Способ диагностики эндогенной интоксикации криопротекторного генеза

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному исследованию, и может использоваться для диагностики эндогенной интоксикации и степени ее выраженности при разработке нетоксичного криопротектора на белых беспородных мышах. Для осуществления способа тест-дозу испытуемого антифриза согревают до +37÷39°C, вводят в брюшную полость (0,5 мл/животное), выдерживают в организме мыши в течение 25 мин, выполняют мгновенную декапитацию головы животного, собирают кровь в пробирку, пробы центрифугируют, сыворотку крови наносят каплями объемом 4 мкл на предметное стекло, высушивают при +37°C в горизонтальном положении в течение 1-1,5 часов и анализируют структурность фации дегидратированных капель под микроскопом в проходящем свете [1, 2]. Фации испытуемого антифриза сравнивают с паттерном разных степеней эндогенной интоксикации по показателям: индекс структурности (ИС), кристаллизуемость (Кр), степень деструкции фации (СДФ) и выраженность краевой зоны фации (Кз). Тестируемое химическое вещество, у которого структурность фации аналогична паттерну с высокой степенью выраженности эндогенной интоксикации, относят к высокотоксичным и неперспективным для разработки нетоксичного криопротектора. Тестируемые химические вещества, у которых структурность фации аналогична паттерну с низкой степенью выраженности эндогенной интоксикации, относят к малотоксичным и перспективным для разработки нетоксичного криопротектора. Способ прост и доступен в осуществлении. Использование заявленного способа позволяет с высокой точностью диагностировать степень выраженности эндогенной интоксикации и расширить список разрешенных «лекарственных» форм для разработки нетоксичного криопротектора.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторному исследованию сыворотки крови мышей, и может использоваться для диагностики эндогенной интоксикации и степени ее выраженности на экспериментальном этапе разработки нетоксичного криопротектора.

Уровень техники

Эндогенная интоксикация представляет собой синдром, характеризующийся накоплением в органах и тканях организма избытка эндогенных токсических субстанций и нарушением их выделения естественными органами детоксикации [3, 4].

На протяжении всей истории применения замороженных компонентов крови и костного мозга с лечебной целью важная роль отводится разработке нетоксичного криопротектора. В последние годы актуальным направлением криотрансфузиологии является многофакторное исследование синдрома эндогенной интоксикации. Показано, что эндогенная интоксикация криопротекторного генеза развивается в организме на клеточном и организменном уровнях. Она же ответственна за развитие различной степени выраженности посттрансфузионных реакций или осложнений [5].

Для внутрибрюшинного способа введения тест-доз антифризов мышам могут быть разрешены как масляные растворы, жиры, эмульсии, суспензии, так и химические вещества с другими «лекарственными» формами, для которых внутривенный путь инъекций запрещен. Кроме того, современная методология доказательной оценки нетоксичных антифризов испытывает потребность в использовании морфометрических тестов по кристаллизуемости фаций сыворотки крови мышей [1, 2, 6, 7].

Задачей предлагаемого изобретения является устранение этого недостатка.

За аналог предлагаемого изобретения выбран известный способ испытания лекарственных средств на аномальную токсичность, включающий внутрибрюшинный способ введения в организм животного тест-доз водных растворов лекарственных средств [6].

Известный способ (тест для вакцин и сывороток) испытывают на 5 здоровых белых мышах обоего пола массой 17-20 г. Сухой лекарственный препарат растворяют прилагаемым растворителем и вводят внутрибрюшинно не более 1,0 мл каждому из животных, после чего за животными наблюдают в течение 7 суток. Лекарственное средство выдерживает испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не появятся признаки интоксикации или не погибнет ни одна из подопытных мышей.

За прототип предлагаемого изобретения выбран метод изучения индукции металлотионеинов в организме мышей, который включает однократное введение растворимых солей тяжелых металлов внутрибрюшинным или внутривенным способами, последующую декапитацию, сбор крови, аутопсию печени и их целевое исследование [8].

Известный способ осуществляют на нелинейных белых лабораторных мышах - самцах массой 18-25 г, разделенных на 6 групп по 5 животных в каждой. I группа служит контролем. Каждому животному II, III, IV, V, VI групп внутрибрюшинно вводят (в зависимости от массы) 0,4-0,5 мл растворимой соли свинца, меди, цинка, ртути или кадмия соответственно. Через 3 суток проводят декапитацию головы животных под эфирным наркозом, собирают кровь и резецируют печень для целевых исследований.

