Результат интеллектуальной деятельности: Нефтеокисляющий биопрепарат, биосорбент на его основе и способ его приготовления

Изобретение относится к области биотехнологии и касается разработки состава нефтеокисляющего биопрепарата «БИОТРИН», биосорбента «ГЕОЛЕКС» для очистки грунтов, воды от нефти и нефтепродуктов и способа их приготовления.

Известен способ получения сухой формы биопрепарата с последующим хранением (Патент РФ № 2160992), заключающийся в культивировании микроорганизмов в подобранных условиях с последующим сублимационным высушиванием. Недостатком данного способа является то, что сублимационное высушивание требует значительных материальных затрат, а в процессе сушки из-за воздействия низких температур и вакуума может погибать значительная часть микроорганизмов.

Известен состав и способ получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти (варианты) (Патент РФ № 2404138). Способ получения жидкой формы биопрепарата включает в себя глубинное культивирование концентрата суспензии штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 на жидкой питательной среде. Способ получения сухой формы биопрепарата включает инокуляцию жидкой бактериальной суспензией субстрата-носителя (стерильного адсорбента вермикулитового вспученного) в герметичных пакетах. После чего на адсорбенте осуществляют дополнительное поверхностное культивирование штамма. Недостатком данного способа является высокая трудоемкость получения субстрата-носителя.

Известен состав и способ получения биопрепарата для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов (Патент РФ № 2636343). Способ включает смешивание и культивирование штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-3780, Acinetobacter radioresistens BКПM-В-2838, Acinetobacter radioresistens BКПM-B-5064 до достижения оптической плотности суспензии ОD= 0,6-0,8, концентрирование до 1-5Ч1011 кл./мл, лиофильную сушку при остаточном давлении 30-50 Па, температуре источника теплоты 40 °С до остаточной влажности 0,5-1 % и упаковку в герметичную тару в среде инертного газа. Недостатком данного способа приготовления биопрепарата является высокая трудоемкость и использование лиофильной сушки, которая может привести к снижению жизнеспособности клеток бактерий.

Известен состав и способ получения биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (Патент РФ № 2434059), выбранный за прототип. Способ предполагает культивирование бактерий рода Pseudomonas или Rhodococcus в

жидкой питательной среде и смешивании с защитной средой (0,05 М натрий-калиевого фосфатного буфера рН 6,8 при следующем соотношении компонентов: 4 % полиглюкина,

10 % сахарозы, 4 % тиомочевины, 2 % аскорбиновой кислоты с последующим титрованием 45 % раствором гидроксида натрия до рН 6,8-7,2). Полученную смесь добавляют к сорбенту – вспученному перлитовому песку. Затем проводят контактную сушку препарата при t = 37°C до постоянной массы. Недостатком способа является трудоемкость и высокая стоимость.

Известен биосорбент для очистки воды от углеводородных загрязнений и способ его получения (Патент РФ № 2656146). Способ включает предварительную сушку измельченного до фракций 1-1,5 мм торфа при 40-50°С до влажности не более 3%, пиролиз под вакуумом при температуре 210-250°С, затем его внесение в суспензию консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов штаммов Candida maltosa ВКПМ Y-3446 и Dietzia maris ВКПМ Ac-1824, взятых в соотношении 1:1. Изобретения обеспечивают увеличение сорбционной емкости биосорбента и повышение эффективности очистки водоемов от углеводородных загрязнений. Недостатком способа является трудоемкость.

Задачей заявленного изобретения является расширение арсенала нефтеокисляющих биопрепаратов, биосорбентов и способов их получения. Биопрепарат БИОТРИН обладает повышенной нефтеокисляющей активностью. Биосорбент на его основе обеспечивает сохранность и выживаемость клеток микроорганизмов в экологически неблагоприятных условиях. Способ позволяет реализовать приготовление биосорбента в условиях опытного производства, с последующим использованием биопрепарата или биосорбента для очистки загрязненных нефтепродуктами воды и почвы. В этом состоит технический результат.

Технический результат биопрепарата достигается тем, что нефтеокисляющий биопрепарат, содержащий культивированные штаммы микроорганизмов, согласно изобретения, содержит смесь биомасс штаммов бактерии Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D с титром клеток 10¹² КОЕ/мл и дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл, взятых при соотношении:

- штамм бактерий Pseudomonas yamanorum B-3033D - 0,1-99,9%

- штамм дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D - 0,1-99,9%,

при этом биопрепарат дополнительно содержит биомассу штамма микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS-2024 с соотношением:

- смесь биомасс штаммов бактерий и дрожжей - 50 -70%

- биомасса штамма микроводорослей - 30-50%.

