Способ видового определения микобактерий туберкулеза у инфицированного пациента

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.

Известно, что установление вида возбудителя туберкулеза определяет вариант этиотропной антибактериальной терапии. В настоящее время видовая идентификация Mycobacterium tuberculosis осуществляется на основании данных культуральных и молекулярно-генетических исследований. Однако первая группа методов трудоемка, длительна в исполнении, сопряжена с риском заражения исследователя и требует организации специального комплекса помещений для проведения анализа. Вторая группа методов предполагает наличие недешевого оборудования, реагентов, одноразовых расходных материалов и специальной организации лабораторного пространства. В обоих случаях результат будет в значительной степени зависеть от активности бактериовыделения и качества взятия материала на исследование.

Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза (RU 2491551 С1). Способ включает определение в гепаринизированной венозной крови in vitro уровня лимфоцитов с рецепторами CD45⁺ маркеров, меченных флюороизотианатом после инкубации крови с антигенным материалом микобактерий (опытная проба) и физиологическим раствором (контрольная проба), и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45⁺ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной более чем на 20% делают заключение о видовой идентификации микобактерий. При этом в известном способе в контрольной пробе в качестве растворителя используется физиологический раствор - 0,9% солевой раствор NaCl.

Известно, что в опытной пробе с Диаскинтестом в пересчете на 0,2 мл Диаскинтеста (2 дозы препарата по 0,1) кроме белка рекомбинантного CFP10-ESAT6 - 0,4 мкг (2 дозы по 0,2 мкг), натрия хлорида - 0,92 мг (2 дозы по 0,46 мг) и воды для инъекций - до 0,2 мл (2 дозы до 0,1 мл) содержатся дополнительные компоненты:

- натрий фосфорнокислый двузамещенный 2-водный - 0,47752 мг (2 дозы по 0,3876 мг);

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,126 мг (2 дозы по 0,063 мг);

- фенол - 0,5 мг (2 дозы по 0,25 мг);

- полисорбат 80 - 0,01 мг (2 дозы по 0,005 мг);

В опытной пробе вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида (BCG), в перерасчете на 0,2 мл используется 20 доз препарата ((0,1 мл на 10 доз)*2) кроме 1 мг микробных клеток БЦЖ ((0,5 мг микробных клеток на 10 доз)*2) и физиологического раствора до 0,2 мл ((0,1 мл на 10 доз)*2), дополнительно содержится 6 мг глутамата натрия ((3 мг на 10 доз)*2).

Недостатком способа являются погрешности, возникающие при сопоставлении результатов опытных проб с контрольной вследствие различий компонентного состава растворителя, что приводит к снижению точности видовой идентификации микобактерий туберкулеза.

Технический результат - повышение точности способа, возможность видового определения микобактерий туберкулеза с использованием различных лекарственных форм аллергенов.

Технический результат достигается тем, что для сравнения с опытными пробами используют контрольные пробы, компонентный состав растворителя которых идентичен компонентному составу растворителя антигенного вещества сравниваемой опытной пробы.

Так в качестве контроля к Диаскинтесту используют раствор следующего состава: 0,92 мг натрия хлорида, 0,47752 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного, 0,126 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,5 мг фенола, 0,01 мг полисорбата 80 и до 0,2 мл воды для инъекций, идентичный компонентному составу растворителя Диаскинтеста.

Для контроля пробы вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида (BCG), используют раствор, содержащий 6 мг глутамата натрия и до 0,2 мл физиологического раствора - соответствующий компонентам растворителя вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида (BCG).

Предлагаемый способ позволяет повысить точность способа видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза, обусловленную созданием идентичных по компонентному составу сравниваемых смесей растворителя, снизить влияние на результат исследования ингредиентов солевой смеси. Также способ дает возможность проводить видовое определение микобактерий туберкулеза с использованием других лекарственных форм аллергенов - вне зависимости от компонентного состава растворителя антигенов Mycobacterium tuberculosis.

