СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-A-ГЛИЦЕРОФОСФОРИЛХОЛИНА ФАРМАКОПЕЙНОГО КАЧЕСТВА

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к методам выделения целевого компонента, обладающего фармацевтической активностью, из продуктов переработки растительного сырья.

Целью изобретения является способ получения L-α-глицерофосфорилхолина со степенью чистоты, соответствующей фармакопейным требованиям (международное непатентованное название активной фармацевтической субстанции - холина альфосцерат гидрат).

Из уровня техники известны следующие решения

Известен способ получения L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина из соевого или яичного лецитина, включающий алкоголиз лецитина, последующее формирование нерастворимого осадка в виде комплекса с солями цинка, отделение осадка, разрушение комплекса органическими основаниями, такими, как пиридин, лутидин и т.п., и финальную очистку целевого продукта на ионообменных смолах (Европейский патент №0217765, "Process for the preparation of L-α-glycerylphosphorylcholine, L-α-glycerylphosphorylethanolamine from crude and/or deoleated lecithins", опубликован 16.08.1990).

Недостатками этого решения является применение токсичных солей цинка и органических оснований, затрудняющих очистку продукта до фармакопейного уровня, и наличие отходов, вызывающих повышенную нагрузку на окружающую среду.

Также известен способ получения L-α-глицерофосфорилхолина (Патент США №8658401 «Method for Preparing High Purity L-alpha-Glycerylphosphorylcholine», опубликован 25.02.2014), в котором лецитин подвергают ферментативному гидролизу с использованием фермента фосфолипазы, дальнейшая обработка включает обессоливание продукта на ионообменных смолах и финишную очистку от примесей на колонне с силикагелем.

Недостатками этого решения является использование для очистки силикагеля, обладающего невысокой емкостью по нагрузке, что вызывает увеличение размеров оборудования и повышенный расход растворителей, нуждающихся затем в регенерации. Кроме того, в методе не предусмотрены меры обеспечения микробиологической чистоты продукта и его апирогенности (отсутствия бактериальных эндотоксинов).

Наиболее близким аналогом предлагаемого решения является способ получения L-α-глицерофосфорилхолина, описанный в патенте США №5250719 «Process for the preparation of L-α-glycerylphosphorylcholine and of L-α-glycerylphosphorylethanolamine», опубликованном 05.10.1993, включающий нанесение на катионообменную смолу в Н⁺-форме в безводном растворителе спиртового экстракта переэтерифицированного лецитина, промывку смолы спиртом или водно-спиртовым раствором, выделение очищенной смеси L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина путем промывки смолы водой, разделение смеси на анионите в ОН^--форме с получением чистых L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина.

Недостатком прототипа является неудовлетворительная для фармакопейного качества чистота продукта, вызванная присутствием бактериальных эндотоксинов, продуктов разложения L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина, катализируемого катионитом, а также возможное микробиологическое загрязнение водных растворов сверх допустимых норм.

Техническим результатом предлагаемого решения является повышение качества продукта до уровня фармакопейного.

Указанный технический результат достигается за счет способа получения L-α-глицерофосфорилхолина, включающего сорбцию L-α-глицерофосфорилхолина из метанольного обезжиренного раствора L-α-глицерофосфорилхолина, полученного переэтерификацией лецитина, на катионите в среде безводного растворителя, последующее элюирование его с катионита обессоленной водой, обесцвечивание элюата активированным углем, финишную очистку от минеральных и органических солей на ионообменных смолах и концентрирование, при этом с целью достижения фармакопейного качества сорбцию и элюирование с катионита проводят при пониженной температуре, а перед концентрированием применяют фильтрацию через стерилизующий фильтр.

Температура процессов сорбции и элюирования с катионита поддерживается в интервале 0÷5°C за счет охлаждения потоков в теплообменнике холодильной машиной, либо другим методом.

С целью достижения микробиологической чистоты и одновременного удаления бактериальных эндотоксинов для фильтрации применяют стерилизующий фильтр с Z-потенциалом поверхности.

Повышение качества получаемого продукта до фармакопейного достигается за счет уменьшения разложения целевого продукта при очистке его на катионите при пониженной температуре, стерилизующей фильтрации раствора продукта через фильтр с рейтингом фильтрации 0,20÷0,22 мкм и заряженной поверхностью фильтра (так называемый фильтр с Z- или Zeta-потенциалом).

Разложение (гидролиз) L-α-глицерофосфорилхолина и L-α-глицерофосфорилэтаноламина на катионите в Н⁺-форме происходит из-за снижения величины рН (процесс происходит в кислой среде). В кислой среде, по литературным данным, процесс гидролиза идет в две стадии: на первой стадии происходит отщепление холина или этаноламина с образованием глицерофосфорной кислоты, на второй стадии проходит отщепление глицерина с образованием фосфорной кислоты (G. Shmidt, M.J. Bessman, S.J. Thannhauser. J.Biol. Chem. 1953, 203, 849-853).

