Способ стратификации риска поражения сердечно-сосудистой системы у пациентов с хронической болезнью почек

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, кардиологии.

В сыворотке крови пациентов с хронической болезнью почек, определяется уровень фибропластического фактора роста-23, посредством иммуноферментого анализа (ИФА). Повышение уровня фибропластического фактора роста-23 свидетельствует о высоком риске поражения сердечно-сосудистой системы, повышает точность диагностики риска сердечно-сосудистых катастроф в перспективе.

Рост смертности пациентов на программном гемодиализе по причине сердечно-сосудистых заболеваний диктует необходимость поиска доступных и надежных критериев стратификации риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов на до диализных стадиях хронической болезни почек. К ним относятся: острые нарушения мозгового кровообращения, инфаркт миокарда, обострение хронической сердечной недостаточности. В основе всех кардиоваскулярных катастроф лежат органические изменения сердца и сосудов, в частности фиброз кардиомиоцитов, повышение их жесткости и облитерация стенки артерий с уменьшением их просвета. В сущности, главными органами-мишенями у пациентов на диализе являются миокард и сосуды. При этом уровень ремоделирования сосудов артериального русла - интегральный фактор, определяющий сердечно-сосудистые риски и прогноз для жизни пациентов с терминальной стадией хронической болезни почек (ХБП) [1].

Таким образом, поиск показателей состояния сердечно-сосудистой системы пациентов с ранними стадиями хронической болезни почек является поиском предикторов кардиоваскулярных осложнений, определяющих смертность на диализе.

Доказано, что наряду с известными факторами поражения сердечно-сосудистой системы, такими как артериальная гипертензия, уремическая интоксикация, анемия, нарушение кислотно-щелочного состояния, важнейшую роль у пациентов на программном гемодиализе играют нарушения костно-минерального обмена. Доказана роль вторичного гиперпаратиреоза, гиперфосфатемии в развитии ренальной остеодистрофии и внескелетной кальцификации в развитии патофизиологических изменений сердечно-сосудистой системы. Позднее были созданы препараты, корригировавшие уровни не только паратгормона, но и кальция, фосфора как факторов кальцифилаксии. К ним относятся кальциймиметики (цинакальцет), фосфатсвязывающие препараты и витамин Д. Активной терапевтической коррекции подлежат систолическое и диастолическое артериальное давление, уровень гемоглобина. Однако несмотря на стабилизацию всех этих показателей у многих пациентов на диализе имеются органические изменения миокарда, аорты и других резистивных сосудов. Следовательно, есть необходимость поиска тех факторов, купирование которых препятствовало бы ремоделированию сердечно-сосудистой системы в условиях компенсации уже известных факторов риска.

Известен способ прогнозирования исхода заболевания у больных пожилого и старческого возраста посредством определения в сыворотке крови больных содержания тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ 1 типа. Данный способ включает в себя выявление уровня тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 типа в сыворотке крови и сердечно-сосудистого сопряжения с последующим определением риска развития неблагоприятных сердечно-сосудистых событий (заявка: 2007147240/15, 21.12.2007 г., авторы: Соломахина Н.И., Щекочихин Д.Ю. RU 2353933 С1).

Недостатками данного способа перед заявляемым методом являются:

несостоятельность тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ - 1 типа, как маркера сосудистого ремоделирования и васкулярных катастроф (транзиторные ишемические атаки, инсульт ишемический и геморрагический, перемежающаяся хромота),

более поздняя диагностика высокого риска острого поражения миокарда, когда уже известно о ремоделирующих процессах в сердце, то есть подтвержден факт наличия ХСН.

Наиболее близким к заявляемому методу является способ диагностики ХСН с помощью количественного определения в крови натрийуретических пропептидов посредством ИФА (Российские национальные рекомендации ВНОК и ОССН по диагностике и лечению ХСН (второй пересмотр), Москва, 2007 г.). Нормальный уровень N-терминального неактивного фрагмента мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) в европейской популяции составляет 0,5-30 пг/мл; концентрация 125 пг/мл является пороговой, при превышении которой прогнозируется наличие ХСН. Данный способ основан на определении в плазме крови NT-proBNP посредством ИФА. Общими для прототипа и заявляемого метода являются следующие свойства:

- определение исследуемых маркеров посредством ИФА;

- корреляция в отношении скорого вовлечения миокарда в патофизиологический континуум при ХБП;

- повышение титра NT-proBNP и FGF-23 до появления грубых органических изменений со стороны миокарда.

Корреляция со степенью систолической дисфункции, вероятностью обострения ХСН, а также степенью риска смерти в ближайшие десять лет от кардиоваскулярной патологии.

