Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D для активизации биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в воде, жидких шламах, сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и для трансформации углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма гриба - штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D для активизации биодеструкции твердых парафинов и полициклических ароматических соединений в воде, жидких шламах, сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и для трансформации углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля.

Известен штамм Pseudomonas putida 36, обладающий способностью к биодеградации нефти и нефтепродуктов [Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. 1990, №9. С. 148-151].

Известен штамм Bacillus species 739 [Авторское свидетельство СССР №1743019, 1989.] и полученный на его основе бактериальный препарат «Бациспецин» [Патент РФ №2077397, опубл. 1997], используемый для рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ очистки воды и почвы от нефти, нефтепродуктов и полимерных добавок в буровом растворе, включающий внесение микроорганизмов, отличающийся тем, что из микроорганизмов используют ассоциацию штаммов бактерий Rhodococcus erythropolis ВКМ Ac-1339D, Bacillus subtilis ВКМ B-1742D и Pseudomonas putida ВКМ 1301 [Патент РФ №2093478, опубл. 20.10.1997].

Известен консорциум микроорганизмов-деструкторов: Alcaligenes sp. Г0401ВТ №17, Micrococcus nishomyaensis Г0402ВТ №16, Brevibacterium iodinum Г0403ВТ №15, Pseudomonas aeruginosa Г0404ВТ №14, Pseudomonas facilis Г0405ВТ №13, Brevibacterium linens Г0406ВТ №12, Bacillus subtilis Г0407ВТ №11, Flavobacterium aquatile Г0408ВТ №10, Clostridium butyricum Г0409ВТ №9, используемый для очистки природных и сточных вод, почв и почвогрунтов от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности [Патент РФ №2376084, опубл. 20.12.2009].

Известен консорциум штаммов микроорганизмов Acinetobacter sp. ВКМ B-2753D и Ochrobactrum sp. ВКМ B-2754D, обладающий нитрогеназной активностью. Консорциум способен к фиксации атмосферного азота и обладает высокой утилизирующей способностью по отношению к нефти и нефтепродуктам при их высоком содержании в субстрате [Патент РФ №2553540, опубл. 20.06.2015].

Известен способ обработки нефтяного шлама [Патент РФ №2198747, опубл. 2000], заключающийся в том, что нефтяной шлам смешивают с микроорганизмами и биостимулятором. Для этого в нефтяной шлам добавляют чистую почву и древесные опилки в массовом соотношении 1:2:1, в качестве микроорганизмов используют штамм бактерий Bacillus sp. ВНИИСХМ 132, а в качестве биостимулятора - белковую кормовую добавку «Биотрин», после периода инкубации микроорганизмов (не менее 50 суток) проводится дополнительная обработка почвы биостимулятором.

Известен способ обезвреживания грунтов от нефтепродуктов [Патент РФ №2075447, опубл. 1997], в котором производится сбор зараженного грунта, разделение и переработка шлама культивированными биологическими штаммами аэробных и анаэробных микроорганизмов.

Основные заявленные способности штаммов и консорциумов микроорганизмов, в представленных патентах, это очистка почв, сточных вод, почвогрунтов, шламонакопителей от нефтепродуктов с утратой энергетического ресурса (без выхода вторичного сырья).

Наиболее близким к заявляемому по технической сущности относится микробиологический способ увеличения содержания светлых и масляных фракций в нефти, в нефтепродуктах и другом углеводородном сырье с одновременной изомеризацией бензиновой фракции [Патент РФ №2405825, 10.12.2010]. Предложенное изобретение позволяет улучшить качество получаемых нефтепродуктов за счет увеличения содержания светлых и масляных углеводородных фракций, снижения содержания темных фракций, мазута и кокса, что в свою очередь обеспечивает улучшение качества и эксплуатационных характеристик получаемых нефтяных фракций.

Таким образом, в данных патентах заявленных свойств у известных штаммов и консорциумов микроорганизмов - трансформация углеводородных ксенобиотиков в биомассу липидных метаболитов не обнаружено.

Задача изобретения - получение штамма Cadophora malorum (Kidd et Beaumont 1924) W. Gams 2000 ВКМ F-4708D, обеспечивающего активизацию биодеструкции твердых парафинов и полиароматических соединений в воде, жидких шламах, в сточной воде, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, и способного трансформировать углеводородные ксенобиотики в биомассу липидных метаболитов с целью получения биодизеля.

В этом состоит технический результат.

