СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВ МЕЖКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА В РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ ТКАНЯХ ПРИ АНАЛИЗЕ ЦИФРОВЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МИКРОПРЕПАРАТОВ В ПРОГРАММЕ ADOBE PHOTOSHOP

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к морфологии и иммуногистохимии, и может быть использовано для сравнительной оценки содержания белков межклеточного матрикса в регенерирующих тканях на разных сроках репаративного процесса.

Предлагаемый способ основан на принципах и методах системной морфометрии и стереологии, наиболее близкими из которых являются способы определения объемной плотности тканевых микроструктур (V_Vi):

- Метод наложения точечных сеток (метод «полей» А.А. Глаголева) на срезы с последующим подсчетом числа совпадений точек с профилями исследуемых структур, а доля точек, попавших на структурные профиля (P_Pi), оценивает их относительный объем: V_Vi=P_Pi=P_Pi/P_T, где Р_T - общее число точек тестовой системы [1].

- Метод суммирования линий сканирования, заключенных между границами профилей структуры (L_Li), и последующего отнесения полученного значения к общей суммарной длине тестовой линии (L_T): V_Vi=L_Li=L_Li/L_T (1).

Недостатками вышеперечисленных способов является наличие многочисленных, зачастую трудновыполнимых условий для получения объективных данных: необходимость многократных измерений, трудоемкость применения окулярной точечной сетки, окулярной тестовой линии сканирования или аналогичных измерительных сеток и линий, но адаптированных для микрофотографий, «ручной» подсчет элементов, большие затраты времени, большая погрешность измерений из-за размытости границ гистохимической окраски структур и субъективной оценки свето- и цветовосприятия, что в совокупности усложняет использование этого метода для решения крупных научных задач.

Из уровня техники известен способ оценки участия остеоцитов в минерализации костного матрикса (патент на изобретение RU 2466408 С1, опубл. 10.11.2012. Бюл. №31) основан на подсчете числа лакун, содержащих аморфные минералы с последующим определением их процентного содержания в анализируемом остеоне, и, если минералы в аморфной фазе обнаруживаются менее чем в 30% лакун, минерализационную активность остеоцитов оценивают как низкую, при наличии аморфных минералов в 30-80% лакун - как среднюю, а если более 80% лакун содержат минералы в аморфной фазе - как высокую. Однако данный способ не предназначен для количественной оценки белков межклеточного матрикса, а позволяет оценить совершенно другой параметр - содержание минералов в аморфной фазе костного матрикса с вычислением отличных от предлагаемых количественных характеристик - подсчитывают число лакун, содержащих аморфные минералы. При этом в программе - графическом редакторе (например, Adobe PhotoShop 3.0) используют совершенно другие инструменты и методику: в полученном цифровом изображении гистологического препарата выделяют контуром один остеон, внутри контура маркируют (например, цифрами) все лакуны остеоцитов и визуализируют минералы в аморфной фазе, осуществляя цветовую сегментацию изображения так, чтобы в нем осталась только одна цветовая тональность, описываемая неравенством IB>IR>IG, где IB - значение интенсивности по синему, IR - по красному и IG - по зеленому каналам RGB - системы цифрового цвета. Также в ходе изготовления гистологического препарата используется неспецифическая окраска трихромным методом по Массону (пропись с анилиновым синим), что в совокупности с вышеперечисленным делает данный способ совершенно не пригодным для количественной оценки белков межклеточного матрикса.

Задача изобретения - расширение арсенала способов, автоматизация, объективизация и повышение точности сравнительной оценки содержания белков межклеточного матрикса в регенерирующих тканях.

Указанная задача решается путем изготовления гистологического среза исследуемой ткани с последующим иммуногистохимическим окрашиванием для специфического выявления соответствующего белка, проведения микрофотографирования, полученного иммуногистохимического микропрепарата на цифровом светооптическом микроскопе (или цифровой окулярной насадки-фотокамеры на светооптическом микроскопе) и использования компьютерной программы Adobe Photoshop в обработке цифрового изображения.

