Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СКРИНИНГА ОТБЕЛИВАТЕЛЕЙ КРОВОПОДТЕКОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, фармации, дерматологии, косметологии и судебной медицине, и может быть использовано при разработке новых лекарственных средств, предназначенных для поиска и оценки эффективности средств, обесцвечивающих кожу в области «красных» и «синих», свежих и старых кровоподтеков, при разработке косметических технологий, предназначенных для удаления кровоподтеков, а также при судебной медицинской экспертизе давности кровоподтеков и ушибов мягких тканей.

В настоящее время в экспериментальной фармакологии отсутствуют технологии скрининга средств, претендующих на роль отбеливателей кровоподтеков. Более того, в дерматологии кровоподтеки до сих пор не признаны официальной медициной как самостоятельное заболевание кожи, требующее специальных лекарств, в фармации отбеливатели кровоподтеков отсутствуют среди официально признанных групп фармакологических средств, а в косметологии отсутствуют технологии для быстрого удаления кровоподтеков. В то же время в судебной медицине наличие кровоподтеков на теле пациентов и пострадавших признается как неоспоримое доказательство повреждения мягких тканей, полученное вследствие механической травмы [1].

Все это тормозит поиск эффективных средств, отбеливающих кожу и слизистые оболочки в области свежих и старых, красных, синих, зеленых и желтых кровоподтеков. В этих условиях во всем мире при кровоподтеках применяются «дедовские» средства: «медный пятак», «холод», «волшебные» примочки и припарки [2].

Тем не менее, в последние годы в России были изобретены способы и средства, позволяющие очень быстро обесцвечивать кожу в области кровоподтеков, а специально создаваемые для этого лекарственные средства было предложено называть «Отбеливатели кровоподтеков» и отнести их к новой фармакологической группе [3].

Известен скрининг лекарств, предназначенных для лечения вирусных, онкологических, аутоиммунных и иных заболеваний, основанный на основе результатов культивирования цельной гепаринизированной крови больного в присутствии водных растворов препаратов сравнения. Культивирование проводят в течение 1 ч при температуре, близкой к 37°С, причем введение тестируемого препарата в кровь осуществляют в дозе, соответствующей 1:5000 от терапевтической. Анализируют соотношение -SH и -SS-групп в клеточной фракции крови больного после культивирования и в качестве искомого выбирают препарат с наибольшим соотношением -SH и -SS-групп в клеточной фракции у конкретного больного. Способ позволяет снизить время скрининга до нескольких часов. (RU 2150700).

Недостатком данного способа является низкая эффективность, скорость, точность, безопасность и узкая сфера применения. Дело в том, что смешивание с кровью пациента тестируемого препарата в дозе, соответствующей 1:5000 от терапевтической, и последующее культивирование биопрепарата не точно воссоздает условия местного взаимодействия препарата с тканями кожи в области кровоподтека, а ожидание результатов взаимодействия в течение 1 ч не обеспечивает высокую точность скрининга препаратов, способных вызвать обесцвечивание крови и кожи в окровавленном участке через нескольких секунд и минут после введения.

Помимо этого, способ требует участия персонала, специально обученного иммуногистологическим методам исследований.

К тому же, использование иммунологических методов исследования в опытах с живой кровью конкретного пациента не обеспечивает стандартизацию получаемых данных и повторяемость результатов при использовании крови других пациентов, а также у одного и того же пациента, но с перерывом в несколько лет, что не годится для судебной экспертизы и доклинической фармакологической оценки активности препаратов при скрининге отбеливателей кровоподтеков.

Кроме этого, использование крови пациента снижает безопасность скрининга, поскольку кровь пациента может явиться источником заражения вирусной инфекцией лаборантов и других участников исследований.

Известен способ скрининга фармакологических соединений на нейропротекторную активность, основанный на культивировании первичных культур нейронов или первичных глиальных клеток, добавлении к ним тестируемого соединения, оценке выживаемости культивируемых нейронов или пролиферации культивируемых глиальных клеток (RU 2383615).

Недостатком способа является низкая скорость, эффективность, точность и узкая сфера применения, поскольку способ не применим для скорой оценки фармакологической обесцвечивающей активности нескольких препаратов при однократном введении. Помимо этого, способ не предназначен для скрининга средств, обесцвечивающих кожу, окрашенную кровью в области кровоподтеков.

