Результат интеллектуальной деятельности: Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления вируса крапчатости винограда (Grapevine fleck virus)

Изобретение «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления вируса крапчатости винограда (Grapevine fleck virus)» относится к области защиты растений, фитопатологии и агробиотехнологии и может быть применено для молекулярной диагностики вирусных заболеваний винограда, а именно для молекулярной диагностики биоматериала винограда на наличие в нем вируса крапчатости винограда (Grapevine fleck virus, GFkV). GFkV - флоэмно-ограниченный РНК-вирус, широко распространенный во всех районах выращивания винограда. Переносчик неизвестен, вирус распространяется через прививки. Наиболее ярко симптомы заболевания проявляются на чувствительном индикаторе Vitis rupestris: пожелтение жилок молодых листьев, деформация и закручивание вверх старых листьев [1]. При смешанной инфекции винограда GFkV с другими вирусами замедляется рост подвоев (на 51% - у сорта 420А и на 37% - у сорта Кобер 5ББ), что приводит к снижению качества посадочного материала [2]. Симптомы хорошо заметны весной при умеренных температурах и исчезают в жаркую погоду. Наиболее часто инфекция вирусом крапчатости различных видов и гибридов Vitis проходит бессимптомно, что является дополнительным фактором распространения вируса на чувствительные сорта, т.к. бессимптомные растения могут являться резервуарами GFkV. В связи с этим особую значимость приобретает точная диагностика GFkV в посадочном материале с использованием лабораторных методов, позволяющих определять даже очень низкий титр вируса в растении. Среди методов идентификации фитовирусов известны методы визуальной диагностики симптомов, серологические методы и методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции.

Визуальные методы основаны на определении наличия вируса по характерным симптомам на растении-хозяине или на индикаторных растениях, что требует наличия определенного опыта у исследователя и знаний симптомов заболевания. Различные вирусы могут вызывать одинаковые симптомы на растениях винограда. Кроме того, симптомы вирусных заболеваний могут иметь сходство с физиологическими изменениями, связанными с условиями окружающей среды. Симптоматика зависит от агрессивности штамма вируса и от сорта растения-хозяина. При бессимптомном характере заболевания идентификация затруднена. Известен способ тестирования растений на вирусы (Патент РФ № 2147173), основанный на заражении растения-индикатора.

Серологический метод, основанный на применении антисывороток к детектируемому вирусу, широко используется для диагностики различных вирусов, в том числе поражающих виноград.

Известен способ детекции вируса скручивания листьев винограда 8 (Grapevine leafroll-associated virus-8, GLRaV-8) с помощью антител к белку оболочки (патент США 5965355 А).

Известен способ диагностики Вируса В хризантемы (Chrysanthemum virus В, CVB) с использованием антител к белку оболочки этого вируса (Патент США 7803526 В2).

Известен способ проведения иммунохроматографического анализа вирусов (патент РФ 2083986), основанный на количественном определении растительных вирусов, которое предусматривает нанесение на полимерную мембрану образца, содержащего определяемый вирус, и меченых антител, проведение иммунохимической реакции и отделение иммунохимического комплекса одновременно в процессе хроматографической миграции на поверхности мембраны.

Серологические методы являются менее чувствительными по сравнению с молекулярными [3].

Методы молекулярной диагностики фитовирусов, основанные на определении наличия в растительном образце нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в ее классическом варианте и различных модификациях, являются наиболее чувствительными. С их помощью можно выявить последовательности нуклеиновых кислот, характерные для определенного вида возбудителя заболевания в симптоматичном и бессимптомном биологическом материале даже при очень низком титре патогена. Высокая чувствительность и специфичность ПЦР достигается за счет многократного копирования маркерного для данного вида вируса фрагмента. Точная диагностика исследуемого вируса основана на специфичности выбранных синтетических олигонуклеотидов - праймеров, которые комплементарны последовательностям ДНК на 5'- и 3'-концах маркерного фрагмента и располагаются на последовательности ДНК таким образом, что достраивание цепи ДНК при многократном ее копировании проходит только между этими праймерами.