Новизной является то, что для сравнительной оценки содержания белков межклеточного матрикса в регенерирующих тканях применяется анализ цифровых микрофотографий иммуногистохимических препаратов при помощи программы Adobe Photoshop Extended версий CS3-CS6 с использованием уже интегрированных в программу модулей "Цветовой диапазон" и "Журнал измерений", но с адаптацией под специфическую окраску хромогенами иммуногистохимических препаратов при специфическом выявлении определенных белков в ходе иммуногистохимического исследования по разработанной методике программного анализа в Adobe Photoshop.

Раскрытие изобретения.

Предлагаемый способ заключается в том, что используют цифровую микрофотографию иммуногистохимического препарата, а содержания белков межклеточного матрикса программно определяют при помощи Adobe Photoshop Extended версий CS3-CS6 с использованием интегрированных модулей "Цветовой диапазон" и "Журнал измерений", по разработанной методике программного анализа, что позволяет автоматически выделять и вычислять в цифровых изображениях площади участков структур, содержащих исследуемые белки с последующим объективным и точным вычислением их относительного содержания в тканях по формуле ООП (%)=(S_a/S_t)×100, где ООП - относительная объемная плотность, S_a - суммарная площадь всех выделенных областей в анализируемом изображении, S_t - общая площадь цифрового изображения.

Объясняя выше предложенную формулу ООП(%)=(S_a/S_t)×100, необходимо пояснить, что определение относительного объема какой-либо структуры (V_Vi), т.е. совокупного объема этой структуры (V_i) в единице объема (тестовом объеме) ткани (V_т), основано на принципе Делессе: V_Vi=A_Ai, где A_Ai - площадь, занимаемая структурой i на площади среза [3], что позволяет от двумерных величин (площадей) перейти к объемным отношениям, что и использовано при вычислении относительной объемной плотности (ООП) в результате математических действий с площадью (S_a и S_t). Относительный объем какой-либо структуры (V_Vi), равно как и площадь, занимаемую структурой i на площади среза в исследуемой ткани (A_Ai), при выполнении стереометрического анализа гистологических и цитологических препаратов рекомендуется называть объемной плотностью структуры [1], что и взято за основу номенклатурного позиционирования, вычисляемой в предложенном методе, количественной характеристике относительной объемной плотности (ООП) белков межклеточного матрикса.

Изобретение иллюстрируется чертежами с подробным описанием и примером его практического использования.

Фиг. 1 - ООП остеокальцина в периостальной мозоли.

Фиг. 2 - ООП остеокальцина в эндостальной мозоли.

Фиг. 3 - ООП коллагена II типа в периостальной мозоли.

Фиг. 4 - ООП коллагена II типа в эндостальной мозоли.

Фиг. 5. - А) Контрольная группа, периостальная зона перелома, иммуногистохимическая реакция на выявление экспрессии коллагена I типа (коричневого цвета), об. ув. x 600.

Б) Опытная группа, периостальная зона перелома, иммуногистохимическая реакция на выявление экспрессии коллагена I типа (коричневого цвета), об. ув. x 600.

