Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ВАСКУЛЯРИЗИРОВАННОГО БЕЛЬМА РОГОВИЦЫ ВСЛЕДСТВИЕ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЫ ГЛАЗА

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза.

Ожог глаза, в том числе ожог роговицы, относятся к одному из самых тяжелых повреждений органа зрения по характеру изменений в тканях. При катастрофах, обусловленных взрывами и пожарами, наиболее тяжелую группу составляют обожженные, у которых почти в 80% случаев встречаются ожоги глаз. Тяжесть травмы усугубляется еще и тем, что носит, как правило, двухсторонний характер.

Отдельное место занимают ожоги глаз паром и горячей водой. Повреждающее действие на роговицу оказывает вода, подогретая до 45°C. При температуре 47°C через 1-2 мин эпителий роговицы становится мутным, при 65°C страдает строма, наблюдается отек роговичных пластинок, при 80°C происходят отчетливые изменения в эндотелии, повреждается ткань радужной оболочки и хрусталик.

По данным отечественных источников ожоги глаз составляют от 6,1% до 38,4% всех травм глаз. В свою очередь, термические ожоги глаз составляют до 30% всех травм органа зрения.

Существующие консервативные методы лечения не обеспечивают в достаточной мере профилактику неоваскуляризации и помутнения роговицы, что говорит об актуальности поиска альтернативных способов лечения данной патологии.

Известен способ воздействия anti-IL-6R антител и TNFR-Fc на поврежденную в результате химического воздействия поверхность роговицы кролика [Sakimoto Т. Potential Application of Biological Products for the Treatment of Ocular Surface Inflammation // Cornea. 2015 Nov; 34 Suppl ll:S153-7. doi: 10.1097/ICO.0000000000000585]. Закапывание препарата производили до 28 суток. Было показано, что блокада IL-6R способствует уменьшению воспаления роговицы. Неоваскуляризация роговицы, индуцированная щелочным ожогом, подавляется закапыванием IL-6R на 14-й день, закапыванием TNFR-Fc на 28-й день, что значительно эффективнее, чем в контрольной группе, где закапывали фосфатно-солевой буферный раствор (phosphate-buffered saline (PBS)). Недостатком данного способа является использование фторхинолонов, что может снижать эффективность применения пептидов.

Известен способ применения подконъюнктивальных инъекций ангиостатина К1-4,5 (продукт обмена плазминогена) при ожоговой неоваскуляризации роговицы у кроликов [Чеснокова Н.Б., Ашина Р.Б., Мухаметова Л.И., Павленко Т.А., Гулин Д.А. Компоненты фибринолиза, регуляции ангиогенеза на примере ожоговой неоваскуляризации роговицы у кроликов // Вестн. офтальмол. 2012; 128(4):62-65]. Инъекции выполняли в течение 3-х недель. Это приводило к значительному подавлению неоваскуляризации роговицы в течение 14 дней, а также подавлению активного ветвления сосудов впоследствии. Использование ангиостатина способствовало уменьшению глубины и площади язвы роговицы. Полученные данные указывают на перспективность использования препаратов на основе ангиостатина К 1-4,5 для подавления неоваскуляризации роговицы и для лечения заболеваний, связанных с изъязвлением роговицы. Недостатком данного способа является невозможность получения полного регресса неоваскуляризации роговицы.

Задачей изобретения является создание безопасного и эффективного способа лечения васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза.

Техническим результатом заявляемого способа является восстановление прозрачности роговицы, достижение полного и стойкого регресса неоваскуляризации роговицы, неинвазивность лечебного воздействия.

Технический результат достигается тем, что, в способе лечения васкуляризированного бельма роговицы вследствие ожоговой травмы глаза, согласно изобретению, выполняют инстилляции препарата пептидов в конъюнктивальную полость: с первых по 14-е сутки - шестикратно в течение часа (интервал между закапываниями - 10 минут), с 14-х по 30-е сутки - четырехкратно в течение часа (интервал между закапываниями - 20 минут), при этом раствор пептидов получают следующим образом: выделяют мононуклеарную фракцию собственных клеток костного мозга, суспензию мононуклеарных клеток высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, после получения клеточного монослоя проводят полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом мезенхимальных стволовых клеток (МСК), культуру клеток разрушают, используя физико-химические методы (два цикла замораживание-оттаивание).