Известен способ обнаружения вируса скручивания листьев винограда 1 (Grapevine leafroll-associated virus-1, GLRaV-1) методом обратная транскрипция - ПЦР (Патент Украины UA 19847 U).

Известен способ обнаружения вироида желтой мозаики винограда (Grapevine yellow speckle viroid-1, GYSVd-1) с помощью ПЦР в реальном времени (Патент Китая CN 103225002 А).

Известен способ обнаружения грамотрицательной бактерии Pseudomonas syringae pv. lachrymans методом ПЦР (Патент РФ 2378383).

Известен способ обнаружения грамотрицательной бактерии Xanthomonas campestris pv. vesicaroria методом ПЦР (Патент РФ 2378382).

Известен способ диагностики биоматериалов на наличие в них агробактерий с помощью ПЦР в режиме реального времени (Патент РФ №2458142).

Известен способ диагностики вируса некротической кольцевой пятнистости сливы (Prunus necrotic ringspot virus, PNRSV) методом ПЦР (Патент США 20070026390 А1).

В базе данных нуклеотидных последовательностей Национального центра биотехнологической информации США имеются полные геномы GFkV (NC 003347.1 и AJ 309022.1).

В результате анализа данных и патентных источников не обнаружено изобретений для детекции GFkV, при этом существует необходимость в диагностике GFkV с целью его мониторинга на виноградниках.

Предлагаемое изобретение - набор синтетических олигонуклеотидов, позволяющих определять наличие вируса крапчатости винограда (Grapevine fleck virus, GFkV) у представителей вида Vitis vinifera. Может применяться для нужд сельского хозяйства, например для тестирования посадочного материала на наличие GFkV при закладке новых виноградников, при проведении фитосанитарных обследований и лабораторной диагностике образцов симптоматичных и бессимптомных растений винограда.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение GFkV в анализируемых образцах. Результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидных праймеров: GFkV F , GFkVR .

Описание Фигуры. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР с использованием набора синтетических олигонуклеотидов GFkV F и GFkV R, специфичных к вирусу крапчатости винограда: 1 - маркер молекулярной массы (100 bp DNA Ladder Mix, Евроген); 2 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК, выделенной из листа винограда с симптомами GFkV; 3 - ОТ-ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы; 4 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК, выделенной из листа здорового растения без симптомов GFkV; 5 - ОТ-ПЦР с суммарной РНК, выделенной из бессимптомного листа, инфицированного GFkV.

Методика использования изобретения

Для обнаружения GFkV в биологическом материале с помощью предлагаемого изобретения требуется:

1. Выделить РНК из анализируемого образца по следующей методике [4]. Гомогенизировать образец листового материала в 350 мкл буфера для выделения (0,2 М CH₃COOHNa, 4 M гуанидин тиоцинат, 25 мМ ЭДТА, 2,5% PVP 40, 1% 2-меркаптоэтанол), 52 мкл 10% лаурил-саркозил натрия (NLS), 2,5 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубировать 10 мин при 70°C. Затем поместить в лед, после чего центрифугировать 10 мин при 13000 об/мин. Надосадочную жидкость перенести в новую пробирку, содержащую 150 мкл 96% этанола, 300 мкл NaI (4,8 М NaI, 6М Na₂SO₃) и 25 мкл SiO₂. Далее перемешать и инкубировать при комнатной температуре 10 мин, после чего центрифугировать 1 мин при 6000 об/мин и удалить супернатант. Затем осадок промыть в 500 мкл буфера (10 мМ Tris-HCl рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 50% этанол). Центрифугировать в течение 1 мин при 6000 об/мин, надосадочную жидкость слить и повторить промывку. Полученный осадок высушить, ресуспендировать в воде, инкубировать 5 мин при 70°C, центрифугировать в течение 3 мин при 13000 об/мин, затем отобрать надосадочную жидкость в новую пробирку.