Недостатками прототипа, устраняемыми заявляемым изобретением, являются: более позднее появление высокого титра NT-proBNP в сравнении с заявляемым методом.

Титр NT-proBNP - это показатель, отражающий риск и выраженность повреждения и гибели кардиомиоцитов, то есть вероятность возникновения острой сердечной недостаточности. Однако высокий уровень мНУП в крови никак не отражает вовлеченность сосудов в патофизиологический континуум и, как следствие, вероятность сосудистой катастрофы (транзиторные ишемические атаки, инсульт ишемический и геморрагический, перемежающаяся хромота).

Большая лабильность уровня NT-proBNP в крови даже в течение одного часа, так как период жизни самой метаболически стабильной части N - терминального фрагмента мНУП составляет 120 минут, что в значительно меньше, чем у FGF-23. В разные периоды суток титр мНУП может быть разных значений. Следовательно, данный прототип обладает худшей достоверностью в сравнении с заявляемым методом ввиду меньшей стабильности. Сущность заявляемого способа: осуществление изобретения достигается следующим образом. Для получения и подготовки материала для исследования производят забор крови пациентов в количестве не менее 5 мл. Далее образцы крови сворачиваются в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С, затем центрифугируются 20 минут при скорости в 1000 оборотов. Для хранения образцы сыворотки аликворируют немедленно после получения и хранятся замороженными при -20°С. Образцы, которые будут протестированы в течение 5 дней, могут храниться при 2-8°С. Перед выполнением анализа образцы и все компоненты набора должны медленно достичь комнатной температуры.

Стандарты и образцы вносят в соответствующие лунки микропланшета, покрытые специфическими антителами к FGF-23, конъюгированными с биотином. На следующем этапе в лунки вносят авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), и инкубируют в течение необходимого времени. Затем в лунки вносят субстратный раствор. Изменение окрашивания в лунках, обусловленное связыванием антител, конъюгированных с биотином, и авидина, конъюгированного с ферментом, будет наблюдаться только в лунках, содержащих FGF-23. Ферментная реакция останавливается добавлением серной кислоты, а интенсивность развившегося окрашивания измеряется с помощью микропланшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм ± 10 нм. Далее необходимо построение калибровочной кривой на логарифмической бумаге путем откладывания полученного среднего значения оптической плотности (ОП) каждого стандарта по оси X, против соответствующей концентрации каждого стандарта по оси Y, и проведения оптимальной кривой через полученные точки. Для обработки данных рекомендуется использовать соответствующее программное обеспечение. Концентрация FGF-23 в образцах определяется сравнением полученной оптической плотности образцов с построенной калибровочной кривой (Фиг. 1).

Диапазон измеряемых концентраций составляет от 15,6 до 1000 пг/мл. Минимально определяемая концентрация FGF-23 равна 5,5 пг/мл. Референсными значениями нормального уровня FGF-23 являются 10-79 пг/мл. Интерпретация результатов:

FGF-23 от 80 до 150 пг/мл - низкий риск развития неблагоприятных кардиоваскулярных исходов в ближайшие пять лет.

FGF-23 от 150 до 250 пг/мл - умеренный риск неблагоприятных кардиоваскулярных исходов в ближайшие пять лет.

FGF-23 от 250 до 500 пг/мл - высокий риск неблагоприятных кардиоваскулярных исходов в ближайшие пять лет.

FGF-23 от 500 и более пг/мл - крайне высокий риск неблагоприятных кардиоваскулярных исходов в ближайшие пять лет.

Под неблагоприятными кардиоваскулярными исходами понимаются: различные варианты ишемической болезни сердца; внезапная сердечная смерть, стенокардии, хроническая сердечная недостаточность (как систолическая, так и диастолическая), острая сердечная недостаточность (право- и левожелудочковая), острые нарушения мозгового кровообращения (как по ишемическому, так и по геморрагическому типу), облитерирующий атеросклероз артерий нижних конечностей.

Поражение сердечно-сосудистой системы является основной причиной смерти больных, находящихся на программном гемодиализе. При этом частота повреждения сердца при хронической почечной недостаточности значительно превышает таковую в общей популяции, а характер кардиоваскулярных осложнений разнообразный и включает как систолическую, так и диастолическую дисфункции миокарда левого желудочка (ЛЖ), различные варианты гипертрофии ЛЖ и патологические изменения сосудистой стенки. Ключевую роль в прогрессировании кардиоваскулярной патологии играют нарушения костно-минерального обмена. Патогенетический континуум костно-минеральных нарушений при ХБП сложен и многофакториален. Основными элементами, влияющими на костный метаболизм, являются: гормоны эйкозаноиды- паратгормон, фибропластический фактор роста-23, остеопротегерин, RANKL, кальцитриол, плазменные ионы - кальций и фосфат. Костный обмен контролируется в основном гуморальными факторами и уровень важности каждого из них в генезе ренальной остеодистрофии по сей день является поводом для обсуждений. Вместе с тем фактор роста фибробласов-23 является одним из наиболее ранних предикторов костно-минеральных и ассоциированных с ними кардиоваскулярных нарушений.

