортань, ротовая полость, сердце, селезенка, средостение, ретроперитонеальное пространство, матка, кожа, грудная железа и кишечный тракт.

Исходя из вышеизложенного, фиброзная ткань может быть зоной поражения в фиброзах различных органов. Примеры фиброзов органов включают, но не ограничиваются этим: фиброз печени, цирроз печени, образование рубцов на голосовых связках, фиброз слизистой оболочки голосовых связок, ларингеальный фиброз, легочный фиброз, фиброз поджелудочной железы, миелофиброз, инфаркт миокарда, фиброз миокарда, следующий за инфарктом миокарда, миокардиальный фиброз, эндомиокардиальный фиброз, фиброз селезенки, средостеночный фиброз, подслизистый фиброз полости рта, фиброз кишечника (например, фиброз, ассоциированный с воспалительным заболеванием кишечника и т.д.), ретроперитонеальный фиброз, фиброз матки, склеродерма и фиброзное заболевание молочной железы.

Фиброз печени и цирроз печени в настоящем изобретении включают не только вызванные вирусной инфекцией вирусами гепатита В или С, употребление спирта, жировой метаморфоз печени, паразитарную инфекцию, врожденное метаболическое нарушение, гепатотоксическое соединение и т.д., но также и такие, для которых не определена причина. Исходя из вышеизложенного, примеры цирроза печени в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются этим: цирроз печени Чаркота, цирроз печени Тодда, первичный желчный цирроз печени, однодолевой цирроз печени, вторичный желчный цирроз печени, обструктивный цирроз печени, холестатический цирроз печени, желчный цирроз печени, атрофический цирроз печени, алиментарный цирроз печени, постнекротический цирроз печени, постгепатитный цирроз печени, узловой цирроз печени, смешанный цирроз печени, микроузловой цирроз печени, компенсированный цирроз печени, макроузловой цирроз печени, септальный цирроз печени, криптогенный цирроз печени, декомпенсированный цирроз печени, перипортальный цирроз печени, портальный цирроз печени и алкогольный цирроз печени.

Легочный фиброз в настоящем изобретении включает не только легочный фиброз в строгом смысле, но также и легочный фиброз в широком смысле, включая сосуществование с интерстициальной пневмонией. Легочный фиброз в настоящем изобретении может быть вызван любой интерстициальной пневмонией такой как, например, инфекционная интерстициальная пневмония, ассоциированная с вирусной пневмонией, грибковой пневмонией, микоплазменной пневмонией и т.д. интерстициальная пневмония, ассоциированная с коллагеновой болезнью, такой как ревматоидный артрит, системная склеродерма, дерматомиозит, полимиозит, смешанный коллагеноз (MCTD, смешанная болезнь соединительной ткани), интерстициальная пневмония, ассоциированная с радиоактивным облучением, интерстициальная пневмония, вызванная препаратом, таким как противоопухолевый препарат, такой как блеомицин, китайское растительное лекарственное средство, такое как Sho-saiko-to, интерферон, антибиотик или Паракват или идиопатическая интерстициальная пневмония, такая как идиопатический легочный фиброз, неспецифическая интерстициальная пневмония, острая интерстициальная пневмония, криптогенная организующаяся пневмония, респираторная, ассоциированная с бронхиолитом интерстициальная легочная болезнь, шелушащаяся интерстициальная пневмония или лимфоцитарная интерстициальная пневмония и легочный фиброз в настоящем изобретении, поэтому, включает такие формы, в которых вышеупомянутая интерстициальная пневмония стала хронической.

Миелофиброз в настоящем изобретении включает не только первичный миелофиброз, но также и вторичный миелофиброз. Примеры вторичного миелофиброза включают, но не ограничиваются этим: миелофиброзы, которые являются вторичными к болезни, такой как острая миелоидная лейкемия, острая лимфообластная лейкемия, хроническая миелоидная лейкемия, истинная полицитемия, первичная тромбоцитемия, миелодиспластический синдром, множественная миелома, злокачественная лимфома, карцинома, системная красная волчанка или прогрессирующий системный склероз или радиоактивное облучение.

Фиброз почек в настоящем изобретении может быть вызван любым интерстициальным нефритом, таким как, например, инфекционный интерстициальный нефрит, ассоциированный со стрептококковым нефритом, стафилококковым нефритом, пневмококковым нефритом, вирусный нефритом, ассоциированный с ветряной оспой, гепатитом В, гепатитом С, ВИЧ и т.д., нефритом вследствие паразитарной инфекции, такой как малярия, грибковый нефритом, микоплазменным нефритом и т.д., интерстициальный нефрит, ассоциированный с коллагеновой болезнью, такой как системная красная волчанка (волчаночный нефрит), системная склеродерма (коллагеновая болезнь почек), или синдром Сьегрена, нефритом, ассоциированным с кровеносным сосудом, иммунная болезнь, такая как нефрит пурпура, полиартериит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит и т.д., интерстициальный нефрит, ассоциированный с радиоактивным облучением, интерстициальный нефрит, вызванный лекарственным препаратом, такими как препараты золота, НПВП, пеницилламином, противоопухолевым препаратом, таким как блеомицин, антибиотик или Паракват и т.д., аллергическим нефритом вследствие укуса насекомым, вызванном пыльцой или растением семейства Anacardiaceae, амилоидным нефрозом, диабетическая нефропатия, хронический гломерулонефрит, нефритом, ассоциированный со злокачественным нефросклерозом или поликистозной болезнью почек, тубулоинтерстициальным нефритом, нефритом, ассоциированным с гестационным токсикозом или раком, мембранопролиферативным гломерулонефритом, нефритом IgA-нефропатии, смешанным криоглобулинемическим нефритом, нефритом синдрома Гудпасчера, нефритом грануломатоза Вегенера или идиопатическим интерстициальным нефритом, таким как острый интерстициальный нефрит и т.д., и фиброзом почек в настоящем изобретении поэтому включает такие формы, в которых вышеупомянутый интерстициальный нефрит стал хроническим.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фиброзной тканью является такая, которая непрерывно получает фиброзный стимул. В настоящем изобретении фиброзный стимул означает любой стимул, который вызывает фиброз, и примеры включают, но не ограничиваются этим: окислительный стресс, гипоксия, воспаление и апоптоз (см. Ghiassi-Nejad et al. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(6):803-16). Примеры такой ткани включают фиброзную ткань, которая испытывает хроническое воспаление и ткань, которая непрерывно подвергается воздействию цитостатического вещества (например, ткань печени, в которой холестаз вызван заболеванием желчного протока и т.д.). Кроме того, такая ткань также включает ткань, затронутую фиброзом, для которой непосредственная причина болезни неясна, такой как, например, криптогенный цирроз печени, идиопатический легочный фиброз или идиопатический миелофиброз и т.д., или затронутый такими, для которых известна непосредственная причина болезни, но происхождение причины болезни неясно, или трудно удаляема, такие как, например, первичный желчный цирроз печени, фиброз печени, происходящий от неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), первичный склерозирующий холангит, идиопатический легочный фиброз, идиопатический легочный фиброз, происходящий из интерстициальной пневмонии, первичный миелофиброз, идиопатический интерстициальный фиброз почек, происходящий от нефрита, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона, язвенный колит и т.д.), или системная склеродерма и т.д.

В настоящем изобретении, «регенерированная нормальная ткань из фиброзной ткани» означает регенерированную ткань, которая была денатурирована вследствие фиброза по меньшей мере до состояния, в котором фиброз имеет меньшую степень. Таким образом, в то время как фиброз прогрессирует, ткань замещается фиброзной тканью, которая является главным образом внеклеточным матриксом, и восстановление нормальной ткани из фиброзной ткани в настоящем изобретении должна полностью изменить вышеупомянутый процесс и заменить пролиферированную фиброзную ткань первоначальной нормальной тканью. Поэтому восстановление нормальной ткани из фиброзной ткани в настоящем изобретении включает не только полное восстановление фиброзной ткани к исходному состоянию, но также и частичное восстановление фиброзной ткани к исходному состоянию. Степень восстановления нормальной ткани может быть оценена с помощью гистологических исследований биопсийного образца и т.д., основанных на нормализации структуры ткани, сокращения области, занятой фиброзной тканью, увеличением области, занятой нормальной тканью и т.д., или когда наблюдается аномальность биохимического индекса вследствие фиброза перед лечением настоящей композицией, оценка может быть выполнена на основе улучшении индекса и т.д.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения восстановление нормальной ткани может быть выполнено посредством роста и дифференцировки стволовых клеток в пространстве, которое образуется вследствие уменьшения коллагена, накопленного в фиброзной ткани. Поэтому один вариант осуществления настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, в которой для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани в пространстве для роста и дифференцировки стволовых клеток пространство формируется посредством уменьшения коллагена, накопленного в фиброзной ткани. В настоящем изобретении примеры стволовых клеток включают, но не ограничиваются этим: клетки, которые первоначально присутствуют в ткани, которая стала фиброзной (стволовые клетки печени, стволовые клетки поджелудочной железы, стволовые клетки легкого, стволовые клетки почки, стволовые клетки костного мозга, стволовые клетки сердца, стволовые клетки селезенки, стволовые клетки матки, стволовые клетки кожи, стволовые клетки молочной железы, стволовые клетки кишечника, мезенхимальные стволовые клетки и т.д.) клетки, которые двигаются из другого места в организме и, кроме того, клетки, которые ввели для лечения. Кроме того, «пространство» включает не только полость внутри ткани, но также и пространства с камерой, в которой клетки могут увеличиваться и растить, такой как, например, пространство, в котором давление между клетками уменьшено или пространство, имеющее пластичность.

