Результат интеллектуальной деятельности: Способ оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и животноводству и может быть использовано для оценки плодовитости свиней пород ландрас и крупная белая путем определения генотипов по SNP, влияющих на репродуктивные функции организма.

Большой научный и практический интерес приобретает разработка методов, позволяющих оценивать продуктивность животных не только по фенотипическому проявлению признаков, но и непосредственно на генетическом уровне. К числу таких методов относится тестирование однонуклеотидных замен (SNP тестирование), которые расположены в генах, имеющих влияния на биохимические и физиологические процессы в организме. Ассоциативные связи между генотипами SNP и продуктивными качествами свиней могут быть использованы в качестве генетических маркеров при отборе и подборе животных.

Для материнских пород свиней (крупная белая порода, ландрас), используемых на первом этапе гибридизации, главным критерием отбора является плодовитость (количество поросят при рождении и многоплодие). Данные признаки отличаются большой разницей между максимальным и минимальным числом полученного потомства на одну матку в единицу времени и имеют низкий коэффициент наследуемости. Для оценки плодовитости маток по количеству и качеству потомства необходимо уделять особое внимание генетическим факторам, влияющим на репродуктивные функции организма.

Известен способ комплексной оценки продуктивных качеств свиноматок (RU 2340178 С2, 26.05.2006), который позволяет оценивать животного по индексу, учитывающему многоплодие свиноматок, молочность, количество поросят при отъеме и массу гнезда при отъеме поросят.

Однако данный метод позволяет учитывать только собственную продуктивность оцениваемого животного, а т.к. указанные признаки характеризуются низкой наследуемостью, то рассматриваемый метод не позволяет отобрать животных, способных стойко передавать данные качества потомству.

Известен способ оценки воспроизводительной продуктивности свиней на основе SNP тестирования гена ESR (US 5550024 А), но низкий уровень полиморфизма (очень низкая частота аллеля В и отсутствие генотипа ВВ) в породах ландрас, дюрок и пьетрен позволяет применять его только для оценки продуктивности свиней крупной белой породы.

Существует способ оценки воспроизводительных качеств свиней на основе аллельных вариантов гена PRLR (US 7081335 В2), однако отсутствие универсального генотипа, ассоциированного с высокими воспроизводительными качествами, затрудняет использование его в качестве генетического маркера в селекционных программах (по данным Barreras-Serrano A. et al. (2009), N. et al. (2009), желательным генотипом для воспроизводительных качеств является ВВ, но результаты исследований Vincent A.L. et al. (1998), Liu Qing-yu et al. (2012) показали, что в качестве желательного был установлен генотип АА).

Цель изобретения - создание эффективного способа оценки плодовитости (количество поросят при рождении и многоплодие) свиней пород ландрас и крупная белая на основе SNP тестирования, позволяющего отбирать животных, генетически предрасположенных к высокой плодовитости.

Цель достигается путем определения генетического потенциала плодовитости (количество поросят при рождении и многоплодие) свиней на основе тестирования SNP (rs3463076786 : C>T), расположенного в 3 экзоне гена LIF (фактора, ингибирующего лейкемию), методом ПЦР-ПДРФ.

Фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), является полифункциональным цитокином и осуществляет важные биологические функции. Он влияет на различные эндокринные ткани и типы клеток и играет важную роль в процессе эмбриогенеза (стимулирует пролиферацию клеток внутренней клеточной массы бластоцист и поддерживает их плюрипотентность, оказывает влияние на развитие как самого эмбриона, так и производных трофобласта, в частности плаценты). LIF оказывает влияние на выживаемость клетки, что имеет особенное значение в процессе имплантации эмбриона. Свою регулирующую функцию указанный цитокин начинает с развития гамет и заканчивает наступлением беременности. Механизм своего действия LIF осуществляет путем связывания с двумя рецепторами: лейкемия-ингибирующий специфический рецептор (LIF-SR), связь с которым обеспечивает функции LIF, и мембранный рецептор gp130, который является рецептором для родственных ему цитокинов IL-6, IL-11, онкостатина-М и др. Потенциальными индукторами синтеза LIF являются интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF). Ген LIF у свиней локализован в хромосоме 14q21-q22 в пределах доверительного интервала QTL, связанного с количеством поросят при рождении и многоплодием. Он охватывает около 6,3 кб и состоит из пяти экзонов, в том числе трех альтернативных экзонов (1D, 1М, 1Т). Наиболее часто представлен как транскрипт LIF-D_M РНК, который имеет размеры 3,9 т.п.н. Полученный первичный пептид состоит из 202 аминокислот. SNP (rs3463076786 : C>T) гена LIF установлен в 3 экзоне, который может быть определен методом ПЦР-ПДРФ.