Известен способ фармакологических исследований при поиске и оценке эффективности лекарств-отбеливателей татуировок, осуществляемый в лабораторных условиях при температуре +24-+26°С с использованием жизнеспособного изолированного размером 20×15 см сегмента передней брюшной стенки взрослой свиньи после инъекционного введения в кожу татуажного пигмента (черного или красного цвета) с помощью специальных тату игл [4].

Недостатком способа является низкая эффективность, точность и узкая сфера применения, поскольку способ не обеспечивает создание нескольких изолированных друг от друга стандартных кровоподтеков и не предназначен для оценки фармакологической обесцвечивающей активности нескольких средств одновременно при их однократном локальном введении в кожу в области свежих и старых, красных и синих кровоподтеков. Дело в том, что способ не обеспечивает искусственное создание стандартных кровоподтеков в коже путем инъекционного введения в нее дозированных объемов крови ярко красного и темно-вишневого цвета посредством множества внутрикожных инъекций, выполняемых инъекционным шприцем, соединенным с инъекционной иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, с производством проколов кожи в шахматном порядке на расстоянии друг от друга, исключающем слияние двух соседних кровоподтеков. Помимо этого, способ не обеспечивает регистрацию времени создания искусственных кровоподтеков, момента введения изучаемых препаратов, свежести (старости) кровоподтека и момента достижения полного обесцвечивания кожи в области каждого конкретного кровоподтека после введения каждого препарата при использовании той ли иной технологии введения.

Задачей изобретения является повышение эффективности, скорости, точности, безопасности и расширение сферы применения за счет формирования множества не сливающихся друг с другом стандартных кровоподтеков, вызванных внутрикожным введением крови разного цвета, регистрации времени создания кровоподтеков, момента введения препаратов и момента достижения ими полного обесцвечивания кожи в области кровоподтеков.

Техническим результатом является быстрое исследование в лабораторных условиях отбеливающей активности нескольких средств одновременно при локальном однократном их введении в кожу в области «красных» и «синих», свежих и старых кровоподтеков за счет расширения сферы применения, повышения точности и скорости выявления отбеливающей активности в условиях стандартных свежих и старых кровоподтеков, созданных внутрикожными инъекциями стандартных объемов крови ярко красного и темно-вишневого цветов, исключающих воспаление и участие таких симптомов локального воспаления, как гиперемия, гипертермия, отечность, болезненность, нарушение функции, а также заражение исследователей вирусными инфекциями.

Сущность способа скрининга отбеливателей кровоподтеков, проводимого в лабораторных условиях при температуре +24-+26°С, основанного на анализе результатов локального взаимодействия тестируемых средств, вводимых в определенных дозах и лекарственных формах в жизнеспособный изолированный размером 20×15 см сегмент передней брюшной стенки свиньи после инъекционного введения в кожу пигмента, заключается в том, что в качестве пигмента используют свиную венозную кровь, которую заготавливают предварительно в объеме 0,5-25 мл, половину порции крови насыщают кислородом с помощью раствора 0,05-0,29% перекиси водорода, после чего осуществляют с помощью шприца, соединенного с иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, внутритканевое инъекционное введение в кожу по 0,5 мл крови отдельно насыщенной и ненасыщенной кислородом, при этом каждую последующую инъекцию осуществляют с интервалом времени, обеспечивающем стабилизацию размеров кровоподтека, созданного предыдущей инъекцией, проколы кожи производят в шахматном порядке на расстоянии друг от друга, исключающем слияние соседних кровоподтеков, регистрируют время создания кровоподтеков, их количество и место расположения, перед введением изучаемых средств сегмент передней брюшной стенки располагают кожей вверх, освещают кожу непрерывно потоком равномерного рассеянного естественного света, фиксируют исследуемую поверхность в выбранном положении, устанавливают видеокамеру с функцией непрерывной цветной киносъемки в положении, обеспечивающем визуализацию и съемку всей площади кожи, непрерывную киносъемку динамики состояния кожи и цвета синяков начинают одновременно с введением первого изучаемого средства, исследуемые средства вводят с регистрацией момента их введения в область красных и синих кровоподтеков, в каждый кровоподтек вводят только одно испытуемое средство, средство вводят в выбранной терапевтической дозе однократно, фиксируют моменты введения и моменты достижения полного обесцвечивания кожи в области каждого кровоподтека.