Для достижения технического результата из твердого нефтешлама были получены накопительные культуры почвенных грибов на синтетической среде следующего состава, г/л: KNO₃ - 4.0; КН₂РО₄ - 0.6; Na₂HPO₄×H₂O; MgSO₄×H₂O; вода дистиллированная; рН среды 7.0 [Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976. 307 c.]. В колбы на 250 мл вносили среду 100 мл указанного состава и инокулировали небольшим количеством нефтезагрязненной почвы. Накопительные культуры получали в инкубаторе при перемешивании 220 об/мин и при 24°С в течение 7 суток. Из накопительных культур была выделена чистая культура Cadophora malorum ВКМ F-4708D методом посева на агаризованную подкисленную среду Чапека [Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: МГУ, 1991. 304 с.]. Идентификацию гриба проводили по определителям [Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: Наука, 1967. 302 c.; Милько А.А. Определитель мукоральных грибов. Киев: Наукова думка, 1974. 303 c.; Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и Deuteromycetes). Киев: Наукова думка, 1977. 126 c.; Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Киев: Наукова думка, 1988. 203 с.; Александрова А.В., Великанов Л.Л., Сидорова И.И. Ключ для определения видов рода Trichoderma // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40. Вып. 6. С. 457-468; Domsh К.Н. / Domsh К.Н., Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi. IHW-Verlag, 1993. Vol. I. 859 p.; Domsh K.H. Gams W., Anderson T.-H. Compendium of soil fungi. IHW-Verlag Eching, 2007. 672 p.].

Характеристика выделенного гриба.

Cadophora malorum (Kidd et Beaumont 1924) W. Gams 2000 ВКМ F-4708D. На 7-е сутки на среде Чапека образует колонии 2-3 см в диаметре темно-оливкового цвета. Колонии стелющиеся, распростертые, бархатистые. Гифы изогнутые, бесцветные, стелющиеся, ветвящиеся, септированные. Конидиеносцы в виде боковых коротких веточек, большей частью стелющиеся, септированные. Конидии одиночные, верхушечные, эллиптические, муральные (с 2 или 3 поперечными и несколькими продольными перегородками), бородавчатые, бурые, при полном созревании непрозрачные, 17.5-22×11-13.5 мк.

Для накопления культуры использовали жидкую питательную среду Чапека. Исходное значение рН среды составляло 6.0 без дальнейшего регулирования в процессе культивирования. Колбы с 100 мл питательной среды засевали соответствующей культурой смывом стерильной дистиллированной водой с поверхности скошенной агаризованной среды. Засев опытной колбы для получения смешенной культуры производили с расчетом, чтобы количество конидий грибов разных видов было примерно одного порядка. Культивирование проводили при перемешивании 220 об/мин и постоянной температуре 24°С в течение 7 суток.

После 7 суток культивирования в жидкой питательной среде были отобраны пробы для определения общего количества конидий, которое подсчитывали с помощью камеры Горяева-Тома [Практикум по микробиологии / под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский дом «Академия», 2005. 608 с.] (табл. 1).

Режим хранения культуры - кратковременное хранение на скошенной агаризованной среде Чапека при 4°C (для подготовки биомассы с целевым использованием). Периодические пересевы.

Нефтеокисляющую способность штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D изучали в лабораторных экспериментах с модельной нефтезагрязненной средой. Способность штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D к разложению нефтепродуктов в липидные метаболиты изучали в лабораторных экспериментах с модельной нефтезагрязненной водной средой. Результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1.

Исследован штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D на изменение содержания алканов, ПАУ в условиях жидкофазного культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью.

В колбы на 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO₃ - 3.0 г; KH₂PO₄ - 1.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO₄×5H₂O - 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по весу и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в инкубаторе при 24°С и при 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание ПАУ, алканов в среде Чапека с добавлением нефти без биомассы штамма.

По истечении семи суток нефть извлекали из ферментационных колб экстракцией гексаном и анализировали алкановую, полиароматическую фракции углеводородов. Разделение экстрактов проводили методом колоночной хроматографии. На колонке с оксидом алюминия отделяли фракцию н-алканов и полициклических ароматических соединений (фракция F1) от полярных соединений. Далее на колонке с силикагелем фракцию F1 разделяли на фракции н-алканов (F2) и полициклических, ароматических соединений (F3).