2. Оценка качества выделения РНК проводится с помощью электрофореза посредством электрофоретического анализа в агарозном геле, содержащем бромистый этидий в 1х ТВЕ буфере. Разделение фрагментов в геле осуществляется в течение 30-40 минут при 120V. Визуализацию осуществляют путем окрашивания гелей бромистым этидием с последующим фотодокументированием.

3. Синтезировать кДНК по протоколу производителя Thermo Scientific. Приготовить 2 реакционные смеси. Первая смесь должна содержать 2 мкл праймера (Random Hexamer), стерильную воду (MQ) - 9,5 мкл и РНК одного образца в количестве 2 мкл. Вторая реакционная смесь включает в себя: 4 мкл буфера для полимеразы, 2 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов (10 мМ) и 0,5 мкл обратной транскриптазы. Первую смесь центрифугировать и инкубировать при температуре 70°C в течение 10 мин, после чего перенести в лед и добавить компоненты второй смеси. Инкубировать 25°C - 10 мин, 42°C - 60 мин, 70°C - 10 мин.

4. Приготовить реакционную смесь для ПЦР по протоколу производителя Thermo Scientific. Состав реакционной смеси: 5х буфер для Taq полимеразы; 2,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ дезоксирибонуклеотиды; синтетические олигонуклеотидные праймеры: 1 пмоль/мкл GFkV F , 1 пмоль/мкл GFkV_R ; 0,375 ед. Taq полимеразы, 2 мкл ДНК-матрицы, MQ до общего объема реакции 15 мкл. Провести полимеразную цепную реакцию в амплификаторе по программе: 95°C - 2 минуты, 35 циклов (95°C - 30 сек, 54°C - 45 сек, 72°C - 60 сек), 72°C - 5 минут.

5. Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Разделение фрагментов в геле осуществляется в течение 40-45 минут при 120V.

Положительным результатом считается получение уникального фрагмента ДНК размером 257 п.н.

Примеры конкретной реализации

Идентификация вируса крапчатости винограда в симптоматичных и бессимптомных листьях винограда

Из трех образцов листьев виноградной лозы, один из которых отличается характерными симптомами GFkV (пожелтением жилок листьев и закручиванием краев листьев вверх), а у двух других симптомы заболевания отсутствуют, выделяют тотальную РНК по методике, описанной выше. На выделенной тотальной РНК проводят реакцию обратной транскрипции (ОТ) по описанному протоколу. Полученную кДНК добавляют в качестве матрицы для ПЦР при указанных выше условиях с использованием набора синтетических олигонуклеотидов GFkVF и GFkV_R. Продукты амплификации визуализируют при помощи электрофореза.

Размер полученных фрагментов должен составлять 257 п.н. (фиг.). Фрагмент указанного размера амплифицируется при наличии GFkV как в образцах с симптомами заболевания, так и в бессимптомных. При отсутствии фрагмента размером 257 п.н. вирус крапчатости винограда в анализируемом материале отсутствует.

Таким образом, использование набора синтетических олигонуклеотидов GFkV F и GFkV R позволяет детектировать наличие вируса крапчатости винограда как в симптоматичных, так и в бессимптомных образцах Vitis vinifera.

Список использованной литературы

1. Martelli G.P., Sabanadzovic S., Abou Ghanem- Sabanadzovic N., Saldarelli P. // Maculavirus, a new genus of plant viruses // Virology Division News. - 2002. - Vol. 147 (№9). - P. 1847-1853.

2. Credi R., Babini A.R. // Effects of Virus and Virus-Like Infections on the Growth of Grapevine Rootstocks // Advances in Horticultural Science. - 1996. - Vol. 10 (№2). - P. 95-98.

3. Ward E., Foster S.J., Fraaije B.A., McCartney H.A. // Plant pathogen diagnostics: immunological and nucleic acid-based approaches // Annals of Applied Biology. - 2004. - Vol. 145 (№1). - P. 1-16.

4. Rott M.E., Jelkmann W. // Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry, adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR), and modification of an RNA extraction protocol // European Journal of Plant Pathology. - 2001. - Vol. 107, (№.4). - P. 411-420.

Перечень последовательностей