В одном варианте осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит нацеливающее вещество для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани. Из-за того что содержится нацеливающее вещество, становится возможным специфически доставлять к коллаген-продуцирующим клеткам, которые являются клетками-мишенями, вещество, уменьшающее коллаген, которое является нацеливающим на продуцирующие коллаген клетки, такое как, например, помимо прочего, вещество, которое ингибирует продуцирование и секрецию компонента внеклеточного матрикса, HGF или вещество, способствующее его продуцированию, ММР или вещество, способствующее его продуцированию, ингибитору TIMP, ингибитор продуцирования TGFβ, релаксин или вещество, способствующее продуцированию вышеперечисленного и т.д., таким образом увеличивая эффект использования вещества, уменьшающего коллаген.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения нацеливающий агент для продуцирующих коллаген клеток является ретиноидом. Хотя механизм, посредством которого ретиноид осуществляет нацеливание, до сих пор остается неясным, предполагается, например, что ретиноид, связывающийся специфически с RBP (ретинол-связывающим белком), включается в продуцирующую коллаген клетку в фиброзной ткани через определенный тип рецептора, размещающийся на поверхности клетки. Способность ретиноида функционировать в качестве нацеливающего агента для продуцирующих коллаген клеток описана в WO 2006/068232, JP, А, 2009-221164, JP, А, 2010-59124 и т.д.

Ретиноид является одним из членов группы соединений, имеющих скелет, в котором четыре изопреноидные единицы связаны «голова к хвосту» (G.P. Moss, "Biochemical Nomenclature and Related Documents", 2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992)), и витамин А является общим дескриптором для качественной демонстрации ретиноидной биологической активности ретинола. Примеры ретиноидов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают, но не особенно ограничиваются этим: ретинол (включая all-trans ретинол), ретиналь, ретиноевую кислоту (включая третиноин), сложный эфир ретинола и жирной кислоты, сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты, производных ретиноида, таких как этретинат, изотретиноин, адапален, ацитретин, тазаротен, или ретинил пальмитат и аналог витамина А, такой как (4-HPR) фенретинид или бексаротен.

Среди них ретинол, ретиналь, ретиноевая кислота, сложный эфир ретинола и жирная кислота (например, ретинилацетат, ретинилпальмитат, ретинилстеарат и ретиниллаурат и т.д.), и сложный эфир алифатического спирта и ретиноевой кислоты (например, этил ретиноат и т.д.) предпочтительны с точки зрения эффективности специфической доставки вещества к продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани.

Все изомеры, включая цис/транс ретиноиды, включены в объем настоящего изобретения. Ретиноид может быть замещенным одним или более заместителями. Ретиноид в настоящем изобретении включает не только в индивидуальном состоянии так же как ретиноид в состоянии, в котором он растворен или смешан в среде, которая может растворить или сохранять его.

Вышеупомянутый вариант осуществления композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть образован только из вещества, уменьшающего коллаген, нацеливаемого на продуцирующие коллаген клетки в качестве активного ингредиента и ретиноида в качестве нацеливающего агента, или может содержать компонент, составляющий носитель, отличный от вышеупомянутого. Составляющий носитель компонент в настоящем варианте осуществления не особенно ограничивается; любой компонент, который известен в лекарственных и/или фармацевтических областях, может использоваться, но один, для которого по меньшей мере включение ретиноида или его связывание возможно, является предпочтительным.

Примеры такого компонента включают, но не ограничиваются этим: липид, например, фосфолипид, такой как глицерофосфолипид, сфинголипид, такой как сфингомиелин, стерол, такой как холестерин, растительное масло, такое как соевое масло или маковое масло, минеральное масло, лецитин, такой как лецитин яичного желтка и полимер. Среди них компонент, который может образовывать липосому, такой как, например, природный фосфолипид, такой как лецитин, полусинтетический фосфолипид, такие как димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), или

дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилауроилфосфатидилхолин (DLPC) или холестерин являются предпочтительными.

Компонент, который может избежать захвата ретикулоэндотелиальной системой, особенно предпочтен, и примеры этого включают катионые липиды, такие как N-(α-триметиламониоацетил)-дидодецил-D-глутамат хлорид (TMAG), N,N',Nʺ,N'''-тетраметил-N,N',Nʺ,N'''-тетрапальмитилспермин (TMTPS), 2,3-диолеоилокси-N-[2(сперминкарбоксамид)этил]-N,N-диметил-1-пропанаммони ум трифторацетат (DOSPA), N-[1-(2,3-диолеоил-окси)пропил]-N,N,N-триметилам-мониум хлорид (DOTMA), диоктадцилдиметиламмониум хлорид (DODAC), дидодециламмониум бромид (DDAB), 1,2-диолеоилокси-3-триметиламмо-ниопропан (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (DC-Chol), 1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромид (DMRIE) и O,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламониоацетил)диэтаноламин хлорид (DC-6-14).

У вышеупомянутого носителя может быть специфическая 3-мерная структура. Примеры такой структуры включают, но не ограничиваются этим: прямолинейная цепь или разветвленная линейная структура, структура подобная пленке и сферическая структура. Вследствие этого носитель может иметь, помимо прочего, любую 3-мерную форму, такую как мицелла, липосома, эмульсия, микросфера или наносфера.

Связывание ретиноида и/или активного ингредиента с носителем или включение его в носитель может также быть возможным посредством связывания ретиноида с носителем или включением его в носитель посредством химического и/или физического метода. Альтернативно, связывание ретиноида и/или активного ингредиента с носителем или включение его в носитель может также быть возможным посредством смешения ретиноида и/или активного ингредиента и составляющего носитель компонента. Количество ретиноида в композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть, например, 0,01-1000 нмоль/мкл, и предпочтительно 0,1-100 нмоль/мкл. Кроме того, количество активного ингредиента в композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть, например, 1-10000 нг/мкл, и предпочтительно 10-1000 нг/мкл или 1-1000000 мкг на кг массы тела, и предпочтительно 10-100000 мкг на кг массы тела.

Количество ретиноида и активного ингредиента могло бы в некоторых случаях быть вне вышеупомянутых диапазонов в зависимости от активности этих компонентов, способа введения композиции, частоты введения, субъекта, в которого они вводятся и т.д., и эти случаи также включены в объем настоящего изобретения. Связывание ретиноида и/или активного ингредиента с носителем или включение его в носитель может быть осуществлено до загрузки активного ингредиента на носитель, может быть осуществлено одновременным смешением составляющего носитель компонента, ретиноида и активного ингредиента, или может быть осуществлено посредством смешения носителя, имеющего активный ингредиент уже нанесенный на него, и ретиноида. Поэтому настоящее изобретение также касается способа получения фармацевтической композиции для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани, который включает стадию связывания ретиноида с любым существующим носителем, связывающим лекарственный препарат или носителем, инкапсулирующим лекарственный препарат, например, липосомный препарат, такой как DaunoXome^®, Doxil, Caelyx^® или Myocet^®.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть в любой форме, до тех пор пока желаемый активный ингредиент может быть транспортирован к продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани как к мишени, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: полимерная мицелла, липосома, эмульсия, микросфера и наносфера. В настоящем изобретении с точки зрения высокой эффективности доставки, широкого выбора веществ, которые должны быть доставлены, простоты приготовления и т.д., среди выше перечисленного липосомальная форма является предпочтительной, и катионная липосома, которая содержит катионный липид, является особенно предпочтительной. Когда композиция находится в форме липосомы, молярное отношение ретиноида и составляющего липосому липида предпочтительно составляет 8:1-1:4 и более предпочтительно 4:1-1:2, принимая во внимание эффективность связывания ретиноида с носителем или его включения в носитель.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать активный ингредиент внутри, он может быть присоединен к внешней поверхности или может быть смешан с активным ингредиентом. Поэтому композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть в форме комплекса липосомы и активного ингредиента, которым является липоплекс; в зависимости от способа введения, способа, которым лекарственный препарат высвобождается и т.д., композиция может быть покрыта соответствующим материалом, таким как, например, кишечнорастворимой оболочкой или материалом, распадающимся через определенное время, или может быть заключена в соответствующую систему высвобождения лекарственного препарата.

