Средство для лечения и профилактики неалкогольной жировой болезни печени

Изобретение относится к медицине, в частности к гепатологии, и касается профилактики и лечения неалкогольной жировой болезни печени.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП) характеризуется развитием макровезикулярного стеатоза более чем в 5% гепатоцитов у лиц, не злоупотребляющих алкоголем. НАЖБП может приводить к развитию цирроза, гепатоцелюллярной карциномы и повышению смертности от дисфункции печени. Частота развития данной патологии неуклонно увеличивается, достигая 35% в некоторых развитых странах и являясь самой частой причиной хронического заболевания печени (Loomba, R., & Sanyal, А.J. (2013). The global NAFLD epidemic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 10(11), 686-690).

В связи с наличием множественных механизмов, приводящих к развитию НАЖБП, лечение и профилактика данного состояния крайне проблематичны. Более того, не существует общепринятых схем лечения НАЖБП. В настоящее время в качестве препаратов для лечения используются тиазолидиндионы, метформин, статины. Также оценивается эффективность препаратов против ожирения, селективных блокаторов рецепторов к канабиноидам, агонистов и . В то же время эффективность данных средств не доказана (Mishra, Р., & Younossi, Z.М. (2007). Current treatment strategies for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Current drug discovery technologies, 4(2), 133-140). Сомнительной также представляется возможность применения данных препаратов для профилактики данной патологии.

В частности, заявлено средство лечения и профилактики НАЖБП, представляющее собой композицию, включающую гидроксихлорохин, бигуаниды и статины. Экспериментальное обоснование эффективности средства проводилось на лабораторных животных, получающих 10% раствор фруктозы в течение 2 недель (Pareek, Anil. "Pharmaceutical compositions for the treatment/prophylaxis of non-alcoholic fatty liver disease." U.S. Patent Application No. 13/501, 342). Учитывая тот факт, что применение лишь растворов фруктозы с концентрацией более 30%, а также высокожировых диет с содержанием жиров 30-75% или же в сочетании с углеводным компонентом позволяет эффективно смоделировать НАЖБП с соответствующим метаболическим профилем (Kanuri, G., & Bergheim, I. (2013). In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International journal of molecular sciences, 14(6), 11963-11980), сомнительно, что предложенное средство может быть эффективным для профилактики тяжелой НАЖБП. Наличие побочного действия у статинов и бигуанидов, входящих в состав предлагаемого средства, также существенно ограничивает его применение с целью профилактики НАЖБП.

В качестве альтернативного подхода к лечению и профилактике НАЖБП используются фитотерапевтические препараты и композиции, наиболее исследованным из которых является силимарин - липофильный экстракт из Silybum marianum, и его основное действующее вещество силибин (Milosevic, N., Milanovic, М., Abenavoli, L., & Milic, N. (2014). Phytotherapy and NAFLD-from Goals and Challenges to Clinical Practice. Reviews on recent clinical trials, 9(3), 195-203). В частности, введение силибина сопровождалось уменьшением степени стеатоза, что было продемонстрировано экспериментально с использованием модели НАЖБП на db/db мышах, содержащихся на метионин-холин дефицитной диете (Salamone, Federico. "Method for the treatment of heart related disorders in nafld patients." U.S. Patent Application No. 13/721, 568). Однако стоит отметить, что использование метионин-холин дефицитной диеты не позволяет добиться успешного моделирования НАЖБП ввиду отсутствия развития инсулинорезистентности (Rinella, М.Е., & Green, R.М. (2004). The methionine-choline deficient dietary model of steatohepatitis does not exhibit insulin resistance. Journal of hepatology, 40(1), 47-51). В то же время, несмотря на значительное уменьшение количества пораженных гепатоцитов, при приеме силибина явления стеатогепатита оставались достаточно выраженными, особенно в центролобулярных участках.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому средству является использование экстракта травы вербейника сухого (Lysimachiae Foenum-Graeci), эффективность которого показана в экспериментах на мышах, содержащихся на высокожировом рационе с содержанием жиров 60% от общего калоража в течение 6 недель, и выражалась в снижении степени стеатоза, в виде уменьшения размера жировых включений на фоне приема предлагаемого средства (Композиция, содержащая экстракт травы вербейника сенного, для профилактики и лечения заболеваний обмена веществ. Заявка 2010126032 на патент на изобретение в РФ, http://www.findpatent.ru/patent/248/2481851.html). В то же время распространение сырья, необходимого для получения данного средства (Lysimachia Foenum-Graecum), ограничено Китаем (Seidemann J. World Spice Plants: Economic Usage, Botany, Taxonomy. Springer, Berlin-Heidelberg, 2005), а именно отдельными провинциями Гуанси и Юньнань (Li, X.R., Xin, В., Wang, G.L., Dai, Z., & Lin, R.C. (2010). Two new triterpenes from Lysimachia foenum-graecum. Journal of Asian natural products research, 12(3), 204-208), что существенно ограничивает его доступность.