Описание способа

Цифровой фотоснимок загружают в программу Adobe Photoshop CS6 Extended (подходят и более ранние CS3, CS4, CS5 версии программы) и в левой колонке панели инструментов выбирают инструмент "Волшебная палочка", после чего правой кнопкой мышки кликают на окне загруженного изображения и в раскрывающемся контекстном меню выбирают "Цветовой диапазон" – инструмент, обеспечивающий выбор области в изображении по тональности или цвету. Также существует второй способ активации этого инструмента, для чего необходимо кликнуть по вкладке главного меню "Выделение", и в открывшемся меню выбрать соответствующую строку: "Цветовой диапазон". После клика по строке откроется диалоговое окно инструмента и автоматически активируется дополнительный инструмент "Пипетка", преобразующий курсор мышки в цветочувствительный маркер, с помощью которого в области цифровой микрофотографии выбираем участок нужного цвета и тональности, соответствующий цвету и тональности преципитирующего специфического хромогена соответстующей системы детекции, применяемой в ходе иммуногистохимического окрашивания гистологического препарата. После выбора "Пипеткой" нужного цвета на всей площади цифровой микрофотографии автоматически произойдет выделение областей подобного цвета и тональности. Далее границы выделенных областей расширяют или сокращают в зависимости от избыточности или недостаточности включения в области выделения пикселей тех оттенков и тональностей цвета, что соответствуют цвету шаблона используемой системы детекции. Для этого в правой стороне диалогового окна "Цветовой диапазон" выбирают пипетку со знаком «+» -инструмент добавления к границам выделенной области дополнительных пикселей нужных оттенков необходимого цвета, и пипетка со знаком «-», которая при клике мышкой на соответствующие пиксели в цифровом изображении вычитает их из всей области выделения, сокращая ее границы. В диалоговом окне "Цветового диапазона" имеется опция "Разброс" для установки приемлемого диапазона яркости выделяемых пикселей, от настройки параметров которой также будут зависеть границы выделяемой области. Чем выше установить значение "Разброса", тем больше уровней яркости включается в пределы допуска. По умолчанию "Разброс" имеет значение 40, это значит, что будут выбраны все пиксели изображения, имеющие точно такой же цвет, как и тот участок (образец), по которому кликнули пипеткой, а также все пиксели, которые имеют яркость в пределах 40 единиц светлее или темнее образца. Любые пиксели, яркость которых на 41-н и более уровней светлее или темнее, не будут включены в выделение. После необходимой коррекции по яркости включаемых в область выделения пикселей формируются окончательные, уточненные путем настройки вышеописанных параметров границы выделенных областей цифровой микрофотографии, суммарная относительная площадь которой и будет соответствовать относительной объемной плотности белков межклеточного матрикса, проявивших себя в цифровом изображении окраской, соответствующей цвету специфического хромогена (например, хромоген DAB образует темно-коричневые преципитаты). Для того чтобы при анализе следующего цифрового изображения гистологических препаратов той же ткани, окрашенной теми же иммуногистохимическими реактивами, не повторять коррекцию границ областей выделения и нивилировать субъективность (а значит и возможные ошибки) при каждой такой коррекции, необходимо сохранить шаблон настроенных параметров инструмента уже откорректированных границ. Для этого в интерфейсе диалогового окна "Цветового диапазона" при завершении настройки всех необходимых параметров этого инструмента при первой загрузке цифровой микрофотографии исследуемого иммуногистогимического препарата или шаблона, используемой системы детекции, кликают на опцию "Сохранить", после чего, во вновь открывшемся диалоговом окне, сохраняют сформированный шаблон в файл с расширением «.АХТ». Теперь при анализе следующего цифрового изображения гистологических препаратов той же ткани, окрашенной теми же иммуногистохимическими реактивами, вместо настройки каждого параметра "Цветового диапазона" в диалоговом окне данного инструмента кликают на опцию "Загрузить" и в открывшемся диалоговом окне выбирают сохраненный ранее шаблон со всеми необходимыми настройками, после чего автоматически произойдет выделение областей цифровой микрофотографии с уже откорректированными границами согласно преднастроенному шаблону, что значительно сократит время исследования и исключит субъективность оценки.

Далее для точного определения относительной объемной плотности (ООП) изучаемых белков межклеточного матрикса нужно рассчитать отношение суммарной площади выделенных областей в изображении к общей площади цифровой микрофотографии. Для этого кликают по вкладке главного меню "Окно" и в открывшемся меню выбирают строку: "Журнал измерений" (строка имеется в наличии только в Extended версии программы Photoshop). Далее в левой верхней части открывшегося диалогового окна инструмента "Журнал измерений" кликают на опцию "Записать измерения", после чего автоматически сформируется таблица с различными рассчитанными параметрами выделенных областей изображения. Числовое значение первой строки "Измерение 1" в столбце "Площадь" будет соответствовать суммарной площади всех выделенных областей в анализируемом изображении (S_a). Общая площадь цифрового изображения (S_t) зависит от разрешения микрофотографии и соответствует произведению значений первой строки "Измерение 1" в столбцах "Высота" и "Ширина" таблицы инструмента "Журнал измерений". Значение S_t будет всегда одинаковым при условии одинакового разрешения для всех анализируемых цифровых изображений, что значительно упрощает вычисление ООП по следующей формуле ООП (%)=(S_a/S_t)×100. Единицей измерения по умолчанию является пиксел.