Когда ретиноид содержится в качестве нацеливающего агента, ретиноид присутствует в форме, в которой он функционирует как нацеливающий агент в настоящей композиции. В настоящем изобретении функционирование в качестве нацеливающего агента означает, что содержащая ретиноид композиция достигает и/или включается в продуцирующую коллаген клетку, которая является клеткой-мишенью в фиброзной ткани, с большей скоростью и/или в большем количестве, чем композиция, не содержащая ретиноид, и это может быть легко подтверждено, например, добавлением меченной или содержащий метку композиции к культуре клеток-мишеней и исследуя область, где метка присутствует через заранее определенное время. С точки зрения структуры, например, если ретиноид по меньшей мере частично экспонируется на внешней поверхности композиции не позднее, чем она достигнет клетки-мишени, могут быть удовлетворены вышеупомянутые требования. Экспонирован ли ретиноид на внешней поверхности композиции, может быть оценено, посредством контактирования композиции с веществом, которое специфически связывается с ретиноидом, например, с ретинол-связывающим белком (RBP) и т.д., и исследованием связывания с композицией.

Экспозиция ретиноида, по меньшей мере, частично на внешней поверхности композиции не позднее, чем он достигнет клетки-мишени, может быть осуществлена, например, посредством регулирования отношения в смеси ретиноида и составляющего носитель компонента. Кроме того, когда липидная структура, такая как липосома, используется в качестве носителя, например, для формирования комплекса между липидной структурой и ретиноидом, может использоваться способ, в котором липидная структура сначала разбавляется в водном растворе, и она затем контактирует, смешивается и т.п. с ретиноидом. В этом случае ретиноид может быть в состоянии, в котором он растворен в растворителе, например, органическом растворителе, таком как диметилсульфоксид. Липидная структура, упомянутая в настоящем изобретении, означает любую 3-мерную структуру, например, структуру, имеющую линейную, подобную пленке, сферическую форму и др., и содержащую липид как составляющий компонент, и примеры этого включают, но не ограничиваются этим: липосома, мицелла, липидная микросфера, липидная наносфера и липидная эмульсия. Возможность применения к другому носителю лекарственного препарата того же самого нацеливающего агента, как препарат, используемый для нацеливания липосомы описан, например, в Zhao and Lee, Adv Drug Deliv Rev. 2004; 56(8):1193-204, Temming et al. Drag Resist Updat. 2005; 8(6):381-402 и т.д.

В дополнение к уменьшающему коллаген веществу композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать вещество, которое уменьшает фиброзный стимул в качестве активного ингредиента или может использоваться в сочетании с таким веществом. Примеры вещества, которое уменьшает фиброзный стимул, включают, но не ограничиваются этим: антиоксидант, стимулятор кровообращения, противовоспалительный препарат, противовирусный препарат, антибиотик, противопаразитарное вещество, гепатопротекторный препарат, желчегонное средство и супрессор апоптоза. Эти вещества могут выбираться как подходящие в соответствии с тканью, которая является мишенью, и болезненным состоянием.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать метку. Введение метки позволяет осуществлять мониторинг «успех/неудача» доставки к клеткам-мишеням, увеличения/уменьшения клеток-мишеней и т.д., и полезна не только на уровне теста и исследования, но также и на клиническом уровне. Метка может быть выбрана из любой метки, известной специалисту в данной области техники, такой как, например, любой радиоизотоп, магнитный материал, вещество, которое связывается с меченым веществом (например, антитело), флуоресцентное вещество, флуорофор, хемилюминесцентное вещество или фермент. Метка может быть прикреплена по меньшей мере к одному компоненту, составляющему композицию в соответствии с настоящим изобретением; например, когда ретиноид содержится в качестве нацеливающего агента, она может быть прикреплена к одному или большему количеству активных ингредиентов, ретиноиду, и составляющему носитель компоненту, или метка может содержаться в композиции в качестве компонента, отличного от вышеупомянутых.

Термин «для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани» или «для доставки к продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани» в настоящем изобретении означает, что это подходит для использования продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани в качестве клеток-мишеней, и это включает, например, способность доставлять вещество к указанным клеткам с более высокой скоростью, с более высокой эффективностью, и/или в большем количестве, чем для других клеток, например, нормальных клеток. Например, носитель для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани или носитель для доставки к продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани могут доставлять активный ингредиент продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани со скоростью и/или эффективностью по меньшей мере в 1,1 раз, по меньшей мере в 1,2 раза, по меньшей мере в 1,3 раза, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза и, более того, по меньшей мере в 3 раза большей по сравнению с другими клетками. Так как композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит нацеливающее вещество для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани, ее можно изготовить как композицию для продуцирующих коллаген клеток в фиброзной ткани или для доставки к продуцирующим коллаген клеткам в фиброзной ткани.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в качестве медицинского препарата (то есть фармацевтической композиции) и может вводиться через различные способы введения, включая пероральные и парентеральные пути; примеры этого включают, но не ограничиваются этим: пероральный, энтеральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрипеченочный, внутрижелчный, внутрилегочный, трахеобронхиальный, внутритрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, внутриректальный, внутриартериальный, интрапортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутрицеребральный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, интраперитонеальный и внутриматочный пути, и она может быть составлена в лекарственной форме, которая подходит для каждого способа введения. Такая лекарственная форма и способ приготовления могут быть выбраны в качестве подходящий из любых известных форм и способов (см., например, «Hyojun Yakuzaigaku» (Standard Pharmaceutical Science), Ed. by Yoshiteru Watanabe et al. Nankodo, 2003).

Примеры лекарственных форм, подходящих для перорального приема, включают, но не ограничиваются этим: порошок, гранула, таблетка, капсула, жидкость, суспензия, эмульсия, гель и сироп, а примеры лекарственных форм, подходящих для парентерального введения, включают инъекции, такие как инъекционный раствор, инъекционная суспензия, инъекционная эмульсия и инъекция в форме, которая готовится во время использования. Составы для парентерального введения могут быть в конфигурации, такой как водные или неводные изотонические стерильные раствор или суспензия.

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может поставляться в любой конфигурации, но с точки зрения стабильности при хранении обеспечивается в конфигурации, которая может быть получена в момент использования, например в конфигурации, которая позволяет доктору и/или фармацевту, медсестре, другому медработнику и др. приготовить ее на месте лечения или в близости его. В этом случае композиция в соответствии с настоящим изобретением обеспечивается как один или большее количество контейнеров, содержащих по меньшей мере один существенный составляющий элемент для этого, и она получается перед использованием, например, в течение 24 часов перед использованием, предпочтительно в течение 3 часов перед использованием и более предпочтительно непосредственно перед использованием. При осуществлении получения реактив, растворитель, оборудование для получения и т.п., которые обычно доступны в месте получения, могут использоваться в случае необходимости.

Настоящее изобретение, поэтому, также касается набора для получения композиции, набора, включающего один или большее количество контейнеров, содержащих отдельно или в комбинации активный ингредиент и/или при необходимости нацеливающее вещество или составляющее носитель вещество, и также касается составляющего элемента, необходимого для композиции, обеспеченной в форме такого набора. Набор в соответствии с настоящим изобретением может содержать, в дополнение к вышеупомянутому, инструкции, электронный носитель записи, такой как CD или DVD и т.д., относящийся к способу приготовления и способу введения композиции в соответствии с настоящим изобретением и т.д. Кроме того, набор в соответствии с настоящим изобретением может включать все составляющие элементы для составления композиции в соответствии с настоящим изобретением, но не всегда должен включать все составляющие элементы. Поэтому набор в соответствии с настоящим изобретением не должен включать реактив или растворитель, которые обычно доступны в месте лечения, экспериментальной установки и т.п., такие как, например, стерильная вода, физиологический раствор или раствор глюкозы.