Недостатки известных способов заключаются в ограниченности количества испытуемых антифризов и получении фрагментарных сведений для диагностики эндогенной интоксикации.

Эти недостатки усложняют выполнение программы поиска нетоксичного криопротектора.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом изобретения является увеличение количества «лекарственных» форм со свойствами антифризов, повышение информативности методологии оценки степени интенсивности эндогенной интоксикации и упрощение скрининга в диагностике химических веществ, перспективных для разработки нетоксичного криопротектора.

Сущность изобретения заключается в том, что для диагностики эндогенной интоксикации криопротекторного генеза тест-дозу испытуемого антифриза согревают до +37÷39°С, вводят в брюшную полость (0,5 мл/животное), выдерживают в организме мыши в течение 25 мин, выполняют мгновенную декапитацию головы животного, собирают кровь в пробирку, пробы центрифугируют, сыворотку крови наносят каплями объемом 4 мкл на предметное стекло, высушивают при +37°С в горизонтальном положении в течение 1-1,5 часов и анализируют структурность фации дегидратированных капель под микроскопом в проходящем свете. Фации испытуемого антифриза сравнивают с паттерном разных степеней эндогенной интоксикации по показателям: индекс структурности (ИС), кристаллизуемость (Кр), степень деструкции фации (СДФ) и выраженность краевой зоны фации (Кз) [1, 2]. Тестируемое химическое вещество, у которого структурность фации аналогична паттерну с высокой степенью выраженности эндогенной интоксикации, относят к высокотоксичным и неперспективным для разработки нетоксичного криопротектора. Тестируемые химические вещества, у которых структурность фации аналогична паттерну с низкой степенью выраженности эндогенной интоксикации, относят к малотоксичным и перспективным для разработки нетоксичного криопротектора. Способ прост и доступен в осуществлении. Использование заявленного способа позволяет с высокой точностью диагностировать степень выраженности эндогенной интоксикации и расширить список разрешенных «лекарственных» форм для разработки нетоксичного криопротектора.

Способ диагностики эндогенной интоксикации криопротекторного генеза осуществляется следующим образом.

1. Готовят бланк с кристаллоскопическим паттерном сыворотки крови мышей с низкой степенью выраженности эндогенной интоксикации.

2. Готовят тест-дозы испытуемых антифризов в различных «лекарственных» формах. Разрешены: водные и масляные растворы, жиры, эмульсии, суспензии и другие, подогретые до +37÷39°С.

3. Производят внутрибрюшинное введение тест-доз испытуемого антифриза по 0,5 мл каждому животному.

4. Производят мгновенную декапитацию головы мыши острыми ножницами.

5. Производят забор артериовенозной крови из рассеченных сосудов до окончания агонии мыши и центрифугируют для получения сыворотки.

6. Сыворотку крови в виде округлых капель (не менее 5-6) объемом 4 мкл каждая наносят на предметное стекло.

7. Капли с испытуемым антифризом высушивают в термостате при +37°С в горизонтальном положении на протяжении 1-1,5 часов.

8. Под микроскопом в проходящем свете изучают особенности кристаллизации фации и при аналогичности структуропостроения испытуемого антифриза контрольному паттерну с низкой степенью выраженности эндогенной интоксикации испытуемый антифриз относят к малотоксичным и перспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Примеры

Контрольная проба. Паттерн результатов кристаллоскопических фаций сыворотки крови беспородных белых мышей-самцамов в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г после внутрибрюшинного введения криопротектора с низкой степенью выраженности эндогенной интоксикации: ИС=0,55±0,22; Кр=0,77±0,21; СДФ=1,50±0,32; Кз=1,18±0,21. ∑=4,00. Вывод: испытуемое вещество относится к малотоксичным криопротекторам.