Технический результат биосорбента для очистки воды и грунта от нефтяных загрязнений, достигается тем, что содержит культивированные штаммы микроорганизмов иммобилизованные на носитель, согласно изобретения, в качестве штаммов

микроорганизмов используют вышеуказанные нефтеокисляющие биопрепараты, а именно смесь биомасс штаммов бактерии Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D с титром клеток 10¹² КОЕ/мл, дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл и микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS-2024 с титром клеток 108 кл./мл, при этом в качестве носителя используют минеральный ионит «Ionsorb™».

Технический результат способа приготовления биосорбента достигается тем, что берут инокуляты бактерий Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D и дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, в отдельных емкостях готовят питательные среды для культивирования микроорганизмов, затем питательные растворы стерилизуют, подают в ферментеры, засевают инокулятами и культивируют бактерии Pseudomonas yamanorum VKM B-3033D до титра клеток 10¹² КОЕ/мл и дрожжи Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D до титра клеток 10⁹ КОЕ/мл, после чего культивированные бактерии и дрожжи из ферментеров поступают в камеру смешивания, дополнительно готовят питательную среду для культивирования микроводорослей, питательный раствор подают в хемостат, засевают инокулятом и культивируют микроводоросли Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS-2024 108 кл./мл, культуральная жидкость микроводорослей смешивается с культуральной жидкостью бактерий и дрожжей в камере смешивания, полученная смесь бактерий, дрожжей и микроводорослей из камеры смешивания наносится путем разбрызгивания на носитель в виде минерального ионита «Ionsorb™» с насыпной плотностью не больше 1 см, биосорбент высушивают в термостате при температуре не выше 30°С, после окончания сушки осуществляют фасовку биосорбента в упаковочную тару.

В частном случае, часть культуральной жидкости остается в ферментерах и хемостате для последующего цикла культивирования, при этом в ферментеры и хемостат вносится новая порция простерилизованных питательных растворов.

Ниже описаны штаммы микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата «БИОТРИН».

Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum выделен с грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкаре Республики Коми, способен активизировать деструкцию нефти и нефтепродуктов в воде, в дерново-подзолистой почве, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.

Штамм характеризуется следующими признаками:

I. Культурально-морфологические:

На среде МПА колонии точечные Ø < 1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.

II. Физиолого-биохимические:

Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.

III. Данные молекулярно генетического анализа:

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на на 1000 мл воды – Пептон – 20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO₄×7H₂O – 0,5 г; агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 ⁰С.

Штамм Rhodotorula glutinis выделен в 2014 году из нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма.

Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный.

Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 Ч 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют.

Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno.

Сахара не сбраживает.

Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат.

Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо).

Крахмалоподобные вещества не образует.

При +37°С не растет.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO₃ – 3,0 г; KH₂PO₄ – 1,0 г; KCl – 0,5 г; MgSO₄×7H₂O - 0,5 г; агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 ⁰С.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris f. globosa выделен в 2010 г. из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Штамму присвоен номер IPPAS-2024.

Морфологическая характеристика штамма:

Форма клеток – шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Режим хранения штамма – для подготовки биомассы с целевым использованием – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда следующего состава (табл. 1):

Таблица 1. Состав среды Болда

В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора – 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 єС.

Носитель - минеральный ионит «Ionsorb™» - глауконитовый песчаник Бондарского месторождения Тамбовской области. Предназначен для иммобилизации клеток штаммов после их смешивания в симбиотический комплекс. «Ionsorb™» выступает в качестве базы-транспорта для бактерий. При получении биосорбентов на основе «Ionsorb™» повышается эффективность закрепления (удержания) клеток микроорганизмов, сохранения их жизнеспособности и жизнеспособности внеклеточных ферментов, путем замены лиофильной сушки на иммобилизацию микроорганизмов на сорбент. В экологически неблагоприятных условиях «Ionsorb™» позволяет жить микроорганизмам в анабиозе до 10 лет.

Приготовление посевного материала (инокулята) осуществляется следующим образом.