Настоящее изобретение дополнительно касается способа для восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани, способа включающего стадию введения эффективного количества композиции или вещества, уменьшающего коллаген, в соответствии с настоящим изобретением субъекту, который нуждается в этом. Эффективное количество, упомянутое в настоящем изобретении, является, например, количеством, которое подавляет любое увеличение количества внеклеточного матрикса, такого как коллаген, в фиброзной ткани, является предпочтительно количеством, которое уменьшает количество внеклеточного матрикса и более предпочтительно является количеством, которое вызывает восстановление нормальной ткани в фиброзной ткани.

Количество внеклеточного матрикса может быть количественно определено различными методами такими как, например, помимо прочего, анализ изображения специфически окрашенного изображения внеклеточного матрикса или измерение маркера внеклеточного матрикса. Например, коллаген может быть количественно определен посредством измерения количества маркера коллагена, такого как гидроксипролина, или подвергая ткань окрашиванию коллагена (например, окраска трихром по Массону, окраска азаном, окраска sirius red, окрашивание эластических волокон по ВанГизону и т.д.), и осуществлением анализа изображения. Процент уменьшения внеклеточного матрикса в фиброзной ткани может быть, например, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70% и, кроме того, по меньшей мере 75% по сравнению со случаем, в котором не вводили композицию в соответствии с настоящим изобретением. В настоящем изобретении случай, в котором композиция в соответствии с настоящим изобретением не вводится, включает не только случай, в котором само по себе введение не осуществляли, но также и случай, в котором ввели лишь только среду для лекарства, случай, в котором композиция, соответствующая композиции в соответствии с настоящим изобретением за исключением того, что она не содержит активный ингредиент, вводили и, когда композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит нацеливающее вещество, случай, в котором вводили композицию, соответствующую композиции в соответствии с настоящим изобретением за исключением того, что она не содержала нацеливающее вещество (так называемые отрицательные контроли). Кроме того, восстановление нормальной ткани может быть оценено гистологическим наблюдением или введением меченных стволовых клеток в фиброзную ткань и осуществлением отслеживания их перемещений.

Эффективным количеством предпочтительно является количество, которое не вызывает побочные явления, которые бы превышали преимущества от введения. Такое количество может быть определено как соответствующее посредством исследования in vitro с использованием культивируемых клеток или посредством исследования на животных моделях, таких как мышь, крыса, собака или свинья, и такие методы исследования известны специалисту в данной области техники. Кроме того, доза лекарственного препарата, используемого в способе в соответствии с настоящим изобретением, известна специалисту в данной области техники, или может быть определена как соответствующая посредством вышеупомянутого исследования и т.д. В качестве животной модели для фиброза, могут использоваться различные модели, такие как модель цирроза печени, полученная введением четыреххлористого углерода (CCl₄), свиной сыворотки, диметилнитрозамина (DMN), диетой, дефицитной по метионину и холину (MCDD), конканавалином (Кон А), лигатурой желчного протока и т.д., легочная модель фиброза, полученная введением блеомицина (BLM) и т.п., модель фиброза поджелудочной железы, полученная посредством дихлорида дибутилолово и т.п., и модель миелофиброза, такая как трансгенная мышь по тромбопоэтину (ТРО) (Leukemia Research 29:761-769, 2005).

В способе в соответствии с настоящим изобретением специфическая доза композиции или вещества, уменьшающего коллаген, которую вводят, может быть определена, учитывая различные условия относительно субъекта, который требует лечения, такие как, например, серьезность симптомов, общее состояние здоровья субъекта, возраст, масса и пол субъекта, диета, выбор времени и частоты введения, медицинские препараты, используемые в комбинации, реакции на лечение, согласие с лечением и т.д.

В качестве способа введения, существуют различные способы, включая как пероральное, так и парентеральное введение, и примеры этого включают пероральный, энтеральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, местный, внутрипеченочный, внутрижелчный, внутрилегочный, трахеобронхиальный, внутритрахеальный, внутрибронхиальный, назальный, внутриректальный, внутриартериальный, интрапортальный, интравентрикулярный, интрамедуллярный, внутрь лимфатического узла, внутрилимфатический, внутрицеребральный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, трансмукозальный, чрескожный, интраназальный, интраперитонеальный и внутриматочный пути.

Частота введения зависит от свойств используемой композиции и от вышеупомянутого состояния субъекта и может быть многократной за день (то есть 2, 3, 4, 5 или больше раз в день), один раз в день, каждые несколько дней (то есть каждые 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней и т.д.), несколько раз в неделю (например, 2, 3, 4 и т.д. раз в неделю), каждую неделю, или каждые несколько недель (то есть каждые 2, 3, 4 недели и т.д.).

В способе в соответствии с настоящим изобретением термин «субъект» означает любого живущего индивидуума, предпочтительно животное, более предпочтительно млекопитающее, и еще более предпочтительно человеческий индивидуум. В настоящем изобретении субъект может быть здоровым или страдать некоторым расстройством, но это как правило, означает субъекта, имеющего фиброзную ткань или ткань, имеющую риск стать фиброзной. Примеры такого субъекта включают, но не ограничиваются этим: субъект, страдающий вышеупомянутым фиброзом органа или наличием риска того, чтобы быть затронутым и субъекта, у которого ткань получает фиброзный стимул или имеет риск получить его.

Настоящее изобретение дополнительно касается способа восстановления нормальной ткани из фиброзной ткани, способа, включающего стадию уменьшения коллагена в фиброзной ткани и/или стадию формирования пространства для роста клеток и дифференцировки в фиброзной ткани.

В настоящем способе уменьшения коллагена в фиброзной ткани и формировании пространства для роста клеток и дифференцировки может быть осуществлено посредством введения композиции в соответствии с настоящим изобретением или вышеупомянутого вещества, уменьшающего коллаген, в фиброзную ткань.

Примеры

Настоящее изобретение объясняется в дальнейших деталях посредством Примеров, приведенных ниже, но они являются только иллюстрацией и ни в коем случае не ограничивают настоящее изобретение. В Примерах, приведенных ниже, данные выражены как средние значения (± стандартное отклонение). Множественные сравнения между контрольной группой и другой группой осуществляли посредством теста Даннетта.

Пример 1. Получение VA-lip миРНК

(1) Получение миРНК

В качестве смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК (Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japan), нацеленных на последовательность оснований gp46 (GenBank Accession No. M69246), которая является крысиным гомологом человеческого HSP47, молекулярный шаперон, характерный для коллагенов (типы I-IV), использовали те, которые приведены ниже.

A: GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG (смысловая цепь миРНК, начинающаяся с 757-го основания в gp46 нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1)

В: GUUGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU (антисмысловая цепь миРНК, SEQ ID NO: 2)

В качестве рандомизированной миРНК (также называемой миPHKscramble), использовали те, которые приведены ниже.

С: CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG (смысловая цепь миРНК, SEQ ID NO: 3)

D: GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU (антисмысловая цепь миРНК, SEQ ID NO: 4)

В некоторых экспериментах использовали смысловые цепи, имеющие 6'-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) или флуоресцеин изотиоцианат (FITC), конъюгированный с 5'-концом. Было подтверждено поиском с помощью BLAST, что у этих последовательностей не было гомологии с другой известной крысиной мРНК.

(2) Получение VA-lip миРНК

В качестве катионного липида, катионную липосому (Lipo Trust), содержащую O,O'-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламониоацетил)диэтаноламин хлорид (DC-6-14), холестерин и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в молярном отношении 4:3:3, приобретали в Hokkaido System Science Co., Ltd. (Sapporo, Japan). Перед использованием липосомы получали при концентрации 1 мМ (DC-6-14), добавляя дважды перегнанную воду (DDW) к лиофилизированной липидной смеси при перемешивании. Для того, чтобы получить липосомы с иммобилизованным VA, 200 нмоль витамина А (ретинол, Sigma, USA), растворенного в ДМСО, смешивали с липосомальной суспензией (100 нмоль в виде DC-6-14) в пробирке на 1,5 мл при перемешивании при 25°C. Для того, чтобы получить липосомы с иммобилизованным VA, содержащие миPHKgp46 (VA-lip-миPHKgp46), раствор миPHKgp46 (580 пмоль/мл в DDW) добавляли к раствору липосомы с иммобилизованным ретинолом при перемешивании при комнатной температуре. Молярное отношение миРНК и DC-6-14 составляло 1:11. Чтобы получить желаемую дозу in vitro, VA-lip миРНК восстанавливали, используя фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).