Пример 1. Беспородным белым мышам-самцам в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г вводят внутрибрюшинно подогретую до +37÷39°С тест-дозу 0,5 мл масляной формы испытуемого вещества «1». ИС=1,00±0,41; Кр=1,48±0,36; СДФ=1,05±0,11; Кз=1,08±0,12. ∑=4,61. Вывод: испытуемое вещество относится к малотоксичным и перспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Пример 2. Беспородным белым мышам-самцам в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г вводят внутрибрюшинно подогретую до +37÷39°С тест-дозу 0,5 мл эмульсии испытуемого вещества «2». ИС=0,73±0,25; Кр=1,18±0,21; СДФ=1,50±0,20; Кз=1,43±0,24. ∑=4,84. Вывод: испытуемое вещество относится к малотоксичным и перспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Пример 3. Беспородным белым мышам-самцам в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г вводят внутрибрюшинно подогретую до +37÷39°С тест-дозу 0,5 мл раствора вещества «3» на воде для инъекций. ИС=1,20±0,31; Кр=1,90±0,13; СДФ=2,00±0,35; Кз=2,00±0,24. ∑=7,10. Вывод: испытуемое вещество относится к токсичным и неперспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Пример 4. Беспородным белым мышам-самцам в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г вводят внутрибрюшинно подогретую до +37÷39°С тест-дозу 0,5 мл раствора вещества «4» на 0,9% NaCl. ИС=2,21±0,09; Кр=2,14±0,23; СДФ=1,29±0,09; Кз=1,50±0,00. ∑=7,14. Вывод: испытуемое вещество относится к токсичным и неперспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Пример 5. Беспородным белым мышам-самцам в возрасте 4-6 мес массой 17-20 г вводят внутрибрюшинно подогретую до +37÷39°С тест-дозу 0,5 мл раствора «5» на растворе Кребса. ИС=1,67±0,26; Кр=2,00±0,31; СДФ=2,12±0,18; Кз=1,46±0,22. ∑=7,25. Вывод: испытуемое вещество относится к токсичным и неперспективным для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Представленный пример иллюстрирует применимость предлагаемого способа диагностики эндогенной интоксикации криопротекторного генеза. Согласно анализу результатов кристаллизации к малотоксичным и перспективными для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора относятся вещества «1» и «2», у которых, по сравнению с паттерном контрольной пробы, выявлена более выраженная аналогичность структуропостроения зональных структур фаций высушенных капель.

Необходимое оборудование: персональный компьютер, микроскоп с проходящим светом, цифровая приставка, пипеточный микродозатор, предметные стекла, набор тест-проб антифризов.

Способ прост и доступен в осуществлении. Использование заявленного способа позволяет определить степень выраженности эндогенной интоксикации и расширить список разрешенных «лекарственных» форм для разработки нетоксичного криопротектора. Может быть освоен в научных центрах, разрабатывающих нетоксичные криопротекторы и гемоконсерванты на их основе.

Таким образом, благодаря использованию указанного способа диагностики эндогенной интоксикации криопротекторного генеза удается быстро оценить степень ее интенсивности и дать оценку пригодности испытуемого антифриза для дальнейшей углубленной разработки нетоксичного криопротектора.

Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования изобретения является возможность проведения скрининга антифризов для разработки нетоксичного криопротектора.

Источники информации

1. Камакин Н.Ф., Мартусевич А.К. Тезикристаллоскопическое исследование биологических субстратов: Методические рекомендации. Киров, 2005. - 34 с.

2. Ковалева Л.К. Кристаллогенные свойства сыворотки крови как интегральный показатель адаптационных возможностей организма: Автореф. … дис. канд. биол. наук. - Киров, 2014. - 16 с.

3. Малахов М.Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации. Пособие для врачей. – СПб.: СПбМАПО, 1995. - 33 с.

4. Лабораторная оценка тяжести синдрома эндогенной интоксикации и выбор метода детоксикации у хирургических больных / Иванова В.Н., Обедин А.Н., Первушин Ю.В. и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999.- №11. - С. 33.

5. Костяев А.А., Андреев А.А., Мартусевич А.К. Токсичность криопротекторов и криоконсервантов на их основе для компонентов крови и костного мозга (Обзорная статья) // Научное обозрение. Медицинские науки. – 2016. - №6. - С. 54-74.

6. Государственная фармакопея Российской Федерации / Мз и CP РФ. - М.: изд-во НЦ экспертизы средств медицинского применения. ХII издание, часть I. - 2008. - 704 с.

7. Современные методы доставки лекарственных препаратов в клинической практике / Креативная онкология и хирургия // Ганцев Ш.Х., Умезаева К., Ганцева Х.Х. и др. - 2012. - №3. - С. 1-4.

8. Пыхтеева Е.Г. Изучение индукции металлотионеинов в печени мышей при внутрибрюшинном введении солей двухвалентных металлов / Современные проблемы токсикологии. - 2012. - №01(56).