Фактор роста фибробластов-23 (fibroblast growth factor-23, FGF-23) - белок-фосфатонин, состоящий из 251 аминокислоты (молекулярная масса 32 kDa), секретируемый остеобластами. Молекулярная структура представлена аминоконцевой последовательностью сигнального пептида (остатки 1-24), центральной последовательностью (остатки 25-180) и карбоксиконцевой последовательностью (остатки 181-251). FGF-23 проявляет свои биологические эффекты через активацию FGF1c-рецепторов. FGF1c-рецепторы, связываясь с кофактором Клото (англ. Klotho), становятся в 1000 раз более чувствительными для взаимодействия с FGF-23, чем другие FGF-рецепторы или Клото-белок отдельно [2, 4, 5, 6]. Белок Клото - это 130 kDa трансмембранный протеин, бета-глюкорозонидаза. Экспрессируется главным образом в почках и паращитовидных железах - двух наиболее важных органах, участвующих в регуляции Са/Р-обмена. Было обнаружено, что уровень белка Клото в организме с возрастом существенно снижается. Затем была доказана его роль в регуляции механизмов старения. Клото-белок связывается с FGF1c-рецептором и С-терминальным концом FGF-23, приводя к конвертации канонического FGF в высокоаффинный специфический. Клото как ко-рецептор FGF-23 критичен для реализации биологического действия FGF-23, но также обладает рядом собственных эффектов, независимых от него. В почках FGF-23 индуцирует фосфатурию, супрессируя экспрессию натрий-фосфорного котранспортера типа IIа и IIс в проксимальных канальцах. Это интегральные белки на мембранах клеток тубулярного эпителия. Под действием FGF-23 они уходят внутрь клеток, что влечет за собой снижение реабсорбции фосфата в канальцах нефронов. Кроме того, FGF-23 супрессирует образование кальцитриола, ингибируя 1-альфа-гидроксилазу, которая конвертирует 25-гидроксивитамин D в 1,25 дигидроксивитамин D и стимулирует образование 24-гидроксилазы, которая конвертирует 1,25 дигидроксивитамин D в неактивные метаболиты в проксимальных канальцах почек. FGF-23 также ингибирует экспрессию интестинального натрий-фосфорного транспортера клеток эпителия кишечной стенки, уменьшая всасывание фосфора в кишечнике [4, 5]. Механизм снижения уровня фосфора в крови представлен на Фиг. 2.

Основным фактором, потенцирующим высвобождение фибропластического фактора роста-23, является гиперфосфатемия. Определяется четкая взаимосвязь уровня FGF-23 со скоростью клубочковой фильтрации, так как повышение FGF-23 уже на ранних стадиях ХПН направлено на поддержание нейтрального баланса фосфора за счет увеличения экскреции фосфата с мочой, уменьшения гастроинтестинальной абсорбции фосфора и супрессии продукции кальцитриола. Такого компенсаторного механизма бывает достаточно, чтобы в течение продолжительного времени поддерживать оптимальный уровень фосфата крови. Тем не менее прогрессирующая потеря почечной паренхимы приводит к неуклонно прогрессирующей гиперфосфатемии. А это, в свою очередь, способствует увеличению титра FGF-23. Также в склерозированной паренхиме почки снижается синтез и ко-фактора Клото, необходимого для преобразования канонического фактора роста фибробластов-23 в высокоафинный специфический и реализации его физиологических эффектов. У пациентов с поздними стадиями ХБП титр FGF-23 повышается в десятки раз. При этом точкой приложения его становится уже сосудистая медия и миокард. Доказано, что высокий уровень FGF-23 прямо коррелирует со смертностью диализных пациентов вне зависимости от уровня фосфата, артериального давления. В работе Christian Faul (2000 год) с большим авторским коллективом было показано, что высокий титр FGF-23 может прямо приводить к развитию гипертрофии и фиброзу миокарда. Исследование включало несколько этапов, на первом этапе было обследовано более 3000 пациентов с почечной недостаточностью, у которых определяли базовый уровень FGF-23 с последующим систематическим эхокардиографическим (ЭхоКГ) контролем. Гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ) была выявлена у 52% пациентов. Каждое увеличение на 1 логарифмическую единицу FGF-23 (lnFGF23) ассоциировалось с повышением индекса массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ) на 1,5 г/м² (р<0,001), после коррекции на другие факторы риска. Затем исследователи изучили риск появления ГЛЖ у 411 пациентов, которые имели нормальные ЭхоКГ-показатели, через 2,9±0,5 года. У 84 пациентов (20%) впервые была выявлена ГЛЖ, причем у нормотензивных пациентов каждое повышение на 1 ед. lnFGF23 приводило к учащению возникновения ГЛЖ de novo в 4,4 раза (р=0,001), а высокое содержание FGF-23 обуславливало 7-кратное увеличение частоты ГЛЖ независимо от наличия или отсутствия артериальной гипертензии.