Пример 2. Эксперимент по регенеративный терапии с использованием крысиной модели фиброза печени

(1) Получение крысиной модели фиброза печени

Крысиную модель фиброза печени получали, подвергая самцов крыс SD (масса тела 150-200 г) (Slc Japan, Shizuoka, Japan) лигатуре общего желчного протока, и животное на 28-ой день после того, как была осуществлена лигатура, подвергали настоящему эксперименту. Настоящая крысиная модель была в состоянии, в котором холестаз был вызван лигатурой общего желчного протока, и ткань печени непрерывно подвергалась фиброзному стимулу.

(2) Получение GFP-меченных стволовых клеток печени крысы

GFP-Меченые стволовые клетки печени крысы получали из печени 4-недельной GFP-трансгенной крысы (Slc Japan). Сначала раствор EGTA и раствор коллагеназы перфузировали через GFP-трансгенную крысу, затем печень забирали для исследования, и полученную печень тонко нарезали и затем фильтровали с использованием клеточного сита (диаметр поры 100 мкм). Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) + 0,25% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) добавляли к полученной суспензии клеток, и смесь подвергали центрифугированию при 4°C и 500 об/мин в течение 2 минут. Получали супернатант и подвергали центрифугированию при 4°C и 1300 об/мин в течение 5 минут. После того как супернатант удалили, добавляли буфер MACS^® (Magnetic Activating Cell Sorting) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) к преципитату и перемешивали. После того как посчитали число клеток, осуществили MACS^® с использованием мышиного антитела анти-CD45, конъюгированного с FITC (BD Pharmingen), кроличьего поликлонального антитела анти-CD133 (Abcam) и мышиного моноклонального антитела анти-ЕрСАМ (Santa Cruz), и получали и использовали в качестве стволовых клеток печени крысы в настоящем эксперименте CD133-положительные, ЕрСАМ-положительные и CD45-негативные клетки.

(3) Обработка крысиной модели фиброза печени

GFP-Меченные стволовые клетки печени, полученные в п. (2), локально трансплантировали в крысиной модели фиброза печени, полученной в п. (1) при концентрации 2 × 10⁶ импульсов в 200 мкл среды DME/F12.

С 24 часа после трансплантации стволовых клеток печени витамин А, иммобилизованный на липосоме, с инкапсулированными миPHKgp46 (VA-lip миPHKgp46) или VA-lip миPHKscramble в качестве отрицательного контроля вводили через хвостовую вену через день в общей сложности 12 раз. Концентрация введенной миРНК составляла 0,75 мг/кг массы тела крысы. Молярное отношение витамина А, липосомы (LipoTrust, Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japan) и миРНК составляло 11,5:11,5:1.

(4) Окрашивание ткани

Спустя 24 часа после 12-го введения VA-lip миPHKgp46 в п. (3) (то есть на 52-й день после лигатуры общего желчного протока) получали печень крысы с лигатурой общего желчного протока, в которую трансплантировали GFP-экспрессирующие стволовые клетки печени. После того, как выделенную печень заливали с использованием ОСТ-соединения, получали замороженные срезы. Срезы печени фиксировали, используя 4%-ый параформальдегид. Некоторые срезы подвергали окрашиванию азаном стандартным методом. Некоторые срезы подвергали блокированию PBS, содержащим 5%-ную сыворотку козы, промывали PBS, и затем позволяли реагировать при 4°C в течение ночи с использованием мышиных моноклональных анти(гладкомышечный α-актин) (α-SMA) антител (Sigma), мышиных моноклональных анти-(глиофибриллярный кислый белок) (GFAP) антител (Sigma), кроличьих поликлональных антиальбуминовых антител (MP Biomedicals), мышиных моноклональных антител анти-СК19 (Novocastra) и мышиных моноклональных анти(сосудистый эндотелиальный кадгерин) (ve-CAD, Vascular Endothelial Cadherin) антител (Santa Cruz). После промывки PBS им позволяли реагировать с А1еха555-меченными анти-мышиными антителами козы IgG и А1еха555-меченными анти-кроличьими антителами козы IgG (оба от Invitrogen) при комнатной температуре в течение 60 минут. После промывки PBS их заливали, используя ProLong(R) Gold с DAPI (Invitrogen), и исследовали посредством флуоресценцентного микроскопа. Вместо реакции с анти-кроличьими антителами козы, некоторой части срезов позволяли реагировать с α-SMA антителами (Dako) и затем подвергали окраске посредством диаминобензидина (DAB) и затем подвергали окрашиванию ядра посредством гематоксилина.

Результаты

Фиг. 1 показывает внешний вид печени, полученной от подопытных крыс и изображения, окрашенные азаном, их репрезентативных срезов. В группе, в которой вводили VA-lip миPHKscramble, печень сморщенная, поверхность выглядит нерегулярной, накопление внеклеточного матрикса, который окрашен синим, наблюдается широко в ткани на изображении, окрашенном азаном, и дольчатая структура печени выглядит нарушенной. С другой стороны, в группе, в которой вводили VA-lip миPHKgp46, не было никакого очевидного сморщивания, поверхность была гладкой, почти не было накопления внеклеточного матрикса в ткани, и было очевидное сокращение размера фиброзной области по сравнению с группой, обработанной VA-lip миPHKscramble. Кроме того, отчетливо наблюдалось, что нормальная дольчатая структура печени, в который синусоиды, отходят радиально от центральной вены, восстановилась.

Фиг. 2 показывает изображения α-SMA антитела, окрашенного DAB. Синие участки представляют собой окрашенное гематоксилином ядро, и темно-коричневые участки представляют собой α-SMA-позитивные области. α-SMA известен как маркер для активированных звездчатых клеток, и считается, что в α-SMA-позитивных областях присутствуют активированные звездчатые клетки. В группе, обработанной VA-lip миPHKgp46, было отмечено уменьшение активированных звездчатых клеток по сравнению с VA-lip миPHKscramble.

Фиг. 3 показывает DAPI и GFP-флуоресцентные изображения GFP-меченных областей трансплантации стволовых клеток печени. В группе, обработанной VA-lip миPHKgp46, GFP-окраска наблюдалась около в 80% области, тогда как в группе, обработанной VA-lip миPHKscramble, почти не было окраски.

Фиг. 4 показывает изображения светлопольные и GFP-флуоресцентные GFP-меченных областей трансплантации стволовых клеток печени. В группе, обработанной VA-lip миPHKscramble, форма клеток стала нечеткой вследствие накопления внеклеточного матрикса, особенно в областях вокруг кровеносных сосудов, и синусоиды располагаются случайным способом, тогда как в группе, обработанной миPHKgp46, форма клетки была четкой и наблюдалась синусоидная структура, в которой они располагались радиально от центральной вены. Кроме того, в группе, обработанной VA-lip миPHKscramble, не было никакой GFP-окраски, тогда как в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46, GFP-окраска наблюдалась повсеместно по ткани.

Фиг. 5 представляет собой сравнение между изображениями DAPI и GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом GFAP в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (Фиг. 5A с 200× увеличением и Фиг. 5B с 400× увеличением). GFAP является белком, известным как маркер для звездчатых клеток печени в покоящемся состоянии. Клетки, экспрессирующие GFAP, не экспрессировали GFP.

Фиг. 6 представляет собой сравнение между изображениями DAPI и GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом α-SMA в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 при 200× увеличении. Клетки, экспрессирующие α-SMA, не экспрессировали GFP. Результаты Фиг. 5 и 6 показывают, что звездчатые клетки печени не являются потомками стволовые клетки печени.

Фиг. 7 представляет собой сравнение между DAPI и GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное альбуминовым антителом в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 при 200× увеличении. Альбумин является маркером для гепатоцитов, и многие клетки, экспрессирующие GFP, экспрессировали альбумин.

Фиг. 8 представляет собой сравнение между DAPI и GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом СК19 в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 при 200× увеличении. СК19 является маркером для эпителиальных клеток желчного протока, и СК19-позитивные-клетки, образующие желчный проток, экспрессировали GFP.

Фиг. 9 представляет собой сравнение между DAPI GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное антителом ve-CAD в группе, обработанной VA-lip миPHKgp46 (Фиг. 9A 200× увеличение и Фиг. 9B 400× увеличение). ve-CAD известен как маркер для эндотелиальных клеток кровеносного сосуда, и в некоторых клетках, экспрессирующих GFP, наблюдались клетки, экспрессирующие ve-CAD.

