Микробиологический способ получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17 α,21-диацетата кортексолона

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения 11β-гидроксистероида - 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленностях.

Физиологическая активность гидроксилированных по 11-му положению 3-кетостероидов широко используется в терапии многих заболеваний. Наличие гидроксильной группы в позиции 11β определяет противовоспалительные, антиаллергические и иммунодепрессивные свойства стероидов прегнанового ряда. [1-3]. Способность катализировать реакцию 11β-гидроксилирования в отношении кортексолона и его производных показана преимущественно для штаммов мицелиальных грибов рода Absidia, Cunninghamella и Curvularia [4-9]. Дейтеромицет Curvularia lunata и его телеоморф Cochliobolus lunatus отличаются высокой эффективностью в осуществлении введения гидроксильной группы в положение 11β прегнанов, в том числе при получении гидрокортизона из кортексолона и его производных [1, 8, 10-17]. К настоящему времени известны подходы, направленные на увеличение выхода 11β-гидроксилированных продуктов при трансформации кортексолона культурой Curvularia lunata [14-17, 18]. Малоизученными остаются процессы трансформации ацетилированных на стадии химического синтеза производных кортексолона, которые все чаще выступают в качестве субстратов для микробиологической конверсии.

Основной проблемой промышленного получения гидрокортизона и ацетата гидрокортизона путем микробиологической конверсии кортексолона и его ацетилированных производных является малая эффективность процессов, обусловленная наличием побочных 14α- или 11α-гидроксилированных производных, а также необходимостью использовать низкие нагрузки субстрата для достижения более полного его превращения в целевой продукт.

Целью заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона с использованием штамма Curvularia lunata ВКМ F-645, обладающего 11β-гидроксилазной активностью в отношении 3-кетостероидов прегнанового ряда.

Штамм Curvularia lunata ВКМ F-645 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ РАН, г. Пущино).

В литературе описан способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона культурой Curvularia lunata CL-114 [8]. Оптимизированные условия проведения трансформации включают в себя использование субстрата в комплексе с β-циклодекстрином (молярное соотношение β-циклодекстрин:субстрат, 1:1), 1.2% ТВИН80 при 20-минутной стерилизации. Субстрат вносят на стадию конверсии в 80% этаноле с соотношением 1:18 (об./об.) к 24 часовой культуре гриба (конечная концентрация субстрата 1 г/л) и проводят трансформацию в течение 48 часов в ростовых условиях. Выход гидрокортизона при этом достигает 55%.

Недостатком рассматриваемого способа получения является невысокая производительность, обусловленная низким выходом 11β-гидроксилированного продукта и низкой концентрацией субстрата. Масштабирование этого способа осложнено, что исключает его практическую реализацию.

Известен способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона с помощью культуры Curvularia lunata CL-114 [11], который основывается на двухстадийном добавлении субстрата на стадии трансформации: сначала к 16-часовой культуре добавляют 0.3 г/л субстрата, затем через 8 часов добавляют оставшиеся 0.7 г/л субстрата. Выход гидрокортизона достигает 0.6 г/л за 72 часа трансформации. Среди недостатков данного способа получения гидрокортизона следует отметить длительность процесса трансформации - до 72 ч и невысокую производительность, обусловленную низкой концентрацией субстрата - 1 г/л.

Известен способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона с помощью клеток мицелия Absidia orchidis, включенных в кальций-альгинатный гель. Выход гидрокортизона достигает 59-61% при концентрации субстртата 1 г/л [6]. Побочным продуктом данного процесса является эпигидрокортизон (11α-изомер гидроокортизона). Способ позволяет многократно использовать иммобилизованные клетки (до шести раз) без значительного снижения их гидроксилирующей активности.

Основной недостаток данного способа получения гидрокортизона заключается в малой производительности, обусловленной низкой концентрацией субстрата и высоким содержанием побочного продукта эпигидрокортизона (до 40%) в среде трансформации, что может являться одной из главных причин значительных потерь целевого продукта на стадии выделения и химической очистки.

В литературе описан способ получения гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона мутантным штаммом Curvularia lunata. Субстрат (концентрация 1 г/л) вносят на стадию конверсии в 80% этаноле с соотношением 1:18 (об./об.) к 24 часовой культуре гриба и проводят трансформацию в течение 48 часов в ростовых условиях. Выход гидрокортизона при этом составляет 83,67% [12].

Недостатком данного способа получения гидрокортизона является его малая производительность, обусловленная низкой концентрацией субстрата.