Отщеплению холина или этаноламина предшествует изомеризация молекулы α-формы в β-форму через промежуточное циклическое соединение, что дает равновесную смесь α- и β- глицерофосфорных кислот (Lecithins: Sources, Manufacture & Uses (Ed: B.F. Szuhaj), AOCS monograph, Illinois 1989)

В статических условиях заявителем установлено влияние температуры на разложение L-α-глицерофосфорилхолина при контакте с катионитом в Н⁺-форме (см. Пример 1).

Пример 1

Суспензию из 100 мл 5% водного раствора L-α-глицерофосфорилхолина (GPC) и 100 мл влажного сильнокислотного макропористого катионита в Н⁺-форме перемешивают в колбе роторного испарителя, находящейся на водяной бане с температурой 40°C, периодически отбирая пробу жидкости для анализа на содержание GPC методом ВЭЖХ. Наблюдаемое снижение концентрации GPC с течением времени приведено в Таблице 1.

Аналогичную суспензию из 100 мл 5% водного раствора L-α-глицерофосфорилхолина (GPC) и 100 мл влажной влажного сильнокислотного макропористого катионита в Н⁺-форме перемешивают магнитной мешалкой в стеклянном закрытом стакане, находящемся в бане со льдом (температура реакционной смеси составляет 2°C), периодически отбирая пробу жидкости для анализа на содержание GPC методом ВЭЖХ. Наблюдаемое снижение концентрации GPC с течением времени приведено в Таблице 2.

Из данных таблиц 1 и 2 видно, что скорость разложения GPC, определяемая по убыли его концентрации в растворе, контактирующем с катионитом, в 6 раз ниже при температуре 2°C, нежели при температуре 40°C. Соответственно и скорость накопления примесей продуктов разложения, наиболее трудноудаляемой из которых является глицерин, существенно меньше при низких температурах.

Положительный технический эффект предлагаемого решения, а именно - очистка L-α-глицерофосфорилхолина на катионите при пониженной температуре в сочетании с фильтрацией получаемого продукта на фильтре с Z-потенциалом виден из примеров 2 и 3.

Пример 2

Метанольный раствор, полученный при переэтерификации лецитина в присутствии метилата натрия с последующим отделением жирных кислот, содержащий 3.19 г GPC при его концентрации в растворе около 11%, прокачивают перистальтическим насосом через колонку с 85 см³ макропористым сильнокислотным катионитом в Н⁺-форме, уравновешенной метанолом, при температуре +23°C. Отмывают колонку метанолом температурой 22÷23°C. После отмывки метанолом пропускают через колонку дистиллированную воду температурой 22÷23°C, собирают фракции, содержащие элюированный L-α-глицерофосфорилхолин. По результатам анализа в полученном элюате содержится 2.49 г GPC, то есть выход составляет 78%.

Полученные фракции обесцвечивают перемешиванием с активированным углем, отфильтровывают на фильтре с пористостью 40 мкм, фильтрат прокачивают перистальтическим насосом последовательно через колонки со слабоосновным анионитом в форме свободного основания, сильноосновным анионитом в ОН^--форме и слабокислотным катионитом в Н⁺-форме. Полученный обессоленный и обесцвеченный раствор концентрируют в вакуумном роторном испарителе роторного испарителя до концентрации 84% по сухому веществу. Получают продукт, в котором содержание примесей 5%, что превышает норму. Продукт также содержит сверхнормативное количество микроорганизмов и эндотоксинов (см. Таблицу 3).

Пример 3

Метанольный раствор, полученный при переэтерификации лецитина в присутствии метилата натрия с последующим отделением жирных кислот, содержащий 4.5 кг GPC при его концентрации в растворе около 12%, прокачивают плунжерным насосом после охлаждения в теплообменнике холодильной машины через колонну со 120 л макропористого сильнокислотного катионита в Н⁺-форме, уравновешенной метанолом, при температуре +5°C. Отмывают колонку метанолом температурой +5°C. После отмывки метанолом прокачивают через колонну охлажденную обессоленную воду температурой 1÷5°C, собирают фракции, содержащие элюированный L-α-глицерофосфорилхолин. По результатам анализа в полученном элюате содержится 4.43 кг GPC, то есть выход составляет 94%.

Полученные фракции обесцвечивают перемешиванием с активированным углем, отфильтровывают на нутч-фильтре с фильтротканью. Фильтрат прокачивают плунжерным насосом последовательно через колонки со слабоосновным анионитом в форме свободного основания, сильноосновным анионитом в ОН^--форме и слабокислотным катионитом в Н⁺-форме. Полученный обессоленный и обесцвеченный раствор фильтруют через капсульный фильтр с с рейтингом фильтрации 0,22 мкм, в котором фильтрующий материал (например, Nylon-66) несет поверхностный Z-потенциал. Фильтрат концентрируют в вакуумном роторном испарителе роторного испарителя до концентрации 84,5% по сухому веществу. Получают продукт, в котором содержание примесей менее 4%,

Продукт также соответствует фармакопейным требованиям по микробиологической чистоте и содержанию бактериальных эндотоксинов (см. Таблицу 3).