Пример конкретного использования

Экспериментальное исследование проведено на 70 половозрелых крысах самцах линии «Вистар». Все исследования на животных были выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза СССР от 13.11.1984 г. №724). Животным под ингаляционным наркозом формировали открытый поперечный перелом средней трети диафиза левой большеберцовой кости. В опытной группе (ОГ) животным в область перелома на 1 и 2 сутки эксперимента вводили по 0,5 мл препарата «Винфар» [4], в контрольной группе (КГ) - 0,5 мл физ. раствора. Осуществлена естественная иммобилизация посредством сохранившей целостность малоберцовой кости. Животных выводили из опыта на 3, 14, 21, 28, 44 и 61 сутки. Исследования проводили с использованием гистологических, иммуногистохимических методов и морфометрии. Гистологическое исследование включало окраску гематоксилином Майера и эозином. При проведении иммуногистохимических методов исследования для выявления экспрессии Osteocalcin (маркер созревания костной ткани), collagen II (маркер хондрогенеза) и collagen I (в исследовании - маркер остеогенеза) использовались соответственно антитела anti-Osteocalcine («SPRING Bioscience)), США), anti-Collagene II Type и anti-Collagene I Type («GeneTex», США). Используемая система детекции - Reveal Polyvalent HRP - DAB Detection System («SPRING Bioscience)), США). Подсчет площади остеокальцина и коллагеновых волокон производился при помощи программы Adobe Photoshop CS6 Extended в относительных значениях (относительная объемная плотность - ООП вычислялась по вышеописанной методике), в пределах исследуемого гистосреза на 1 цифровой микрофотографии (равной 1 полю зрения) при увеличении x300 минимум в 5 полях зрения (микрофотографий) для каждого показателя. При проведении статистической обработки результатов вычисляли средние значения абсолютных и относительных величин (М), ошибки средних величин (m) и t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверно значимыми при уровне вероятности p<0,05.

На 3 сутки у животных контрольной группы (КГ) в периостальной зоне перелома синтез остеокальцина незначителен и составляет 0,218±0,009%, тогда как в опытной группе (ОГ) ООП остеокальцина в 2 раза выше - 0,423±0,013% (см. Фиг. 1). Экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 9,40±0,62%) больше таковой группы контроля (ООП 3,92±0,31%) почти в 3 раза. У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 4,77±0,11%, что незначительно превышает данный показатель в ОГ (ООП коллагена II типа 4,03±0,08%). В эндостальной костной мозоли на 3 сутки эксперимента содержание остеокальцина в ОГ вдвое больше КГ и незначительно превышает аналогичные показатели периостальной зоны (ООП остеокальцина КГ 0,293±0,011% и ООП остеокальцина КГ 0,579±0,013%) (см. Фиг. 2). ООП коллагена I типа в эндостальной мозоли в обеих группах троекратно, а ООП коллагена II типа - четырехкратно меньше, чем в периостальной мозоли (см. Фиг. 3 и 4).

На 21 сутки у животных КГ в периостальной зоне перелома ООП экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 20,7±1,01%) на этом сроке возрастает и, по-прежнему, больше таковой группы контроля (ООП 11,25±1,12%). У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 19,16±0,98%, в ОГ ООП коллагена II типа - 12,55±0,52%, т.е. происходит двукратное увеличение экспрессии коллагена II по сравнению с 14 сутками. В эндостальной костной мозоли на 21 сутки эксперимента содержание остеокальцина в КГ (ООП 0,747±0,008%) незначительно превышает ОГ (ООП 0,621±0,013%), ООП остеокальцина которой меньше значений предыдущего срока, что означает более раннее (по сравнению с КГ) начало редукции эндостальной мозоли.