Фиг. 10 представляет собой сравнение между DAPI и GFP-флуоресценции и изображение, флуоресцентно окрашенное альбуминовым антителом в области группы, обработанной VA-lip миPHKgp46, где клетки не трансплантировали, при 200× увеличении. В месте, куда клетки не трансплантировали, не было никаких клеток, экспрессирующих GFP.

Обсуждение

Так как клетки, которые экспрессировали GFP, были клетками, полученными из трансплантированных стволовых клеток печени, вследствие введения VA-lip миPHKgp46, в месте трансплантации клеток, фиброзная область уменьшилась в размерах и стволовые клетки печени, дифференцировались в гепатоциты, эпителиальные клетки желчного протока и эндотелиальные клетки кровеносного сосуда, таким образом показывая, что нормальная ткань печени была регенерирована. Таким образом, стало очевидным, что обработка, включающая введение VA-lip миPHKgp46, не только вылечивает фиброз печени, но также и вызывает восстановление печени. Кроме того, тот результат, что в группе, обработанной VA-lip миPHKscramble, не возможно было обнаружить никаких стволовых клетки печени (Фиг. 3), предполагает, что сокращение размера фиброзной области вследствие VA-lip миPHKgp46 глубоко вовлечено в рост и дифференцировку стволовых клетки печени.

Пример 3. Звездчатая специфическая для клетки доставка посредством VA

(1) Выделение звездчатых клеток поджелудочной железы (PSC) крысы

Звездчатые клетки поджелудочной железы (PSC) крысы выделяли, используя метод центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с предыдущим сообщением (Apte et al. Gut 1998; 43:128-133). Чистоту оценивали посредством микроскопического исследования, автофлуоресценцией эндогенного VA и иммуноцитохимическим методом, используя моноклональное антитело (1:25, Dako) для десмина, который является кросс-сшивающим белком мышечного актина. Жизнеспособность клеток оценивали по вытеснению трипанового синего. Как клеточная чистота, так и жизнеспособность превышали 95%. Клетки культивировали в модифицированной Исковым среде Дульбекко (Iscove's modified Dulbecco's medium: IMDM), добавили 10%-ую эмбриональную телячью сыворотку (FBS) при 37°C в увлажненной среде 95% воздуха/5% CO₂.

(2) Анализ внутриклеточного распределения VA-lip миPHKgp46-FAM

Крысиные pPSCs (первичные звездчатые клетки поджелудочной железы, первичные PSC) рассеивали так, чтобы в отсек попало 1×10⁴ клеток в Lab-Tek chamber cover glass. VA-lip миPHKgp46-FAM или Lip миPHKgp46-FAM добавляли к клеткам так, чтобы конечная концентрация миРНК составляла 50 нМ. Клетки культивировали в 10% FBS-содержащем DMEM в течение 30 минут, и среду заменяли на свежую среду. Спустя 30 минут после этого и спустя 2 часа после обработки клетки промывали PBS три раза и фиксировали путем обработки 4%-ным параформальдегидом при 25°C в течение 15 минут. После фиксации клетки промывали PBS три раза и экспонировали в ProLong^® Gold с DAPI (Invitrogen) в течение 1 минуты, чтобы таким образом окрасить ядро. Внутриклеточную локализацию миPHKgp46, меченную FAM, оценивали, используя флуоресцентный микросокоп (Keyence, BZ-8000).

(3) Анализ FACS VA-lip миPHKgp46-FAM

Крысиные pPSCs (1×10⁴ клетки) обрабатывали VA-lip миPHKgp46-FAM (50 нМ миРНК) в присутствии 10%-ного FBS и культивировали в течение 30 минут. Для блокировки системы перед добавлением VA-lip миPHKgp46-FAM, 1×10⁴ клеток обрабатывали мышиным анти-RBP антителом (10 мкг/мл, BD Pharmingen), или мышиным IgGl (10 мкг/мл, Dako) в качестве отрицательного контроля в течение 30 минут. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) обработанных VA-lip миPHKgp46-FAM клеток оценивали, используя FACScalibur с программным обеспечением CellQuest (Becton Dickinson).

(4) Вестерн блоттинг

Чтобы оценить нокдаун-эффект миPHKgp46, осуществили эксперимент по Вестерн блоттингу. Более определенно, экстракты белка PSCs, соответственно обработанные VA-lip миPHKgp46 (1 нМ, 5 нМ, 50 нМ), VA-lip-миРНК рандомизированной (50 нМ), и Lip-миPHKgp46 (50 нМ) в течение 30 минут отделяли посредством 4/20 SDS-полиакриламидного геля, переносили на к нитроцеллюлезную пленку, метили антителом (Stressgen) для HSP47 (gp46) или антителом (Cell Signaling) для β-актина, и метили антителом, связанным с пероксидазой (Oncogene Research Products, Boston, MA), в качестве вторичного антитела. В заключении клетки визуализировали посредством ECL Western blotting detection system (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL).

Кроме того, чтобы подтвердить продолжительность подавления экспрессии gp46, PSCs обрабатывали VA-lip-миPHKgp46 (50 нМ) в течение 30 минут и затем культивировали в течение 24 часов, 48 часов, 72 часов и 96 часов, и после этого белок экстрагировали и подвергали эксперименту по Вестерн блоттингу таким же образом, как описано выше, вместе с 30 минутным экспериментом после обработки VA-lip-миРНК рандомизированной (50 нМ).

(5) Количественное определение продуцирования коллагена

Крысиные pPSCs рассеивали на 6-луночный планшет для культур клеток тканей при плотности 5×10⁴ клеток/лунку в 10% FBS-содержащем DMEM. После культивирования в течение 24 часов крысиные pPSCs обрабатывали VA-lip миPHKgp46 (50 нМ миРНК) и VA-lip миРНК рандомизированной (50 нМ миРНК). Клетки культивировали в 10% FBS-содержащем DMEM в течение 30 минут, и среду затем заменяли свежей средой. Спустя 72 часа после обработки клетки промывали PBS три раза, и коллаген, отложившийся в лунке, окрашивали с использованием sirius red (Biocolor, Belfast, UK) в соответствии с предыдущим сообщением (Williams et al. Gut 2001; 49:577-583). Несвязавшийся краситель удаляли промыванием и связанный комплекс растворяли в 0,5% гидроокиси натрия. Количественный анализ коллагена осуществили посредством анализ интенсивности поглощения при 540 нм, и результат выражали как процент относительно необработанной контрольной группы.

Результаты

Фиг. 11 показывает флуоресцентные изображения внутриклеточного распределения миРНК, меченной FAM. Два изображения слева являются флуоресцентными изображениями PSCs, обработанных VA-lip миPHKgp46-FAM, и два изображения справа являются флуоресцентными изображениями PSCs, обработанных Lip миPHKgp46-FAM. Верхние два изображения являются изображениями спустя 30 минут после обработки, и два изображения ниже являются изображениями спустя 2 часа после обработки. Спустя 30 минут после обработки VA-lip миPHKgp46-FAM, слабая зеленая флуоресценция, обусловленная FAM, мелкозернистой структуры наблюдалась в пределах цитоплазмы, и спустя 2 часа после обработки, более темная мелкозернистая структура наблюдалась в области вокруг ядра. По сравнению с ними в группе, обработанной Lip-миPHKgp46-FAM, никакая зеленая флуоресценция не наблюдалась спустя 30 минут после обработки и флуоресценции вокруг ядра спустя 2 часа после обработки была слабой.

Фиг. 12 показывает графики результатов анализа FACS. Результаты необработанной группы, группы, обработанной Lip siRNAgp46-FAM, группы, обработанной VA-lip siRNAgp46-FAM, группы, обработанной VA-lip siRNAgp46-FAM + RBP антитела, и группы, обработанной Lip siRNAgp46-FAM + RBP антитела, показаны в последовательности сверху вниз. В результатах анализа FACS, по сравнению с группой, обработанной VA-lip миPHKgp46-FAM, в группе, обработанной VA-lip siRNAgp46-FAM + RBP антитело, интенсивность флуоресценции была подавленной по сравнению с уровнем флуоресценции в группе, обработанной Lip-миPHKgp46-FAM, что подтверждает, что включение VA-lip миPHKgp46 в PSCs опосредована рецептором RBP.

Фиг. 13 показывает результаты Вестерн-блоттинга, которые демонстрируют различие в эффекте подавления в зависимости от концентрации. Наблюдали, что в клетках, обработанных VA-lip миPHKgp46, подавление экспрессии gp46, зависело от концентрации VA-lip миPHKgp46, причем экспрессия почти полностью подавлялась при 50 нМ, тогда как подавление экспрессии не наблюдалось с VA-lip миРНК рандомизированной или Lip миPHKgp46.