Способ осуществляется следующим образом. По результатам молекулярно-генетических тестов (SNP тестирования), проводимых методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ), определяют аллельные варианты и генотипы SNP (rs3463076786 : C>T) гена LIF. Для этого выделяют ДНК из волосяных луковиц животного с применением набора реагентов DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб») или любым другим стандартным методом. Возможно использование других тканей или клеток животного (кровь, сперма и др.).

Проводят амплификацию интересующего фрагмента (407 п.н.) гена LIF с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'-GGGAACAAGGTGGTGATGG-3' в следующем режиме: предварительная денатурация при 94°С - 4 мин, 35 циклов: 94°С - 30 с, 58°С - 60 с, 72°С - 30 с; заключительный синтез при 72°С - 7 мин.

Затем проводят рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF эндонуклеазой рестрикции DraIII. При наличии сайта рестрикции образуются два фрагмента длиной 266- и 144 н.п., что соответствует аллелю В, при отсутствии сайта длина фрагмента остается без изменения 407 н.п., что соответствует аллелю А (рис. 1). Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом электрофореза в 2,5%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия, и в зависимости от длины фрагментов устанавливают генотип индивидуально у каждого животного. Один фрагмент размером 407 п.н. соответствует генотипу АА, два фрагмента размером 266- и 144 н.п. - генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу АВ (рис. 2).

Результаты SNP-LIF теста вносят в электронную базу племенного учета и при оценке плодовитости в качестве дополнительного критерия используют генотип AA/LIF, наличие которого свидетельствует о генетической предрасположенности свиней к более высоким показателям количества поросят при рождении и многоплодию. По результатам теста можно проводить оценку плодовитости свиней в раннем возрасте, а также у хрячков до получения от них продуктивного потомства.

Таким образом, представленный способ SNP-LIF тестирования позволяет более эффективно проводить оценку плодовитости свиноматок, т.к. учитывает генетические факторы, влияющие на репродуктивные функции организма.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Для установления достоверного влияния генотипов SNP-LIF на плодовитость свиней сформировали группы из свиноматок крупной белой породы (n=300) и свиноматок породы ландрас (n=500). У свиней были отобраны образцы ткани (волосяные луковицы), которые служили материалом для получения ДНК-образцов и использовались для определения генотипов SNP-LIF. Для оценки плодовитости учитывали количество поросят при рождении (гол.) и многоплодие (гол.). Для анализа были взяты данные по трем опоросам.

ДНК выделяли набором DIAtom DNA Prep 100 (ООО «НПФ Генлаб») и проводили амплификацию интересующего фрагмента гена LIF (407 н.п.) с использованием праймеров 5'-ATGTGGATGTGGCCTACGG-3' и 5'-GGGAACAAGGTGGTGATGG-3' в следующем режиме: предварительная денатурация при 94°С - 4 мин, 35 циклов: 94°С - 30 с, 58°С - 60 с, 72°С - 30 с; заключительный синтез при 72°С - 7 мин. Рестрикцию амплифицированного фрагмента гена LIF проводили эндонуклеазой рестрикции DraIII. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяли методом электрофореза в 2,5%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия, и в зависимости от длины фрагментов устанавливают генотип индивидуально у каждого животного. Фрагменты размером 407 н.п. соответствовали генотипу АА, два фрагмента размером 266- и 144 н.п. - генотипу ВВ, три фрагмента 407-, 266- и 144 н.п. - генотипу АВ.