Таким образом, наличие выраженных побочных эффектов у существующих препаратов для лечения НАЖБП, невозможность их использования в качестве профилактических средств, а также ограничения по использованию фитопрепаратов ввиду их недостаточной эффективности или сложности производства, диктуют необходимость поиска новых средств для лечения и профилактики НАЖБП.

Заявляемое средство решает задачу расширения арсенала средств для профилактики и лечения НАЖБП.

Отличительным признаком настоящего изобретения является использование водного извлечения из листьев Plantago maxima Juss. et Jacq в качестве средства для лечения и профилактики НАЖБП. Подорожник наибольший (Plantago maxima Juss. et Jacq) является гемикриптофитом и в степной зоне произрастает на солонцеватых, пойменных остепненных лугах, по берегам рек и озер. Ареал распространения данного вида включает в себя Западную Сибирь, Европейскую часть России, а также районы Болгарии, Румынии и Венгрии (Tzonev, R., & Karakiev, Т. (2007). Plantago maxima (Plantaginaceae): a relict species new for the Bulgarian flora. Phytol. Balcan, 13(3), 347-350), что отражает большую сырьевую базу для получения указанного средства.

Сбор растительного сырья для изготовления предлагаемого средства производился в соответствии с анатомо-морфологическими характеристиками вида (Plantago maxima Juss. et Jacq) в различных местах обитания лесостепного и степного Предуралья с резко-континентальным климатом.

Объектом наблюдения являлись крысы-самки линии Wistar в возрасте 2 мес. Животные были равномерно разделены на 4 группы по 8 в каждой. До начала эксперимента животные находились на карантине в условиях вивария в течение 2 недель. Содержание животных осуществлялось в условиях искусственной вентиляции и 12-часового светового дня. Животные всех групп имели доступ к питью и пище ad libitum.

Стандартный рацион с общей энергетической ценностью 270 ккал/100 г содержал 20% белка, 70% углеводов и 10% жиров.

В качестве модели НАЖБП выбрано алиментарное воздействие с избыточным поступлением жиров и углеводов, в частности высокожировой высокоуглеводный рацион, основанный на добавлении к стандартному рациону свиного сала с итоговым содержанием жиров - 60%, белков - 10%, углеводов - 20%. С целью увеличения поступления углеводов в организм питьевая вода замещалась на 10% раствор сахарозы на весь период исследования. Сочетание избытка жиров и углеводов в рационе животных приводит к интенсивному прогрессированию НАЖБП с развитием более поздних стадий заболевания по сравнению с использованием лишь высокожирового или же высокоуглеводного рациона (Kanuri, G., & Bergheim, I. (2013). In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International journal of molecular sciences, 14(6), 11963-11980).

Предлагаемое средство - извлечение из подорожника наибольшего (Plantago maxima Juss. et Jacq), собранного в период цветения, готовилось согласно статье Государственной Фармакопеи X №349. Для этого сырье (лист) подорожника наибольшего непосредственно перед взвешиванием измельчали до 3-5 мм. Навеску заливали экстрагентом (вода бутилированная с общей минерализацией <250 мг/л) при соотношении сырье:экстрагент 1:10 и учете коэффициента водопоглощения. Экстракция производилась путем настаивания на кипящей водяной бане при температуре 85-90°C в течение 30 минут с периодическим помешиванием. После охлаждения экстракта до комнатной температуры производилась фильтрация с помощью бумажного фильтра с целью избавления от механических включений. После экстракции шрот дополнительно отжимался с целью повышения выхода предлагаемого средства. Полученный экстракт дополнительно подвергался фильтрации. Предлагаемое средство предоставлялось животным вместо бутилированной питьевой воды ad libitum.

Животные I группы содержались на стандартном рационе и получали чистую бутилированную питьевую воду и являлись контрольными.

Животные II группы содержались на высокожировом высокоуглеводном рационе с целью моделирования НАЖБП.

Крысы III группы являлись положительным контролем и получали предлагаемое средство на фоне стандартного рациона.

Животные IV группы содержались на высокожировом высокоуглеводном рационе на фоне приема предлагаемого средства. Углеводный компонент формировался путем добавления требуемого количества сахарозы в полученное водное извлечение. Предлагаемое средство применялось в течение всего эксперимента наряду с алиментарным воздействием. Длительность эксперимента составила 6 недель.

По окончании эксперимента у животных производился забор печени. Правые фрагменты срединной доли печени (De Godoy, J.L., Malafosse, R., Fabre, M., Mitchell, C., Mehtali, M., Houssin, D., & Soubrane, O. (2000). A preclinical model of hepatocyte gene transfer: the in vivo, in situ perfused rat liver. Gene therapy, 7(21), 1816-1823) забирались у всех животных в пластиковые кассеты и фиксировались в 10% нейтральном формалине с последующей заливкой в парафиновые блоки и изготовлением срезов толщиной 5 мкм. Срезы окрашивались гематоксилином Майера и эозином. Полученные микропрепараты использовались для визуальной оценки и микрофотографирования посредством микроскопа ЛОМО Микмед-6 (Россия) при искусственном освещении. Морфометрия структур (ядра, жировые включения) осуществлялась с помощью программного пакета ImageJ. Статистическая обработка полученных данных производилась с использованием программного пакета Statistica 10.0 (Statsoft, Tulsa, OK, US). Анализ характера распределения данных производился с использованием теста Шапиро-Уилка. Поскольку распределение являлось отличным от нормального, для описательной статистики использовались медианы и соответствующие значения 25 и 75 перцентилей. Сравнение погрупповых данных осуществлялось посредством использования непараметрического U-критерия Манна-Уитни; различия считались достоверными при p<0,05.