На 44 сутки у животных КГ в периостальной зоне перелома ООП остеокальцина составляет 1,156±0,034%, а в ОГ ООП остеокальцина уже на данном сроке достигает значений (ООП 1,582±0,026%), близких с ООП нормальной (около 1,6%) костной ткани [2]. Экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 42,43±2,21%) на этом сроке возрастает на четверть и, по-прежнему, двукратно больше таковой группы контроля (ООП 21,23±1,94%), что визуально проявляется в большей интенсивности окраски иммуногистохимических препаратов опытной группы (см. Фиг. 5А и Б). У животных контрольной группы ООП коллагена II типа составляет 9,35±0,97%, в ОГ ООП коллагена II типа - 4,33±0,82%, т.е. происходит уменьшение экспрессии коллагена II в обеих группах по сравнению с предыдущим сроком, из-за остеогенной реорганизацией периостальной мозоли, что также подтверждается увеличением ООП коллагена I типа, см. выше. В эндостальной костной мозоли на 44 сутки эксперимента содержание остеокальцина продолжает уменьшаться в обеих группах животных, и, по-прежнему, в КГ ООП (0,460±0,017%) двукратно превышает ООП остеокальцина ОГ (0,242±0,028%) из-за более выраженной редукции эндостальной мозоли в ОГ по сравнению с контролем. ООП коллагена I типа эндостальной мозоли в КГ все еще увеличивается - 12,2±0,49%, тогда как в ОГ уменьшается - 8,75±0,53%, подтверждая развитие эндостальной мозоли в КГ и продолжение процесса ее редукции в ОГ на данном сроке эксперимента. ООП коллагена II типа КГ - 6,04±0,12%, в ОГ - 2,97±0,47%.

На 61 сутки экспрессия коллагена I типа в ОГ (ООП 69,25±2,23%) на этом сроке возрастает более чем на треть и на треть больше таковой группы контроля (ООП 46,09±1,74%), на данном сроке достигая значений, близких с ООП коллагена I нормальной (около 70,0%) костной ткани [2]. ООП коллагена I типа эндостальной мозоли в КГ начинает уменьшаться только на 61 сутки - 8,87±0,05%, подтверждая только начавшийся процесс редукции эндостальной мозоли, тогда как в ОГ ООП коллагена I типа составляет 8,01±0,02%, достигая значений, близких с ООП коллагена I нормальной костной ткани (около 7,0-8,0%). ООП коллагена II типа КГ - 2,9±0,03%, в ОГ - 1,09±0,02%.

Технический результат

Таким образом, определение ООП коллагеновых и неколлагеновых белков эндостальной и периостальной мозолей по формуле ООП(%)=(S_a/S_t)×100, при автоматическом выделении и вычислении с помощью программы Adobe Photoshop Extended в цифровых изображениях площадей участков структур, содержащих исследуемые белки - S_a и S_t , позволяет объективно определить динамику заживления открытого перелома кости в эксперименте, что в примере конкретного использования подтверждается более ранними сроками консолидации перелома диафиза большеберцовой кости в опытной группе животных при применении препарата «Винфар» в результате мощного ангиогенного воздействия входящего в его состав фактора роста фибробластов, а также влияния на пролиферативную активность клеток хондрогенного и остеогенного дифферонов, ответственных за синтез соответствующих белков межклеточного матрикса.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистопатологии / Г.Г. Автандилов. - Москва: РМАПО, 1996. - С 54-57.

2. Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полостей рта: учебное пособие. - 2-е изд., испр. и доп. - 2008. - 208 с.

3. Максимов Г.К. Статистическое моделирование многомерных систем в медицине / Г.К. Максимов, А.Н. Синицин. - Л.: Медицина, 1983. - 144 с.

4. Свидетельство на товарный знак (знак обслуживания) №433087 «Винфар»/ Правообладатель Никитенко В.И. Зарегистрировано 23 марта 2011 г.