Фиг. 13B показывает результат Вестерн-блоттинга для установления продолжительности эффекта подавления. Когда обрабатывали VA-lip миPHKgp46, в клетках, культивированных в течение 72 часов после обработки, наблюдалось заметное подавление gp46. Таким образом, было подтверждено, что эффект подавления экспрессии gp46 продолжался в течение по меньшей мере 72 часа после обработки.

Фиг. 14 представляет собой график, показывающий количественное определение коллагена, продуцированного через 72 часа в необработанных клетках, и клетках, обработанных VA-lip миPHKgp46 и VA-lip миРНК рандомизированная, соответственно. По сравнению с необработанными клетками и клетками, обработанными VA-lip миРНК рандомизированная, при обработке VA-lip миPHKgp46, было подтверждено заметное подавление продуцирования коллагена.

Обсуждение

Из результатов, описанных выше, можно заметить, что in vitro VA-lip миPHKgp46 включается специфически в PSCs посредством опосредованной рецептором RBP инкорпорации, чтобы таким образом подавлять экспрессию gp46, и в результате продуцирование коллагена было заметно подавлено. Это предполагает, что в поджелудочной железе, затронутой фиброзом поджелудочной железы, VA-lip миPHKgp46 может редуцировать коллаген.

Пример 4. Эксперимент регенеративной терапии крысиной модели фиброза поджелудочной железы

(1) Получение крысиной модели фиброза поджелудочной железы

Использовали самцов крыс Lewis, имеющих массу тела 150-200 г (Charles River). В соответствии с предыдущим сообщением (Inoue et al. Pancreas 2002; 25: e64-70), дихлорид дибутилолово (Dibutyltin dichloride, DBTC) растворяли в 1 части этанола и затем смешивали с 2 частями глицерина и 2 частями диметилсульфоксида (ДМСО), чтобы таким образом приготовить раствор (раствор DBTC), и количество, соответствующее 5 мг (DBTC)/кг (массы тела), вводили в правую сонную артерию крысы посредством шприца.

(2) Локализация in vivo VA-lip миPHKgp46-FITC в крысиной поджелудочной железе и других тканях

Через 43 дня после начального введения DBTC, в момент, когда наблюдался серьезный фиброз поджелудочной железы, 1 мкл/г массы тела вводили VA-lip миPHKgp46-FITC или Lip-миPHKgp46-FITC в крысу, обработанную DBTC, через хвостовую вену. Введение осуществляли при нормальном давлении три раза через день по 0,75 мг/кг миРНК каждый раз. Спустя 24 часа после заключительного введения, крысу умерщвляли посредством перфузии физиологическим раствором и забирали поджелудочную железу и другие органы (печень, легкое, селезенку и сетчатку). Образцы органа фиксировали 10%-ным параформальдегидом, и включенные в парафин срезы окрашивали, использую окрашивание по Azan-Mallory. Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли посредством метода декстранового полимера, используя каждое моноклональное антитело: анти-/U03B1/SMA антитело (1:1000, Sigma), анти-CD68 антитело (1:500, Dako) и анти-FITC антитело (1:500, Abcam) и посредством Envision Kit (Dako), и последующим окрашиванием посредством DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) и окрашивание ядра посредством раствора гематоксилина Джилла (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

(3) Вестерн-блоттинг

Чтобы оценить продолжительность подавления экспрессии посредством миPHKgp46 in vivo, белковые экстракты из поджелудочной железы 0, 1, 2, 3 и 4 дня спустя после внутривенного введения VA-lip миPHKgp46 подвергали Вестерн-блоттингу таким же образом, как в Примере 3.(4).

(4) Обработка миPHKgp46 in vivo

Три группы крыс (n=6 на группу) использовали для гистологической оценки. Спустя 43 дня после введения DBTC, каждую группу обрабатывали введением PBS, VA-lip миРНК рандомизированная и VA-lip-миPHKgp46 10 раз соответственно (0,75 мг/кг миРНК, вводимой 10 раз каждый второй день). Все введения осуществляли через хвостовую вену при нормальном давлении в количестве 1 мкл/г массы тела. Поджелудочную железу фиксировали 10%-ным параформальдегидом и заключали в парафин, и срез затем окрашивали, используя окрашивание по Azan-Mallory и окрашивание гематоксилином-эозином. Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли методом декстранового полимера, используя моноклональные анти-/U03B1/SMA антитела (1:1000, Sigma), и посредством Envision Kit (Dako), и впоследствии осуществляли окрашивание посредством DAB (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) и окрашивание ядра посредством раствора гематоксилина Джилла (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Чтобы выполнить точное количественное определение областей, окрашенных по Azan-Mallory, гематоксилином-эозином и α-SMA, шесть областей с малым увеличением (100×) случайным образом выбирали для каждого среза поджелудочной железы крысы и исследовали с использованием микроскопа (Axioplan 2; Carl Zeiss, Inc). Цифровое изображение захватывали посредством системы видеозаписи, используя систему камеры цифрового телевидения (Axiocam High Resolution color, Carl Zeiss, Inc.). Доля области, окрашенной по Azan-Mallory и α-SMA на цифровой микрофотографии, определяли, используя аналитическую программу автоматического программного обеспечения (KS400, Carl Zeiss, Inc.).

(5) Определение гидроксипролина

Содержание гидроксипролина определяли методом Weidenbach в соответствии с предыдущим сообщением (Weidenbach et al. Digestion 1997; 58:50-57). Коротко, клеточные дебрисы поджелудочной железы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут, осадок полностью гидролизировали в 6 н. HCl при 96°C в течение 16 часов, pH поддерживали от 6,5 до 7,5, и затем его снова подвергали центрифугированию (при 3000 об/мин в течение 15 минут). 25 мкл аликвоты высушивали при 60°C, и преципитат растворяли в 1,2 мл 50%-ного изопропилового спирта и инкубировали в 200 мл буфера уксусная кислота/лимонная кислота (pH 6,0), содержащим 0,56% раствор хлорамина Т (Sigma). После инкубации при 25°C в течение 10 минут, добавляли 1 мл реактива Эрлиха, и смесь инкубировали при 50°C в течение 90 минут. После охлаждения измеряли поглощение на длине волны 560 нм.

(6) Активность коллагеназы клеточного дебриса поджелудочной железы

Измерение активности коллагеназы осуществляли посредством модифицированного метода предыдущего сообщения (Iredale et al. J. Clin. Invest. 1998; 102:538-549). Коротко, поджелудочную железу, полученную от крысы дикого типа и от крысы с моделью фиброза поджелудочной железы и замороженную в жидком азоте, измельчали на льду в буфере для образцов (50 мМ Трис, pH 7,6, 0,25% Тритон Х-100, 0,15 М NaCl, 10 мМ CaCl₂), содержащем ингибитор сериновых и тиоловых протеаз (PMSF 0,1 мМ, 10 мкм леупептина, 10 мкм пепстатина, 25 мкг/мл апротина, 0,1 мМ иодацетамида). Клеточные дебрисы центрифугировали при 4°C и 14000 g в течение 30 минут, таким образом удаляя клеточные остатки и агрегированный белок. Активность коллагеназы в клеточном дебрисе поджелудочной железы определяли, используя EnzCheck Collagenase Assay Collagen Conjugate kit (Molecular Probes) в соответствии с инструкцией. Параллельно этому осуществили анализ, используя соответствующий отрицательный контроль и положительный контроль (бактериальная коллагеназа), и результаты выражали как флуоресценция деградированного коллагена на мг белка (определенного по оптической плотностью при 280 нм по сравнению со стандартом сывороточного альбумина).

Результаты

В последовательных срезах поджелудочной железы активированные звездчатые клетки и миPHKgp46-FITC иммуноокрашивали, и результаты состояли в том, что в группе обработанных VA-lip siRNAgp46-FITC, в области, где активированные звездчатые клетки (α-SMA-позитивные клетки) агрегировали, идентифицировали FITC-позитивные клетки, тогда как в группе, обработанных Lip-миPHKgp46-FITC, число FITC-позитивных клеток, идентифицированных в α-SMA-позитивной области, было очень незначительным (Фиг. 15A и B).