Наиболее близким по достигаемому эффекту является способ получения ацетата гидрокортизона из 21-ацетата кортексолона культурой Cunninghamella blakesleeana АТСС 8688а [19]. Трансформацию субстрата проводят 72 часовой культурой в ростовых условиях в присутствии ТВИН80, жидкого парафина или минерального масла в концентрации 1% (об./об.). Различные концентрации субстрата (0,15, 0,5, 1,0 г/л) на стадию трансформации вносят в 95% этаноле. Максимальный выход 21-ацетата гидрокортизона составляет 85,6% при концентрации субстрата 0,15 г/л.

Главным недостатком способа получения является малая производительность, обусловленная низкой концентрацией субстрата. При концентрации субстрата выше 0,15 г/л выход продукта в описанном способе резко снижается: при концентрации субстрата 0,5 г/л выход ацетата гидрокортизона не превышает 40%, а при концентрации субстрата 1,0 г/л выход продукта достигает лишь 30%.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании эффективного микробиологического способа получения 17α-ацетата гидрокортизона из 17α,21-диацетата кортексолона, обеспечивающего селективность реакции 11β-гидроксилирования, высокий выход продукта и возможность использования повышенных нагрузок стероидного субстрата.

Технический результат достигается за счет использования штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 и подбора оптимальных условий культивирования мицелия и трансформации 17α,21-диацетата кортексолона.

Анализ продуктов трансформации в динамике процесса проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого пробы культуральной жидкости заливают 2-4-кратным объемом этилацетата и проводят экстракцию стероидных соединений при интенсивном перемешивании в течение 3 мин. Анализ соединений проводят на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ (Россия) в системе бензол : ацетон 3:1 (об./об.). Просмотр хроматограмм в УФ-свете проводят на хемископе CN-15MC (Vilber Lourmat, Франция) при 254 нм.

Определение содержания продуктов на момент завершения процесса трансформации осуществляют методом ВЭЖХ. Анализ проводят на колонке Symmetry С18 250×4.6 мм (Waters), с предколонкой ODS-100, 10×4.6 мм (Serva); в следующих условиях: элюент - ацетонитрил : Н₂O : уксусная кислота в соотношении 52:48:0,01 (об./об.), скорость протока - 1 мл/мин; объем петли - 20 мкл; температура колонки - 50°C; детекция при λ=240 нм; расчет концентраций производился с использованием значений площадей пиков.

Полученный предлагаемым способом 17α-ацетат гидрокортизона может быть выделен любым из известных методов, предусматривающих экстракцию продуктов органическим растворителем, отгонку растворителя и последующую кристаллизацию конечного продукта.

Способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Мицелий культуры грибного штамма Curvularia lunata ВКМ F-645 первой генерации получают путем засева суспензии спор с одного агаризованного косяка 7 суточной культуры в 50 мл среды №1 следующего состава (г/л дистиллированной воды): крахмал - 40; соевая мука 15; pH 6.0 в колбе Эрленмейера (750 мл) и инкубированием на роторной качалке при 220 об/мин и 29°C в течение 72 ч. Посевной материал (10% об./об.) переносят в 90 мл среды №2 следующего состава (г/л дистиллированной воды): KH₂РО₄ - 16; K₂HPO₄ - 2; сахароза - 20; дрожжевой экстракт - 15; NaNO₃ - 2; (NH₄)₂HPO₄ - 3; MgSO₄ - 0.5; FeSO₄ - 0.01, pH 6.0 и продолжают культивирование в аналогичных условиях в течение 24 ч. Выросший мицелий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 об/мин 40 мин и промывают дважды 0.05М калий-фосфатным буфером. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона (4 г/л) проводят в колбах Эрленмейера объемом 750 мл отмытым суточным мицелием второй генерации, который берут в количестве 30-35 г/л (в пересчете на вес сухой биомассы) в 50 мл 0.05 М калий-фосфатного буфера (pH 6.0) с добавлением 1% (об./об.) масляного раствора ретинола ацетата. Стероидный субстрат (4 г/л) вносят в трансформационный буфер в виде суспензии с использованием 1 мл дистиллированной воды с ТВИН 80 (0.1% об./об.) и продолжают инкубирование на роторной качалке при 220 об/мин. в течение 32 часов. По данным ВЭЖХ анализа культуральной жидкости мольный выход 17α-ацетата гидрокортизона составляет 78% или 2.88 г/л.