Технический результат достигается за счет того, что:

1) используют кондиционированную среду и лизат МСК, которые обладают протективным эффектом и снижают уровень воспалительной реакции, что проявляется в уменьшении отека, более быстром восстановлении поверхности роговицы, ингибировании неоваскулогенеза;

2) используют препарат с высокими концентрациями VEGF (до 1200 пг/мл) [Khubutiya М., Temnov A., Vagabov V., Sklifas A., Rogov К., Zhgutov Y. Effect of Conditioned Medium and Bone Marrow Stem Cell Lysate on the Course of Acetaminophen-Induced Liver Failure // Bull Exp Biol Med. 2015; 159(1): 118-23], что приводит к подавлению неоваскулогенеза роговицы. Это может быть связано с инактивацией рецепторов к VEGF высокими концентрациями лиганда или с воздействием других факторов, секретируемых стволовыми клетками.

Способ осуществляется следующим образом.

Выполняют инстилляции препарата пептидов в конъюнктивальную полость. Режим инстилляций: с первых по 14-е сутки - шестикратно в течение часа (интервал между закапываниями - 10 минут), с 14-х по 30-е сутки - четырехкратно в течение часа (интервал между закапываниями - 20 минут).

Для получения препарата пептидов выделяют стволовые клетки костного мозга из тазовой кости. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга выделяют на градиенте плотности с использованием стандартного раствора Lympholyte-H (Cedarlane, Канада). Суспензию мононуклеарных клеток высевают на чашки Петри и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячий сыворотки. После получения клеточного монослоя проводят полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяют с лизатом МСК. Культуру клеток разрушают, используя физико-химические методы (два цикла замораживания-оттаивание). Готовый препарат пептидов представляет собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.

Изобретение поясняется следующими экспериментальными данными.

С применением предложенного способа пролечены 16 экспериментальных животных (кролики породы Шиншилла) (16 правых глаз) с моделью васкуляризированного ожогового бельма роговицы.

Для создания модели термического ожога роговицы использовали специальное устройство с металлическим цилиндром (∅ основания - 4,0 мм), которое подключали к источнику переменного тока, максимальный пик температуры составлял 210°C. Перед термическим воздействием в конъюнктивальную полость закапывали 0,5% раствор проксиметакаина; сразу после термического воздействия всем животным за нижнее веко закладывали мазь 0,3% офлоксацин («Флоксал»).

Следует отметить, что данная модель в отличие от химического повреждения роговицы позволяет в последующем исключить вероятность нейтрализации пептидов агрессивным химическим агентом.

Животным с моделью васкуляризированного ожогового бельма роговицы выполняли инстилляции препарата пептидов в конъюнктивальную полость. Режим инстилляций: с первых по 14-е сутки - шестикратно в течение часа (интервал между закапываниями - 10 минут), с 14-х по 30-е сутки - четырехкратно в течение часа (интервал между закапываниями - 20 минут).

Для получения препарата пептидов выделяли стволовые клетки костного мозга из тазовой кости. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга выделяли на градиенте плотности с использованием стандартного раствора Lympholyte-H (Cedarlane, Канада). Суспензию мононуклеарных клеток высевали на чашки Петри и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячий сыворотки. После получения клеточного монослоя проводили полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяли с лизатом МСК. Культуру клеток разрушали, используя физико-химические методы (два цикла замораживания-оттаивания). Готовый препарат пептидов представлял собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.

Для подтверждения, что используемые клетки обладают свойствами МСК, были проведены их остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировки по стандартным методикам [Yagi Н., Soto-Gutierrez А., Navarro-Alvarez N., Nahmias Y., Goldwasser Y. et al. // Molecular Therapy, 2010, 18(10), Р. 1857-64]. Остеогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты и 10 нМ β-глицерофосфата) была подтверждена наличием щелочной фосфатазы в культуре клеток с использованием стандартных реактивов (Sigma-Aldrich, USA). Хондрогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкМ дексаметазона и 0,1 мкг/мл TGF-β) была подтверждена с использованием окраски альциановым голубым. Адипогенная дифференцировка (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мкМ дексаметазон, 10 мкг/мл инсулина, и 100 мкг/мл IBMX) была подтверждена окрашиванием с использованием Oil Red-O.

В контрольной группе (16 кроликов, 16 левых глаз) выполняли инстилляции 0,5% раствора моксифлоксацина («Вигамокс») и закладывание геля «Солкосерил» за нижнее веко четыре раза в день (в 08:00, 12:00, 16:00, 20:00) в течение 30 дней.