Из пробирок с косяками штаммов Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS-2024 делают бактериологической петлей пересев в конические колбы с жидкими питательными средами Чапека, МПА и Тамия, соответственно.

Штамм Rhodotorula glutinis готовят на стерильной питательной среде Чапека: вода сахароза, NaNO₃; KH₂PO₄; KCl ; MgSO₄×7H₂O г;

Штамм Pseudomonas yamanorum готовят на стерильной питательной среде МПА: вода, пептон, NaCl; KCl; MgSO₄×7H₂O

Штамм Chlorella vulgaris f. globosa готовят на стерильной питательной среде Тамия: вода, КNO₃, KH₂PO₄ Х3H₂O, MgSO₄×7H₂O, FeSO_4.

Колбы ставят на шейкер для наработки инокулята при 180 об/мин, комнатной температуре, естественном освещении. После наработки инокулята, спустя 3-7 суток содержимое колб стерильно перемещают в ферментер с предварительно подготовленной и простерилизованной в автоклаве средой.

Далее инокулят в количестве от 100 мл оставляют в ферментере для приготовления следующей партии препарата.

Ниже описан состав питательных сред для приготовления биомассы культур Pseudomonas yamanorum, Rhodotorula glutinis, Chlorella vulgaris f. globosa.

Питательная среда для культивирования штамма Pseudomonas yamanorum следующего состава: вода, гидролизат куриного белка (HCP Premium), NaCl; KCl; MgSO₄×7H₂O г.

Питательная среда для культивирования штамма Rhodotorula glutinis следующего состава (М9): вода, дизельное топливо марки «Л», Na₂HPO₄; KH₂PO₄; NaCl; NH₄Cl .

Питательная среда Люка (Патент РФ № 2556126) для культивирования штамма Chlorella vulgaris f. globosa: водопроводная вода, минеральный ионит «Ionsorb™», стабилизированный гашенной известью и минеральным ионитом «Ionsorb™» куриный помет при следующем соотношении компонентов:

На рис. 1 приведена технологическая линия для получения биопрепарата.

Технологическая линия включает: 1 – емкость с инокулятом бактерий Pseudomonas yamanorum 2 – емкость с инокулятом дрожжей Rhodotorula glutinis, 3 – емкость с инокулятом микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa, 4 – автоклав, 5 – емкость с питательной средой для приготовления бактерий, 6 – емкость с питательной средой для приготовления дрожжей, 7 – емкость с питательной средой для приготовления микроводорослей, 8 – ферментер для культивирования биомассы бактерий, 9 – ферментер для культивирования биомассы дрожжей, 10 – хемостат для приготовления биомассы микроводорослей, 11 – камера смешения, 12 – трубы-разбрызгиватели, 13 – транспортерная лента, 14 – термостат, 15 – емкость с пеногасителем, 16 – баллон с CO₂.

Приготовление биопрепарата «БИОТРИН» осуществляется следующим образом.

Питательную среду для культивирования бактерий Pseudomonas yamanorum, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости (5) в автоклаве (4) при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2 в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27 °С и подают в ферментер объемом на 5 литров (8). Добавляют заранее приготовленный или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят штамма Pseudomonas yamanorum по 100 мл из емкости (1). Параметры культивирования: температура 25-30 ºС, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм³ воздуха на 1 дм³ культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10¹² КОЕ/мл.

Питательную среду для культивирования дрожжей Rhodotorula glutinis, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости (6) в автоклаве (4) при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в ферментер объемом на 5 литров (9). Добавляют заранее приготовленный или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят культуры Rhodotorula glutinis, по 100 мл из емкости (2). Параметры культивирования: температура 25-30 ºС, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм³ воздуха на 1 дм³ культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10⁹ КОЕ/мл.

При интенсивном пенообразовании в качестве пеногасителя используют стерилизованное подсолнечное масло. Пеногаситель вносят из емкости (15) в ферментеры.

Питательную среду для культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa объемом 4.5 л стерилизуют в емкости (7) в автоклаве (4) при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27 °С и подают в стеклянный хемостат объемом на 5 литров (10). Добавляют заранее приготовленный или оставленный после предыдущего культивирования инокулят культуры Chlorella vulgaris f. globosa по 100 мл из емкости (3). Параметры культивирования: за хемостатом располагают 6 люминесцентных ламп мощностью 20 Ватт каждая. Аэрирование с помощью аквариумного насоса, подача углекислого газа 1 г/ литр /час из баллона (16) в течение трех суток. Температура 25-27 ºС. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10⁸ кл./мл.