Иммуногистохимический и морфометрический анализы кардиомиоцитов в условиях высокого титра FGF-23 показали значительное увеличение площади их клеточной поверхности, а также повышение уровня белка альфа-актинина, свидетельствующего об увеличении саркомеров. Были обнаружены повышение экспрессии эмбриональных бета-миозиновых тяжелых цепей (МТЦ) и одновременная депрессия зрелых альфа-миозиновых тяжелых цепей. Такое переключение изоформ МТЦ со зрелых на эмбриональные указывает на реактивацию эмбриональной генной программы, которая ассоциируется с гипертрофией и ремоделированием сердечной мышцы. FGF-23 также уменьшает экспрессию предсердного и мозгового натрийуретических пептидов (НУП), маркеров ГЛЖ, что напрямую может привести к диагностическим ошибкам, так как титры НУП в условиях избытка FGF-23 могут быть в субнормальных значениях, несоответствующих реальному состоянию миокарда. FGF-23 уменьшает экспрессию средней цепочки ацил-КоА дегидрогеназы (СЦАГ), энзима, регулирующего оксидацию жирных кислот. Гипертрофированные кардиомиоциты переключаются от энергии с жирных кислот на углеводы, что является маркером уменьшения экспрессии СЦАГ. Однако ишемические процессы в миокарде не позволяют полноценно осуществлять как аэробный гликолиз, так и бета-окисление жирных кислот, что оставляет миокард без жизненно необходимого органического субстрата. FGF-23 вызывает ГЛЖ независимо от ко-рецептора Клото, который экспрессируется преимущественно в почках и паращитовидных железах и отсутствует в кардиомиоцитах, посредством воздействия на FGF4-рецепторы кардиомиоцитов. Был показан прогипертрофический эффект FGF-23 на кардиомиоциты. Также была доказана возможность воздействия FGF-23 на кардиомиоциты через FGF4-рецепторы кардиомиоцитов независимо от белка Клото [6, 7, 8].

Доказано, что патофизиологические изменения резистивных сосудов также ассоциированы с воздействием FGF-23 на их мышечный слой. В результате происходит фенотипическая трансформация гладкомышечных клеток, преобразующихся в остеобластоподобные клетки, что влечет за собой внескелетную минерализацию и кальциноз медиального слоя артерий. Тем самым теряются эластические свойства артериальной стенки [9]. Снижение демпфирующей функции артериальной системы и прежде всего аорты приводит к тому, что кинетическая энергия потока крови из левого желудочка в аорту не переходит в потенциальную энергию растягивающейся аорты, а реализуется в повышении общего периферического сосудистого сопротивления. Как следствие происходит увеличение посленагрузки на миокард ЛЖ, что способствует его гипертрофии, диастолической дисфункции, повышению потребности в кислороде и как следствие его ишемии, фиброзу и систолической дисфункции с выраженным снижением фракции выброса, развитием тяжелой сердечной недостаточности. Giorgio Coen и соавт. (2009 г.) показали обратную зависимость между уровнями фетуина А и FGF-23. Между тем ранее было продемонстрировано, что фетуин А, синтезируемый остеобластами, способствует предотвращению кальцификации сосудов. Таким образом, техническим результатом заявляемого изобретения является определение риска скорого поражения сердечно-сосудистой системы у пациентов с терминальной стадией ХБП. Выявленный повышенный уровень FGF-23 от умеренных до крайне высоких нетестируемых цифр говорит, во-первых, о высоком риске ремоделирующих процессов в сердечно-сосудистой системе при исходном отсутствии ЭХО-кг признаков гипертрофии миокарда, нормальной скорости пульсовой волны аорты, компенсации со стороны других факторов риска таких как: артериальная гипертензия, уремия, гиперпаратиреоз даже при отсутствии повышения таких маркеров неблагоприятных кардиоваскулярных исходов как высокий уровень мНУП, эндотелина, гиперфосфатемия. Во-вторых, повышение FGF-23 говорит о необходимости проведения кардиопротективной терапии, целью которой служит и коррекция уровня самого FGF-23. В отсутствие селективно ингибирующих данный медиатор препаратов предполагается расширение показаний к назначению цинакальцета, который посредством влияния на фосфат-регулирующую эндопептидазу остеобластов снижает уровень фибропластического фактора роста-23. Такая ранняя диагностика высокого риска отдаленных органических изменений сердечно-сосудистой системы способствует раннему воздействию на патогенетический континуум ХБП и как следствие задержке или даже полной остановке прогрессирования органических изменений в сердце и сосудах, замедлению развития гипертрофии миокарда ЛЖ с его тоногенной дилатацией, кальциноза артерий со снижением их демпфирующей функции. Это, в свою очередь, увеличит длительность жизни и улучшит прогноз для пациентов как с ХБП всех стадий, так и пациентов на программном гемодилизе, что и является долгосрочной целью лечебно-диагностических мероприятий.