Пример 2. Способ осуществляется по примеру 1, но 17α,21-диацетат кортексолон (4 г/л) вносят в трансформационный буфер в виде горячего раствора диметилформамида (ДМФ) (конечная концентрация растворителя 1.5% об./об.). Мольный выход 17α-ацетата гидрокортизона за 24 ч трансформации составляет 86% или 3.16 г/л.

Пример 3. Способ осуществляется по примеру 2, но с добавлением в трансформационный буфер 0.5% (об./об.) ПЭГ 400. Мольный выход 17а-ацетата гидрокортизона за 18 ч трансформации составляет 95% или 3.49 г/л.

Пример 4. Способ осуществляется по примеру 3, но трансформацию проводят в биореакторе АНКУМ 2М объемом 10 л (рабочий объем 5 л). Для этого посевной материал 72 ч мицелия первой генерации (10% об./об.) переносят в биореактор, содержащий 4.5 л свежей среды №2 и продолжают культивирование при 700-800 об/мин, аэрации - 0.3-1 л/мин, pO₂-15-20% при 29°C в течение 24 ч. Выросший мицелий отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 4000 об/мин 40 мин и промывают дважды 0.05 М калий-фосфатным буфером. Трансформацию 17α,21-диацетата кортексолона (4 г/л) проводят отмытым суточным мицелием второй генерации, который берут в количестве 30-35 г/л (в пересчете на вес сухой биомассы) в 5 л 0.05 М калий-фосфатного буфера (pH 6.0 контролируют в течение всего времени трансформации титрованием 10% раствором NaOH) при 900 об/мин, аэрации 0.3-1.5 л/мин, рО₂-40-45% при 29°C. Мольный выход 17а-ацетата гидрокортизона за 14 ч трансформации составляет 90% или 3.3 г/л.

Источники информации

1. Kelly S.L., Lamb D.C., Jackson C.J., Warrilow A.G., Kelly D.E. / Adv. Microb. Physiol. V. 47. P. 131-186. 2003.

2. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H.M. / Enzyme Microb. Technol. V. 32. №6. P.688-705. 2003.

3. Андрюшина В.А., Войшвилло H.E., Дружинина А.В. и др. / Патент РФ 2399674.

4. Sedlaczek L. / Crit. Rev. Biotechnol. V. 7. N. 3. P. 187-236. 1988.

5. Ангелова Б.А., Суходольская Г.В., Кощеенко К.А. / Микробиология. Т. 54. С. 704-709. 1985.

6. Wang J., Chen С., Li В., Zhang J., Yu Y. / Enz. Microbiol. Technol. V. 22. P. 368-373. 1998.

7. Ohlson S., Flygare S., Larsson P.O., Mosbach K. / Eur. J. Microbiol. Biotechnol. V. 10. P. 1-9. 1980.

8. Lu W., Du L., Wang M., Guo Y., Sun В., Wen J., Jia X. / Food and Bioprod. Proc. V. 85. P. 63-72. 2007.

9. VitasM., Rozman D., Komel R., Kelly S.L. // J. Biotechnol. V. 42. P. 145-150. 1995.

10. Ядерец В.В., Андрюшина В.А, Бартошевич Ю.А., Домрачева А.Г., Норвак М.И., Стыценко Т.С., Войшвилло Н.Е. / Прикладная биохим. микробиол. Т. 43. С. 695-700. 2007.

11. Lu W., Du L., Wang M, Wen J., Sun В., Guo Y. / Biochem. Eng. J. V. 32. P. 233-238. 2006.

12. Lu W., Du L., Wang M., Jia X., Wen J., Huang Y., Guo Y., Gong W., Bao H., Yang J., Sun B. / Appl. Biochem. Biotechnol. V. 142 P. 7-13. 2007.

13. Paraszkiewicz K., Dlugonski J. / Journal of Biotechnology. V. 65. P. 217-224. 1998.

14. Wang M., Lu FP., Wang FQ., Jiang Y., Du LX. / Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. V. 17. P. 710-712. 2001.

15. Суходольская Г.В., Ангелова Б., Кощеенко К.А., Басовская И.М., Скрябин Г.К. Патент РФ 1411336.

16. Wilmanska D, Milczarek К, Rumijowska A, Bartnicka К, Sedlaczek L. / Appl Microbiol Biotechnol. V. 37. P. 626-30. 1992.

17. Rozman D, Komel R. / Curr Genet. V. 22. P. 123-7. 1992.

18. Zhang В., Zhu H., Liu X. / Biotechnol. Prog. V. 20. P. 1885-1887. 2004.

19. Manosroi J., Saowakhon S., Manosroi A. / Enz. Microbiol Technol. V. 41. P. 322-325. 2007.