FITC-позитивные клетки в α-SMA-позитивной области также наблюдались в образце печени (Фиг. 15C). Этот результат соответствует известным фактам, что DBTC не только вызывает фиброз поджелудочной железы, но также и цирроз печени. В других органах крысы, включая легкое и селезенку, окрашенных FITC было немного клеток в области с инфильтрацией макрофагов (CD68-позитивные-клетки) (Фиг. 15D и Е), что наводит на мысль о неспецифической инкорпорации миPHKgp46-FITC в макрофаги. Сетчатка была негативна при FITC окрашивании (Фиг. 15F), и это соответствует известным фактам, полученным при использовании VA-lip миPHKgp46-FAM при циррозе печени. Считается, что глазное яблоко, вероятно, строит независимую систему вследствие низкой проницаемости гематоретинального барьера.

Было подтверждено по результатам Вестерн-блоттинга, что также in vivo эффект миPHKgp46 в подавлении экспрессии gp46 продолжался в течение по меньшей мере 3 дней (Фиг. 16A и B).

DBTC-обработанную крысу, в которую VA-lip миPHKgp46 вводили 10 раз, оценивали посредством окрашивания по Azan-Mallory (Фиг. 17A). Фиброзная область, как определено компьютерным анализом изображения, была заметно уменьшена в образце из группы, обработанной VA-lip миPHKgp46, по сравнению с контрольным образцом (P<0,01) (Фиг. 17B). Этот результат совпал с данными, показывающими очевидную супрессию гидроксипролина в поджелудочной железе группы, обработанной VA-lip миPHKgp46 (Фиг. 17C).

Чтобы оценить изменение в звездчатых клетках в поджелудочной железе крысы после обработки VA-lip миPHKgp46, образец поджелудочной железы крысы после обработки VA-lip миPHKgp46 подвергали окрашиванию α-SMA, и результат показал, что число α-SMA-позитивньгх клеток заметно уменьшился по сравнению с крысой, обработанной Lip миPHKgp46 и PBS (Фиг. 18A и B).

Активность коллагеназы в клеточном дебрисе поджелудочной железы крысы дикого типа и обработанной VA-lip миPHKgp46 DBTC-обработанной крысы измеряли на основе предположения, что положительная динамика фиброза, последующего за супрессией секреции нового коллагена из PSCs посредством введения VA-lip миPHKgp46, вовлекает коллагеназу, полученную из клеток воспаления и собственно PSCs, и результаты, показаны в таблице, приведенной ниже Таблице 1.

Как показано в таблице, активность коллагеназы у DBTC-обработанной крысы была почти такой же, как активность в крысе дикого типа.

Сравнивая изображения, окрашенные гематоксилином-эозином, образцов поджелудочной железы, обработанных VA-lip миPHKgp46 и обработанных Lip-миPHKgp46, DBTC-обработанных крыс на 65-ый день, в обработанной VA-lip siRNAgp46 крысе, наблюдалась, хотя не полностью, очевидная нормализация ткани поджелудочной железы, тогда как в обработанной Lip-миPHKgp46 крысе нормализация ткани крысы не наблюдалась (Фиг. 19A). Это совпало с нормализацией массы поджелудочной железы у обработанной VA-lip миPHKgp46 DBTC-обработанная крысе (Фиг. 19B).

Обсуждение

Из вышеупомянутых результатов можно отметить, что вследствие обработки VA-lip миPHKgp46, миPHKgp46 специфически включается в активированные звездчатые клетки поджелудочной железы (aPSCs), чтобы таким образом подавлять экспрессию gp46; в результате секреция коллагена из aPSCs подавлена, и таким образом демонстрируется значительный эффект в положительной динамики фиброза поджелудочной железы. Кроме того, наблюдалось заметное уменьшение aPSCs, что, вероятно, происходит вследствие сокращения секреции коллагена. Достойно специального замечания тот факт, что обработка VA-lip миPHKgp46 не только привела к положительной динамики фиброза поджелудочной железы, но также и вызвала восстановление ткани поджелудочной железы. Принимая это во внимание вместе с результатами Примера 2, описанными выше, эти результаты подтверждают, что уменьшение коллагена, накопленного в фиброзной ткани, позволяет нормальной ткани тканенеспецифически регенерироваться из фиброзной ткани.

Пример 5. Важность пространства для роста и дифференцировки стволовых клеток

Активированные звездчатые клетки печени (aHSCs) совместно культивировали с печеночными клетками-предшественниками с различной плотностью, и исследовали эффект существования пространства вокруг клеток на дифференцирование печеночных клеток-предшественников. В качестве печеночных клеток-предшественников, использовали GFP-меченные стволовые клетки печени крысы, полученные в Примере 2(2), приведенном выше, и в качестве aHSCs использовали HSCs, полученные от SD крысы, культивированные и пассированные один раз. aHSCs получали и культивировали следующим образом. Сначала, SD крысу перфузировали раствором EGTA и раствором коллагеназы, получали печень, и полученную печень тонко нарезали и фильтровали с использованием клеточного сита (диаметр пор 100 мкм). Добавляли HBSS + 0,25% раствор BSA к суспензии клеток, полученной таким образом, и смесь центрифугировали при 4°C и 500 об/мин в течение 2 минут. Супернатант отделяли и центрифугировали при 4°C и 1300 об/мин в течение 5 минут. После того, как супернатант удалили, добавляли HBSS + 0,25% раствор BSA, и 28,7% раствор Nycodenz (Axis Shield, Oslo, Norway) добавляли так, чтобы концентрация Nycodenz составляла 13,2%, и перемешивали. После наслоения HBSS + раствор 0,25% BSA осуществляли центрифугирование при 4°C и 1400×g в течение 20 минут. После того как центрифугирование было завершено, промежуточный слой отделяли и культивировали с использованием модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM) + 10%-ой среды эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в течение 5 дней. Пассирование осуществили на пятый день культивирования, и клетки использовали в настоящем эксперименте.

aHSCs рассеивали на cell culture inserts (диаметр пор 0,4 мкм, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) при плотности 5×10⁴ клеток/лунку и культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂, используя DMEM + 10%-ый FBS в течение 48 часов. Спустя 2 дня после рассеивания aHSCs, печеночные клетки-предшественники рассеивали на 24-луночный планшет (BD Falcon), оборудованный покрытым коллагеном покровным стеклом тип I (IWAKI, Tokyo, Japan) при плотности 1×10⁴ клетки/лунку (низкая плотность) и 5×10⁵ клеток/лунку (конфлюэнтный). Впоследствии, вышеупомянутые cell culture inserts, содержащие aHSCs, вводили в лунки 24-луночного планшета и культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% СО₂ в течение 10 дней (в качестве среды использовали DME/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham) + 10%-ый FBS + (10 мг/л инсулина, 5,5 мг/л трансферрина, 0.67 мкг/л селена) + 0.1 мкМ дексаметазона + 10 мМ никотинамида + 50 мкг/мл β-меркаптоэтанола + 2 мМ L-глутамина + 5 мМ Hepes).

На 10-й день совместного культивирования осуществляли иммуноокрашивание с использованием антиальбуминового антитела (кроличье поликлональное, MP Biomedicals), положительные по альбумину колонии визуализировали с использованием инвертированного микроскопа (Nikon) с увеличением 100×, и на основе полученного изображение рассчитывали площадь альбумин-положительных колоний, используя программное обеспечение NIS-Elements software (Nikon). Результаты показаны на Фиг. 20.

В другом эксперименте на 10-ый день совместного культивирования, осуществляли измерение роста клеток, используя Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara, Tokyo, Japan) с ридером микропланшетов (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Результаты показаны на Фиг. 21.

Их результатов, показанных на Фиг. 20, стало очевидно, что, когда aHSCs совместно культивировали с печеночными клетками-предшественниками, посеянными в низкой плотности, печеночные клетки-предшественники дифференцировались в большое количество альбумин-положительных гепатоцитов, но когда печеночные клетки-предшественники были конфлюэнтны, только очень небольшое число дифференцировалось в гепатоциты. Когда печеночные клетки-предшественники культивировали отдельно, они не дифференцировались в альбумин-положительные гепатоциты. Кроме того, как показано на Фиг. 21, когда печеночные клетки-предшественники засеивали при той же плотности, как описывалось выше, пролиферативная потенция была меньшей при конфлюэнтных условиях, чем в условиях низкой плотности.

Вышеупомянутые результаты показали, что активированные звездчатые клетки вызывают рост и дифференцировку стволовых клеток, и существование физического пространства вокруг стволовых клеток оказывает важный эффект на рост и дифференцировку стволовых клеток. Когда это учитывается вместе с результатами Примеров, приведенных выше, это показывает, что вещество, уменьшающее коллаген, приводит к уменьшению фиброзной ткани в фиброзной ткани, вокруг стволовых клеток образуется пространство, и в результате стволовые клетки растут и дифференцируются, таким образом регенерируя нормальную ткань.