Результат интеллектуальной деятельности: Способ борьбы с личинками металловидки серой

Изобретение относится к области защиты растений и может быть использовано для борьбы с металловидкой серой на стадии личинки.

За последнее десятилетие постгеномный подход продемонстрировал высокий потенциал в борьбе с насекомыми-вредителями, в частности чешуекрылыми. Препараты на основе нуклеиновых кислот способны объединить в себе наилучшие характеристики современных инсектицидов: быстродействие и доступность от химических инсектицидов и избирательность от биологических препаратов. В основе идеи разработки и применения таких препаратов лежат техники посттранскрипционной блокировки экспрессии важных для жизни клеток генов насекомых с помощью механизмов РНК-интерференции и ДНК-интерференции, а также технологий применения антисмысловых олигонуклеотидов.

Известен способ контроля численности листогрызущих насекомых при помощи механизма РНК-интерференции [Wang Y., Zhang Н., Li Н., Miao X. (2011). Second generation sequencing supply an effective way to screen RNAi targets in large scale for potential application in pest insect control. PLoS ONE. 6(4): e17644.], в котором используются двухцепочечные фрагменты РНК, получаемые путем синтеза in vitro необходимого фрагмента и его наружное применение на насекомом.

Недостатком этого метода является то, что используемые сравнительно длинные двухцепочечные фрагменты РНК могут иметь побочные негативные эффекты, потому что двухцепочечная РНК (длиной около нескольких сотен пар нуклеотидов) расщепляется в клетках на многочисленные, непредсказуемые и короткие (21-23 нуклеотида длиной) малые интерферирующие РНК, которые могут оказаться комплементарными и заблокировать экспрессию генов некоторых нецелевых организмов. Во-вторых, химический синтез двухцепочечной РНК в настоящее время является слишком дорогим (на порядок дороже, чем синтез ДНК), чтобы быть более конкурентоспособными по сравнению с современными химическими инсектицидами для эффективной борьбы с насекомыми-вредителями в полевых условиях.

В качестве прототипа выбрано наиболее близкое по совокупности существенных признаков и достигаемому техническому результату решение - способ борьбы с личинками листогрызущих насекомых [Oberemok V.V. DNA insecticides based on iap3 gene fragments of cabbage looper and gypsy moth nuclear polyhedrosis viruses shows electivity for non-target insects / Oberemok V.V., Laikova K.V., Zaitsev A.S., Nyadar P.M., Shumskykh M.N., Gninenko Yu.I. // Archives of Biological Sciences. - 2015. - V. 67(3). - P. 785-792], включающий использование инсектицидов на основе нуклеиновой кислоты, при совместном использовании 2-х коротких фрагментов длиной по 18 нуклеотидов одноцепочечных смыслового и антисмыслового фрагментов генома бакуловируса из консервативного домена RING гена IAP вируса ядерного полиэдроза металловидки серой 5'-CGACATGACCGCAAGGTA-3' (антисмысловой) и 5'-ACCCATAGAGTTGGCAAT-3' (смысловой) при наружной обработке личинок насекомого раствором данного фрагмента в концентрации 100 пмоль/мкл.

Техническим результатом изобретения является снижение себестоимости препарата, упрощение технологии его производства, а также уменьшение вероятности неспецифического негативного воздействия на нецелевых организмов за счет использования всего одного фрагмента ДНК - антисмыслового.

Решение поставленной задачи в борьбе с металловидкой серой включает использование инсектицида на основе нуклеиновой кислоты с использованием короткого (18 нуклеотидов) одноцепочечного антисмыслового фрагмента генома бакуловируса из консервативного домена RING гена IAP вируса ядерного полиэдроза металловидки серой 5'-CGACATGACCGCAAGGTA-3' при наружной обработке личинок насекомого раствором данного фрагмента в концентрации 50 пмоль/мкл таким образом, чтобы на личинку I-II возрастов попало не менее 0,1-0,3 мкл раствора, при этом используют один фрагмент данного генома бакуловируса.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что для борьбы с металловидкой серой используется один короткий 18 нуклеотидов длиной антисмысловой фрагмент ДНК антиапоптозного гена ее бакуловируса.

Автором заявляемого технического решения впервые выявлено достоверное инсектицидное влияние одного короткого одноцепочечного фрагмента антиапоптозного гена IAP вируса ядерного полиэдроза на личинок металловидки серой. И поскольку влияние этого фрагмента в одиночку на личинки металловидки серой выявлено впервые, это доказывает, что изобретение соответствует критериям новизны и неочевидности.

Пример конкретного осуществления способа

Для экспериментов были использованы гусеницы металловидки серой (Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae)). В среднем для каждого варианта группы эксперимента были использованы 15-16 гусениц I-II личиночных возрастов. На насекомых с помощью пульверизатора был нанесен водный раствор фрагментов в концентрации 50 пмоль/мкл в количестве не менее 0,1-0,3 мкл на гусеницу. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP (Inhibitor of Apoptosis, ингибитор апоптоза) вируса ядерного полиэдроза металловидки серой была 5'-GACATGACCGCAAGGTA-3'. Гусеницы из контрольных групп были обработаны водой или контрольным олигонуклеотидом со следующей последовательностью: 5'-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'. Фрагменты были синтезированы компанией Eurofins MWG Operon (Германия). Все насекомые выращивались на стандартной питательной среде, основанной на проростках пшеницы при температуре 25°С. Был использован непараметрический χ²-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Эксперимент с гусеницами I-II личиночных возрастов металловидкой серой повторили трижды.

Эксперимент впервые выявил достоверное инсектицидное влияние антисмыслового фрагмента домена RING антиапоптозного гена IAP вируса ядерного полиэдроза на гусениц металловидки серой по сравнению с контрольной группой насекомых, обработанных водой. Наоборот, контрольный олигонуклеотид не обнаружил достоверного инсектицидного действия на гусениц металловидки серой в течение 14 дней эксперимента. Смертность насекомого на 7 день эксперимента составила 58,7% против 19,6% в контроле (χ²=13,2; N=92; Р<0,01). К 14 дню смертность в группе эксперимента увеличилась и составила 65,6% против 24% в контроле (χ²=8,1 N=92; Р<0,01). Таким образом, антисмысловой фрагмент домена RING антиапоптозного гена IAP вируса ядерного полиэдроза проявил достоверное инсектицидное действие на своего хозяина - гусениц металловидки серой.

По сравнению с прототипом заявленный способ борьбы с личинками металловидки серой отличается меньшей себестоимостью препарата на основе нуклеиновой кислоты за счет использования в качестве действующего вещества одного короткого (18 нуклеотидов длиной) антисмыслового фрагмента ДНК антиапоптозного гена бакуловируса целевого насекомого-вредителя.

Полученные результаты показывают возможность применения коротких антисмысловых фрагментов антиапоптозных генов бакуловирусов в практике сельского хозяйства с целью защиты растений.