Смешивание биомассы бактерий, дрожжей и в частном случае, микроводорослей происходит путем сливания через нижнюю часть ферментеров (8, 9) биомассы дрожжей Rhodotorula glutinis, бактерий Pseudomonas yamanorum и нижнюю часть хемостата (10) биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa. Часть культуральной жидкости остается для последующего цикла культивирования при этом в ферментеры и хемостат вносится новая порция простерилизованных питательных сред.

Пример 1. Проводилось изучение свойств биопрепарата в зависимости от соотношения культур микроорганизмов. В таблице 2 приведены соотношение культур и свойства биопрепарата

Таблица 2. Свойства биопрепарата «БИОТРИН» в зависимости от соотношения

Пример 2. В частном случае проводилось изучение свойств биопрепарата в зависимости от соотношения культур бактерий, дрожжей и микроводорослей. В таблице 3 приведены соотношение культур и свойства биопрепарата

Таблица 3. Свойства биопрепарата «БИОТРИН» в зависимости от соотношения

Приготовление биосорбента «ГЕОЛЕКС» на основе биопрепарата «БИОТРИН» осуществляется следующим образом:

Полученные культуральные жидкости микроорганизмов поступают в камеру смешения (11) и далее по трубам (12) происходит разбрызгивание биопрепарата «БИОТРИН» на носитель – минеральный ионит «Ionsorb™», который подается транспортерной лентой (13) насыпной плотностью не толще 1 см.

Высушивание происходит в термостате (14) при температуре не выше 30°С. Фасовка биосорбента ручная в упаковочную тару.

Упаковка:

Биосорбент фасуют от 1 до 15 кг в полиэтиленовый двойные пакеты, которые герметично запаяны со всех сторон.

Маркировка:

Каждую единицу упаковки снабжают этикеткой, характеризующей продукцию:

- наименование организации, в систему которой входит предприятие-изготовитель;

- наименование предприятия-изготовителя;

- масса нетто;

- дата изготовления;

- номер партии;

- гарантийный срок хранения;

- условия хранения;

- количество единиц фасовки;

- обозначение ТУ.

К каждой партии прилагается инструкция по применению биосорбента.

Транспортирование биосорбента должно производиться в соответствии с ГОСТ 59.04.070.24-83. Биосорбент транспортируется всеми видами транспорта с предохранением его от температур выше + 40 ºС и ниже - 25 ºС.

Хранение должно производится с ГОСТом 59.04.070.24-83 при температуре от +4 до +25 ºС.

Гарантийный срок хранения препарата 2-3 года со дня изготовления.

Пример 3. Проводилось изучение свойств биосорбента в зависимости от его состава. В таблице 4 приведены свойства биосорбента.

Таблица 4. Свойства биосорбента «ГЕОЛЕКС» в зависимости от состава

Стадии производственного процесса описаны ниже.

Стадия 1.

1.1. Получение посевного материала (инокулята) бактерий, Pseudomonas yamanorum VKM В-3033D, дрожжей Rhodotorula glutinis VKM Y-2998D, микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS-2024: в лаборатории (пробирка-колба), в цехе чистой культуры.

1.2. Подготовка питательных сред.

1.3. Стерилизация питательных сред в автоклаве.

1.4.Засев питательных сред инокулятом.

Стадия 2.

2.1. Культивирование (ферментация) биомассы бактерий, дрожжей, микроводорослей.

Стадия 3.

3.1. Смешивание культуральной жидкости бактерий, дрожжей и микроводорослей в камере смешения.

3.2. Разбрызгивание биопрепарата «БИОТРИН» на носитель – минеральный ионит «Ionsorb™», подаваемый на транспортерной ленте.

Стадия 4.

4.1. Высушивание биосорбента на носителе в термостате.

Стадия 5.

5.1. Расфасовка биосорбента.

К вспомогательным технологическим стадиям относятся:

- очистка и стерилизация воздуха;

- подготовка посуды и оборудования;

- подготовка баллона к подаче и подача CO₂;

- подача пеногасителя;

- этикетировка и упаковка готовой продукции.

Таким образом, предлагаемый нами биопрепарат «БИОТРИН» и на его основе биосорбент «ГЕОЛЕКС» получен на опытном производстве, опробован и показал высокую эффективность.