У интактных животных отмечается нормальная ультраструктура печени как в перипортальных (Фиг. 1А), так и в центролобулярных (Фиг. 2А) зонах. Как центролобулярные, так и периферические клетки имеют разные по размерам ядра и разную степень их плоидности. Двуядерные гепатоциты преобладают среди центролобулярных клеток. Средние значения размера ядер гепатоцитов в центролобулярных и перипортальных зонах составляют 84 (72-98) и 88 (73-100) мкм² соответственно. Различимых при использовании указанного увеличения включений в цитоплазме гепатоцитов не наблюдается.

Содержание животных на высокожировом высокоуглеводном рационе сопровождается появлением крупнокапельного жирового стеатоза преимущественно в перипортальных зонах долек печени (Фиг. 1B). В этих зонах в результате выраженной жировой дистрофии обнаруживается некроз отдельных групп гепатоцитов. Увеличение размера гепатоцитов у животных данной группы, очевидно, указывает на присоединение гидропической дистрофии. Среди центролобулярных гепатоцитов данных животных наблюдаются явления как мелкокапельного, так и крупнокапельного стеатоза, однако количество погибших некрозом гепатоцитов меньше, чем в перипортальной зоне (Фиг. 2B). Описываемые гистологические изменения относительно контрольной группы отмечались у 100% экспериментальных животных. При этом площадь жировых включений в гепатоцитах в перипортальной и центролобулярной зонах составляет 101 (58-198) и 88 (54-143) мкм² соответственно. Размер ядер существенно уменьшается относительно контрольных значений на 25% (p<0,001) в центролобулярных, составляя 63 (54-76) мкм², а также на 30% (p<0,001) в перипортальных зонах, составляя 62 (53-75) мкм².

Применение средства на фоне стандартной диеты не приводит к изменениям структуры печени. Структура печени как в перипортальной (Фиг. 1С), так и в центролобулярной (Фиг. 2С) зонах идентична таковой в группе интактных животных. Размер ядер гепатоцитов у данных животных сопоставим с контрольными значениями в центролобулярной (78 (62-88) мкм²) и перипортальной зонах (82 (67-94) мкм²). Различимых жировых включений в цитоплазме гепатоцитов не отмечается.

Применение предлагаемого средства на фоне высокожирового высокоуглеводного рациона сопровождается меньшей степенью кумуляции липидов, что гистологически проявляется мелкокапельной дистрофией в перипортальных (Фиг. 1D) и центролобулярных зонах (Фиг. 2D). Так, медиана площади жировых включений в перипортальной зоне в характеризуется в 2 раза меньшими значениями по сравнению с группой животных на высокожировом высокоуглеводном рационе, составляя 46 (23-103) мкм² (p<0,001). Также отмечается уменьшение площади жировых капель в центролобулярной зоне на 23% (p<0,001) относительно соответствующих значений в группе животных на высокожировом высокоуглеводном рационе, не принимающих предлагаемое средство, составляя 68(44-111) мкм². Также отмечается увеличение количества двуядерных клеток. При этом размер ядер центральных и периферических гепатоцитов превышает соответствующие значения в группе животных с алиментарной нагрузкой, не принимающих предлагаемое средство, на 6% (p=0,006) и 18% (p<0,001), составляя 67 (56-77) мкм² и 73 (62-84) мкм² соответственно. Гистологически описываемое улучшение относительно модельной группы животных с крупнокапельным жировым стеатозом на фоне приема предлагаемого средства отмечалось у 90% животных.

Таким образом, употребление предлагаемого средства предотвращало развитие выраженного диета-индуцированного стеатоза и сопровождалось уменьшением количества и площади поперечного сечения жировых включений в центролобулярной и перипортальной зонах, а также ассоциировалось с увеличением площади ядер гепатоцитов центролобулярной и перипортальной зон.

Средство по настоящему изобретению может быть использовано в исходном виде или же введено в композицию, включающую в себя фармацевтически приемлемый носитель после предварительной концентрации или высушивания. Под термином "фармацевтически приемлемый носитель" понимается носитель, не вызывающий каких-либо неблагоприятных эффектов у пациентов на фоне его введения.

Средство по настоящему изобретению может быть включено в состав различных фармацевтических композиций. Фармацевтическая композиция заявляемого средства может быть составлена в виде множества форм, включая жидкую, гелеобразную, капсулированную или таблетированную в случае выпаривания и концентрации. Фармацевтическая композиция заявляемого средства разработана для введения перорально.

Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о возможности использования водного извлечения листьев подорожника наибольшего (Plantago maxima Juss. et Jacq), в том числе в составе композиций, для лечения и профилактики неалкогольной жировой болезни печени.