Причинами разработки предлагаемого способа послужили следующие положения:

1. В состав Диаскинтеста в качестве консерванта входит 0,5 мг фенола, создавая 0,25% раствор. Как известно, еще в 1914 году А. Флемингу удалось доказать, что фенол (гидроксибензол, карболовая кислота) «убивает» лейкоциты (CD45⁺ клетки), создающие естественный иммунный барьер ран [1]. В настоящее время показано, что наибольшим поражающим эффектом обладает растворенная форма соединения, вызывающая воспалительную реакцию, основными участниками которой являются лейкоциты. Доказано изменение функционально-метаболической активности лейкоцитов под воздействием фенола [2], что может привести к снижению доли клеток, несущих на своей поверхности маркер CD45⁺.

2. Экспрессия на клетках поверхностных маркеров (в данном случае, CD45⁺) зависит от разных факторов, в том числе от ионного состава среды. Препарат Диаскинтест, содержащий в своем составе комплекс буферных солей натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного и калия фосфорнокислого однозамещенного, позволяет создать оптимальную среду для существования in vitro клеток крови. Использование незабуференного физиологического раствора в качестве контроля против применения забуференного опытной пробы в прототипе не является корректным при исследовании рецепторного аппарата клетки.

3. Полисорбат 80 (твин 80), входящий в состав Диаскинтеста, является возбудителем анафилактоидных реакций [3], инициирует воспаление некоторых тканей [4]. Его структура подобна белкам, образующим мембрано-атакующий комплекс, приводящим к туннелизации клеток и последующему их разрушению. Сравнительный анализ суспензии клеток, растворенных в солевом растворе, содержащем Полисорбат 80, необходимо проводить, используя в качестве контрольного образца жидкость, содержащую тот же компонент.

4. В эксперименте доказана способность глутамата натрия стимулировать увеличение количества лимфоцитов. Число клеток в сравнении с контролем может возрастать на 12% и более [5], что отразится на результатах проводимых исследований. Во избежание существенной погрешности измерения оптимальным является введение глутамата натрия в контрольную пробу.

Предлагаемый способ видового определения микобактерий туберкулеза у инфицированного пациента является новым и соответствует критерию «изобретательский уровень».

Способ осуществляют следующим образом. У пациента в условиях соблюдения правил асептики и антисептики стандартным образом забирают периферическую кровь в пробирку, содержащую антикоагулянт (гепарин лития) в объеме 5-7 мл. В четыре пробирки вносят по 1 мл крови. В каждую из них добавляют по 0,2 мл раствора содержащего:

Пробирка №1 (контрольная проба Диаскинтеста): 0,92 мг натрия хлорида, 0,47752 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного 0,126 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,5 мг фенола, 0,01 мг полисорбата 80 и до 0,2 мл воды для инъекций;

Пробирка №2 (опытная проба Диаскинтеста): 0,2 мл Диаскинтеста;

Пробирка №3 (контрольная проба вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG): 6 мг глутамата натрия и до 0,2 мл физиологического раствора;

Пробирка №4 (опытная проба BCG): 0,2 мл вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG.

После смешивания крови с растворами пробирки инкубируют при температуре 37С° 24 часа. Далее выполняют стандартные манипуляции, используемые при исследовании методом проточной цитофлуориметрии для оценки экспрессии антигена CD45⁺ на поверхности лимфоцитов. В частности, из каждой пробирки опытных и контрольных проб отбирают по 100 мкл образца, окрашивают взятые объемы моноклональными антителами против CD45⁺ в течение 30 минут в темноте путем инкубирования при комнатной температуре, впоследствии разрушают мешающие анализу эритроциты гемолитической смесью и на проточном цитофлуориметре определяют процент меченых лимфоцитов при гетерогенном гейтировании клеток (основываясь на морфологических характеристиках и окрашивании флуоресцентным красителем).

По снижению количества меченных флуоресцентным красителем клеток в опытной пробе относительно контрольной заключают, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с кровью в опытной пробирке. Расчет показателя выполняют по формуле: (контроль-опыт)/контроль*100%. Снижение расчетного показателя на величину более 20% рассматривают в качестве показателя инфицирования исследованным агентом, изменение на величину, равную и менее 20%, расценивают как отсутствие инфицирования исследованным агентом.