Список используемых сокращений:

ГЛЖ - гипертрофия левого желудочка

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИММЛЖ - индекс массы миокарда левого желудочка

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛЖ - левый желудочек

мНУП - мозговой натрийуретический пептид

МТЦ - миозионовые тяжелые цепи

НУП - натрийуретический пептид

ОП - оптическая плотность

СЦАГ - средняя цепь ацил Ко-А дегидрогеназы

ХБП - хроническая болезнь почек

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

цГМФ - циклический гуанозин монофосфат

ЭХО-кг - эхокардиография

FGF-23 - фибропластический фактор роста-23

HPR - коньюгированная пероксидаза хрена

LnFGF23 - логарифмическая единица FGF-23

NT-proBNP - N-терминальный неактивный фрагмент мозгового натрийуретического пептида

RANKL - рецептор активатора нуклеарного фактора каппа Б

Список литературы

1. Дзгоева Ф.У. Остеопротегерин и 23-й фактор роста фибробластов (FGF-23) в развитии сердечно-сосудистых осложнений при хронической болезни почек / Ф.У. Дзгоева, Т.М. Гатагонова, Т.Л. Бестаева, М.Ю. Сопоев и др. // Терапевтический архив. - 2014. - №6. - С. 63-69.

2. Дзгоева Ф.У. Ремоделирование миокарда у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на лечении программным гемодиализом / Ф.У. Дзгоева, З.К. Кадзаева, Н.В. Калоева и др. // Сборник научных трудов Северо-Осетинского отделения Академии Наук Высшей Школы Российской Федерации. Владикавказ. - 2006. - №4. - С. 253-256.

3. Добронравов В.А. Динамика артериального давления и его суточного профиля у пациентов на стандартном программном гемодиализе: данные двухсуточного мониторирования / В.А. Добронравов // Нефрология. - 2009. - Т. 13. - №2. - С. 42-49.

4. Добронравов В.А. Современный взгляд на патофизиологию вторичного гиперпаратиреоза: роль фактора роста фибробластов 23 и Klotho / В.А. Добронравов // Нефрология. - 2011. - Т. 15. - №4. - С. 11-20.

5. Nasrallah М.М., El-Shehaby A.R., Salem М.М. et al. Fibroblast growth factor-23 (FGF-23) is independently correlated to aortic calcification in haemodialysis patients // Nephrol Dial Transplant. 2010; 25 (8): 2679-2685.

6. Ix, J.H. Fibroblast growght factor-23 and early decrements in kidney function: the Heart and Soul Study / M.G., Shlipak, C.L. Wassel et al // Nephrol Dial Transplant. - 2010. - №25. - P. 993-997.

7. Razzaque M.S. Premature aging-like phenotype in fibroblast growth factor 23 null mice is a vitamin D-mediated process / M.S. Razzaque, D. Sitara, T. Taguchi et al. // FASEB J. - 2006. - Vol. 20. - №6. - P. 720-722.

8. Wolf M. Forging forward with 10 burning questions on FGF23 in kidney disease / M. Wolf // J Am Soc Nephol. - 2010. - Vol. 21. - P. 1427-1435.

9. Gutierrez O.M. Fibroblast growght factor-23 and left ventricular hypertrophy in chronic kidney disease / O.M. Gutierrez, J.L. Janussi, T. Isakova et al. // Circulation. - 2009. - №119. - P. 2445-2552.