Качественное и количественное определение содержания н-алканов проводили на хромато-масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo) в режиме селективной регистрации ионов (SIM) при энергии электронов 70 эВ. Сканирование в режиме SIM вели по трем ионам с массами 57, 71 и 85, характерным для предельных углеводородов [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Груздев И.В. Насыщенные углеводороды в фоновых и загрязненных почвах Предуралья // Почвоведение. 2010. №10. С. 1-7]. Идентификацию н-алканов на хроматограмме проводили предварительно в режиме полного ионного тока по их стандартным растворам. Методом внутреннего стандарта (внутренний стандарт - н-декан, 0.05 мг/см³) исследовали количественное содержание н-алканов.

В основу определения ПАУ в почве положена методика М 03-04-2002 - измерение массовой доли бенз[а]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора "Флюорат-02" в качестве флуориметрического детектора [Габов Д.Н., Безносиков В.А., Кондратенок Б.М., Яковлева Е.В. Закономерности формирования полициклических ароматических углеводородов в почвах Северной и Средней тайги // Почвоведение. 2008. №11. С. 1334-1343].

Краткое описание фигуры 1

Фигура 1 представляет собой график изменения структуры алкановой фракции нефти после семисуточной ферментации с культурой штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D.

Как видно на Фиг. 1, в присутствии культуры исследуемого штамма по сравнению с контролем происходит изменение структуры алкановой фракции, где очевидно снижение массовой доли парафинов С18 - С30. О разложении твердых парафинов также свидетельствует незначительное повышение массовой доли парафинов С15 - С17. Данные позволяют отнести данный штамм к алканотрофным видам.

Краткое описание Фигуры 2

Фигура 2 - это изменение количества вещества ПАУ в присутствии штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D по сравнению с контролем.

Внесение культуры испытуемого штамма после семидневной инкубации показало значительное снижение количества вещества трехядерных ПАУ - флуорена и фенантрена. Причем речь идет именно о разложении данных соединений, т.к. не происходило достоверных изменений в балансе соединений с четырьмя и более ядрами.

Пример 2.

Исследован штамм Cadophora malorum ВКМ F-4708D на изменение жирнокислотного состава в условиях культивирования на среде Чапека, обогащенной нефтью. В колбы на 250 мл готовили неагаризованную среду Чапека без сахарозы, следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO₃ - 3.0 г; KH₂PO₄ - 1.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO₄×5H₂O - 0.5 г, стерилизовали. Добавляли нефть по весу и 5 мл наработанного штамма. Культивировали в течение 7 суток в инкубаторе при 24 градусах и при 220 об/мин. В качестве контроля было определено содержание жирных кислот в накопленной биомассе штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на среде Чапека без добавления нефти, а также содержание жирных кислот в среде Чапека с добавлением нефти (табл. 2). Жирные кислоты выделяли по методу Синяка с соавторами [Авторское свидетельство №542932 СССР, G01N 1/28, 1977, Бюл. №2].

Жирнокислотный состава липидов штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D проведен с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (Smartline, Knauer, Германия) и газовой хроматографии (газовый хроматограф Кристалл 2000 М (Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Идентификацию липидов осуществляется методом хромато-масс-спектрометрии на приборе Finnigon Trase DSQ Thermo-Electron (США). Эти современные методы анализа дают качественное и количественное определение жирных кислот даже при низких концентрациях лимитирующих компонентов.

Получаемое биотопливо - биодизель состоит из смеси эфиров жирных кислот [Atadashi, I.M. High quality biodiesel and its diesel engine application: A review/ I.M. Atadashi, M.K. Aroua, A. Abdul Aziz // Renewable Sustainable Energy Rev. - 2010. - V. 14. - P. 1999-2008]. Оптимальную работу современных дизельных двигателей обеспечивают дизельные топлива с цетановым числом от 45 до 55. При цетановом числе меньше 40 резко возрастает задержка горения (время между началом впрыскивания и воспламенением топлива) и скорость нарастания давления в камере сгорания, увеличивается износ двигателя. Стандартное топливо характеризуется цетановым числом 48-51, а топливо высшего качества (премиальное) имеет цетановое число 51-55. Согласно российским стандартам цетановое число летнего и зимнего дизтоплива должно быть не менее 48 единиц [ГОСТ 305-82. Топливо дизельное. ГОСТ Р 52709]. Содержание пальмитиновой кислоты (С 16:0) указывает на объемную долю цетана. Из таблицы 3 видно, что при наработке биомассы штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на среде Чапека с добавлением нефти цетановое число относит топливо к премиальным. А при суммировании пальмитиновой и стеариновой кислот (94.1%) получаемый биодизель на основе наработки штамма Cadophora malorum ВКМ F-4708D на нефти можно охарактеризовать как биодизель высшего качества.