Способ позволяет более точно установить видовую принадлежность возбудителя заболевания, подтвердить наличие инфицирования, определить эффективность вакцинации. Способ быстровыполнимый. Может быть использован в качестве скринингового метода в общей лечебной сети и противотуберкулезных учреждениях для определения вида микобактерий туберкулеза человеческого вида или вакцинного штамма.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациент И., 10 лет. Вакцинация BCG проведена в роддоме (поствакцинальный рубец - 10 мм). Направлен на обследование в связи с увеличением постпрививочного знака. Последняя проба Манту - размер папулы 14 мм. У пациента была взята кровь на исследование. Выполнены лабораторные манипуляции, включавшие смешивание по 1 мл гепаринизированной крови с растворами в четырех пробирках.

Пробирка №1 (контрольная проба Диаскинтеста) - 0,2 мл солевого раствора, содержащего: 0,92 мг натрия хлорида, 0,47752 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного, 0,126 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,5 мг фенола, 0,01 мг полисорбата 80 и до 0,2 мл воды для инъекций.

Пробирка №2 (опытная проба диаскинтеста) - 0,2 мл Диаскинтеста.

Пробирка №3 (контрольная проба вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG) - 0,2 мл солевого раствора, содержащего: 6 мг глутамата натрия и до 0,2 мл физиологического раствора.

Пробирка №4 (опытная проба BCG) - 0,2 мл вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG.

Получены следующие результаты:

Пробирка №1 - 58% CD45⁺-лимфоцитов (контрольная проба Диаскинтеста);

Пробирка №2 - 56% (опытная проба Диаскинтеста);

Пробирка №3 - BCG - 61% (контрольная проба вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида);

Пробирка №4 - 39% (опытная проба BCG).

Выполнение расчета:

Проба с Диаскинтестом: (контроль-опыт)/контроль*100%=(58-56)/58*100%=3,4% (снижение менее 20%)

Проба с вакцинным штаммом, представляющим антигены микобактерий бычьего вида - BCG: (контроль-опыт)/контроль*100%=(61-39)/61*100%=36,1% (снижение более 20%).

Заключение: наличие инфицирования микобактериями туберкулеза бычьего вида.

Пример 2. Пациентка Б., 12 лет. В роддоме выполнено вакцинирование BCG (поствакцинальный рубец 7,5 мм). Результаты ежегодных туберкулиновых проб Манту, выполненных в поликлинике по месту жительства, детском дошкольном учреждении, общеобразовательной школе согласно данных прививочного сертификата: 9, 7, 7, 8, 9, 7, 8, 9, 8, 11, 11. Незначительное увеличение результата не позволяет с уверенностью утверждать наличие инфицирования патогенным штаммом. Направлена на дополнительное обследование для проведения лабораторного исследования на предмет установления видовой принадлежности возбудителя заболевания. У обследуемой согласно вышеописанной методике для исследования была взята кровь с антикоагулянтом. В пробирки внесены следующие компоненты:

Пробирка №1 (контрольная проба Диаскинтеста): 1 мл крови + 0,2 мл солевого раствора, содержащего: 0,92 мг натрия хлорида, 0,47752 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного 2-водного 0,126 мг калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,5 мг фенола, 0,01 мг полисорбата 80 и до 0,2 мл воды для инъекций;

Пробирка №2 (опытная проба Диаскинтеста): 1 мл крови + 0,2 мл Диаскинтеста;

Пробирка №3 (контрольная проба вакцинного штамма - BCG): 1 мл крови + 0,2 мл солевого раствора, содержащего: 6 мг глутамата натрия и до 0,2 мл физиологического раствора;

Пробирка №4 (опытная проба BCG): 1 мл крови + 0,2 мл вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG. Выполнены лабораторные исследования. Количество CD45+ лимфоцитов в пробирках: №1 - 65%, №2 - 41%, №3 - 68%, №4 - 67%. Выполнение расчета:

Проба с Диаскинтестом: (контроль-опыт)/контроль*100%=(65-41)/65*100%=36,9% (снижение более 20%)

Проба с вакцинным штаммом, представляющим антигены микобактерий бычьего вида - BCG: (контроль-опыт)/контроль*100%=(68-67)/68*100%=1,5% (снижение менее 20%)

Заключение: наличие инфицирования микобактериями туберкулеза человеческого вида.