В результате SNP тестирования по гену LIF у свиней крупной белой породы были установлены генотипы AA/LIF у 35% свиноматок (n=105), AB/LIF у 47% (n=141) и BB/LIF - 18% (n=54). У свиноматок породы ландрас генотип AA/LIF имели 26% свиноматок (n=130), генотип АВ - 40% (n=200) и ВВ - 34% (n=170).

Влияние генотипов АА, АВ и ВВ на признаки плодовитости (количество поросят при рождении (гол.), многоплодие (гол.)) рассчитывали на основании данных электронной базы племенного учета и разработанной линейной модели

Yijkl=μ+Gi+LIFj+eijk, где μ - среднее значение признака; G - порода животного; LIF - генотипы по гену LIF (АА, АВ, ВВ).

Результаты показали (табл. 1) достоверное влияние генотипов гена LIF на плодовитость свиней пород ландрас и крупная белая:

- свиноматки породы ландрас с генотипом AA/LIF достоверно отличались лучшими показателями по количеству поросят при рождении, многоплодию на 1,4 и 1,3 гол. соответственно по сравнению со свиноматками, имеющими генотип BB/LIF;

- свиноматки крупной белой породы, имеющие генотип AA/LIF также достоверно отличались лучшими показателями по количеству поросят при рождении, многоплодию на 1,2 и 1,0 гол. соответственно относительно аналогов с генотипом BB/LIF.

Полученные результаты показали наличие достоверной ассоциативной связи генотипа AA/LIF с высокими показателями плодовитости (количество поросят при рождении и многоплодие) свиноматок и подтвердили целесообразность использования данных SNP-LIF тестирования при оценке плодовитости свиней.

Пример 2. Для оценки эффективности использования SNP-LIF тестирования в ЗАО «Племзавод Юбилейный» были сформированы группы свиноматок без проведения SNP тестирования (контроль) и с учетом результатов SNP-LIF тестирования (опытная). В первую группу вошли свиноматки породы ландрас (n=100) без проведения SNP-LIF тестирования (контроль 1), а во второй группе свиноматки породы ландрас (n=100) имели по результатам SNP-LIF тестирования генотип АА (опытная 1). Аналогично были сгруппированы и свиноматки крупной белой породы, третья группа – свиноматки крупной белой породы (n=100) без проведения SNP-LIF тестирования (контроль 2), а четвертая группа состояла из свиноматок крупной белой породы (n=100), которые имели по результатам SNP-LIF тестирования генотип АА (опытная 2). Все отобранные свиноматки имели одинаковые условия содержания и кормления. При оценке плодовитости учитывали данные по количеству поросят при рождении и многоплодию по трем опоросам. Результаты показали, что все свиноматки, отобранные с учетом SNP-LIF тестирования, имели значительное превосходство по плодовитости (табл. 2).

Свиноматки породы ландрас первой опытной группы, по сравнению со свиноматками первой контрольной группы, имели лучшие показатели плодовитости: достоверно большее количество поросят при рождении и многоплодие на 0,7 и 0,9 гол. соответственно.

Аналогичные результаты получены и у свиноматок крупной белой породы. Так, свиноматки крупной белой породы второй опытной группы, по сравнения со свиноматками второй контрольной группы, имели лучшее показатели плодовитости: достоверно лучшие показатели по количеству поросят при рождении и многоплодию на 0,5 и 0,6 гол. соответственно.

Таким образом, выявлена связь генотипа AA/LIF с высокой плодовитостью свиноматок. Использование тестирования SNP-LIF позволяет проводить оценку свиней и отбирать свиней генотипа AA/LIF, обладающих генетической предрасположенностью к более высокой плодовитости.