Состояние животных в группах оценивали в течение первых 14-и дней ежедневно, последующие наблюдения проводили 3 раза в неделю (каждые 2 дня). Клинически оценивали следующие признаки: наличие или отсутствие отделяемого, характер конъюнктивальной инъекции и ее выраженность, площадь дефекта роговицы (определялась после окрашивания 0,1% раствором флюоресцеина натрия), интенсивность помутнения роговицы.

Сроки клинического наблюдения составили 1-е, 3-е, 7-е, 14-е, 30-е, 60-е сутки. В сроки 1-е, 7-е, 30-е сутки по одному животному в каждой группе выводили из эксперимента для проведения морфологического исследования роговицы. Ткань роговицы фиксировали в нейтральном забуференном 10% формалине и готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм.

Данные клинических наблюдений. В срок 1-е сутки в опытной и контрольной группах сразу после нанесения ожога оценить состояние роговицы и глублежащих сред не представлялось возможным из-за наличия выраженного блефароспазма.

На 3-и сутки у животных опытной группы начала развиваться эпителизация по краю дефекта (у животных контрольной группы она не наблюдалась). По данным инструментальных обследований, толщина роговицы превышала исходные значения на 10-30 нМ в зависимости от отдаленности от поврежденного участка.

На 5-е сутки в опытной группе эпителизация завершилась полностью, а в контрольной группе после окрашивания роговицы флуоресцеином выявлялся окончатый дефект в центре ожога.

На 7-е сутки эпителизация в обеих группах была завершена. Прозрачность роговицы в опытной группе восстановилась практически полностью. В контрольной группе участок роговицы, на который наносился термический ожог, был непрозрачен, по лимбу наблюдалось разрастание сосудистой сети и гиперпигментация в пораженной области.

На 14-е сутки состояние глаз в опытной группе по результатам обследований приблизилось к исходному состоянию (до нанесения ожога). В контрольной группе наблюдалось прорастание новообразованных сосудов в толщу роговицы с сохраняющимся помутнением - васкуляризированное бельмо роговицы.

На 30-е сутки в опытной группе последствий термического ожога роговицы не наблюдалось. В контрольной группе калибр проросших в роговицу сосудов уменьшился, но они все еще были полнокровными. Прозрачность роговицы значительно увеличилась, однако не достигла исходных значений.

К 60-м суткам наблюдения в опытной группе никаких последствий ожоговой травмы роговицы не наблюдалось, в то время как в контрольной группе сохранялось стойкое стромальное помутнение роговицы и неоваскулярная сосудистая сеть (меньшего диаметра по сравнению с 30-и сутками).

Данные гистологического исследования. Опытная группа. 3-и сутки. Эпителий сохранный. В вертикальных меридианах стромы и эпителия признаки деструкции. Толщина роговицы увеличена. Тенденция к отслойке десцеметовой оболочки с эндотелием на фоне повышенной компактности стромы, но меньшая клеточность передних слоев стромы.

7-е сутки. Отмечается перинуклеарный отек базального эпителия роговицы, боуменова мембрана, строма, десцеметова мембрана - без видимых изменений; эндотелий рыхлый. Эпителий сохранен, боуменова мембрана дифференцируется без видимых изменений, строма без выраженных изменений, десцеметова мембрана несколько утолщена, эндотелий рыхлый.

30-е сутки. Структура роговицы практически восстановлена за исключением стромы, которая изменена в виде уплотнения волокон, эндотелий рыхлый.

Контрольная группа. 3-и сутки. Эпителий сохранный. В вертикальных меридианах стромы и эпителия признаки деструкции. Тенденция к отслойке десцеметовой оболочки с эндотелием на фоне повышенной компактности стромы.

7-е сутки. Отмечается перинуклеарный отек базального эпителия роговицы, боуменова мембрана, строма, десцеметова мембрана - без видимых изменений; эндотелий рыхлый. Эпителий эрозирован, с некрозами и очаговой воспалительной инфильтрацией, боуменова мембрана дифференцируется без видимых изменений, строма без выраженных изменений, десцеметова мембрана несколько утолщена, эндотелий рыхлый.

30-е сутки. Эпителий восстановлен, строма деструктирована, поддержание отека стромы, выявляются новообразованные сосуды в просвете стромы.

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает восстановление прозрачности роговицы, достижение полного и стойкого регресса неоваскуляризации роговицы, неинвазивность лечебного воздействия.

Работа выполнена при поддержке РФФИ №15-04-04009 «Исследование эндотелий-протекторных свойств белков, секретируемых стволовыми клетками костного мозга и ферментов-антиоксидантов, при лечении ожога роговицы».