Пример 3. (Использование других лекарственных форм аллергенов для видового определения микобактерий туберкулеза, например аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении).

Пациентка P., 12 лет. Вакцинирована в родильном доме (поствакцинальный рубец 7 мм). Ежегодно выполнялись туберкулиновые пробы Манту. Результат последней был представлен инфильтративным уплотнением размером 10 мм. Клинико-рентгенологические данные соответствуют наличию активного туберкулеза. В семье отец более трех лет болен туберкулезом легких. Проведено видовое определение микобактерий туберкулеза у инфицированного пациента с использованием лабораторного исследования крови. В четырех пробирках были смешаны по 1 мл крови и:

Пробирка №1 (контрольная проба аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении) - натрия гидрофосфата гептагидрат - 1,566 мг, натрия хлорид - 0,914 мг, калия дигидрофосфат - 0,126 мг, полисорбат - 80 - 0,01, фенол - 0,5 мг.

Пробирка №2 (опытная проба аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении) - 0,2 мл аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении, содержащего две дозы активного вещества аллергена туберкулопротеина по - 2 ТЕ (туберкулиновые единицы).

Пробирка №3 (контрольная проба вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG) - 6 мг глутамата натрия и до 0,2 мл физиологического раствора.

Пробирка №4 (опытная проба BCG) - 0,2 мл вакцинного штамма, представляющего антигены микобактерий бычьего вида - BCG.

По результатам иммунофенотипирования количество CD45+ лимфоцитов в пробирках составило: №1 - 58%, №2 - 39%, №3 - 65%, №4 - 62%.

Выполнение расчета:

Проба с Диаскинтестом: (контроль-опыт)/контроль*100%=(58-39)/58*100%=32,8% (снижение более 20%)

Проба с вакцинным штаммом, представляющим антигены микобактерий бычьего вида - BCG: (контроль-опыт)/контроль*100%=(65-62)/65*100%=4,6% (снижение менее 20%)

Заключение: наличие инфицирования микобактериями туберкулеза человеческого вида.

Преимущество заявляемого способа перед известными заключается в повышенной точности исследования в сравнении с прототипом, возможности выполнения исследования с использованием других лекарственных форм аллергенов (вне зависимости от компонентного состава растворителя антигенов Mycobacterium tuberculosis), снижении времени на исследование в сравнении с известными аналогами. Данный способ может найти широкое клиническое применение в диагностических лабораториях противотуберкулезных учреждений и общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза.

Используемая литература

1. Опимах И.В. История антисептики - борьба идей, честолюбия, амбиций… // Медицинские технологии. Оценка и выбор. - 2010. - №2. - С. 74-80. (С. 78).

2. Лазарев Н.В. Вредные вещества в промышленности / М.: Книга по требованию, 1977. - 589 с. (С. 404-406).

3. Coors Е.А., Seybold Н., Merk H.F., Mahler V. Polysorbate 80 in medical products and nonimmunologic anaphylactoid reactions // Ann Allergy Asthma Immunol. - 2005. - №95(6). - P. 593-599.

4. Yuan Z.Y., Hu Y.L., Gao J.Q. Brain localization and neurotoxicity evaluation of polysorbate 80-modified chitosan nanoparticles in rats // PLoS One. - 2015. - №10(8). - e. 0134722.

5. Kumar S., Kumar N., Kumar B. Evaluation of mono sodium glutamate induced nephrotoxicity in adult Wistar albino rats // World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences. - 2015. - Vol. 4. - Iss. №4. - P. 846-862.