В заявленном способе использование свиной венозной крови в качестве пигмента повышает точность, безопасность и расширяет сферу применения, поскольку обеспечивает искусственное воспроизведение «холодных» кровоподтеков, которые у живых биологических объектов формируются вследствие пропитывания венозной кровью неповрежденной кожи, а именно - без ушиба мягких тканей [5].

Предварительная заготовка свиной венозной крови в объеме 0,5-25 мл повышает эффективность, безопасность и точность, поскольку исключает заражение исследователей патогенными вирусами, обеспечивает наличие крови для ее инъекции в кожу изолированного сегмента и формирования кровоподтеков без промедлений, что исключает чрезмерно длительную задержку начала эксперимента и развитие необратимых гипоксических повреждений в коже изолированного сегмента передней брюшной стенки свиньи, а также обеспечивает исследователей кровью темно-вишневого цвета, что обеспечивает моделирование «холодных» и синих кровоподтеков с ее помощью. При этом минимальный объем крови достаточен для формирования одного кровоподтека стандартного размера, поскольку для этого необходимо ввести внутрь кожи 0,5 мл крови, а максимальный объем крови обеспечивает создание 50 стандартных кровоподтеков (созданных внутрикожными инъекциями по 0,5 мл крови), то есть максимального количества кровоподтеков, которые могут разместиться изолированно друг от друга на всей площади кожи изолированного сегмента передней брюшной стенки свиньи размером 15×20 см.

Насыщение половины порции крови кислородом с помощью раствора 0,05-0,29% перекиси водорода повышает эффективность, точность и расширят сферу применения, поскольку обеспечивает изменение цвета крови этой порции и приобретение ярко красной окраски. Благодаря применению крови темно-вишневого и ярко красного цветов удается создавать кровоподтеки синего и ярко красного цветов. Использование для насыщения венозной крови раствора 0,05-0,29% перекиси водорода обеспечивает высокую скорость и безопасность насыщения венозной крови, поскольку содержание перекиси водорода является достаточным для насыщения крови в считанные десятки секунд, с одной стороны, и, с другой стороны, исключает бурное гейзероподобное действие и пенообразование из-за слабой интенсивности образования пузырьков газа кислорода при взаимодействии крови с указанным раствором перекиси водорода [6].

Осуществление с помощью шприца, соединенного с иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, инъекционного внутритканевого введения по 0,5 мл крови отдельно насыщенной и ненасыщенной кислородом, повышает эффективность и точность, поскольку создает стандартизированные условия моделирования синих и красных кровоподтеков и обеспечивает повторяемость результатов. Введение 0,5 мл свиной крови в кожу свиньи является достаточным для формирования кровоподтека округлой формы диаметром около 10 мм. Этот размер является оптимальным для скрининга соединений - отбеливателей кровоподтеков. Благодаря этому на всей поверхности кожи изолированного сегмента передней брюшной стенки свиньи (с размерами сегмента 15×20 см) может быть искусственно создано до 50 изолированных друг от друга кровоподтеков. Такое количество кровоподтеков позволяет исследовать эффективность одновременно до 10 соединений (препаратов) и/или отдельных технологий их введения (в группах по 5 кровоподтеков), что повышает скорость, точность и продуктивность способа.

Осуществление каждой последующей инъекции с интервалом времени, обеспечивающем стабилизацию размеров кровоподтека, созданного предыдущей инъекцией, и производство проколов кожи в шахматном порядке на расстоянии друг от друга, исключающем слияние соседних кровоподтеков, повышает эффективность и точность способа, поскольку обеспечивает стандартность искусственных кровоподтеков и наличие достаточного расстояния между ними, необходимого для того, чтобы средство, введенное в один кровоподтек, не достигало соседних кровоподтеков и не действовало на них.

Регистрирование времени создания каждого кровоподтека, количества кровоподтеков и мест их расположения на коже повышает эффективность и точность, поскольку обеспечивает информацией о давности (свежести) кровоподтеков, о динамике состояния и цвете кожи каждого кровоподтека после введения в каждый из них определенного средства.

Расположение сегмента передней брюшной стенки кожей вверх перед введением изучаемых средств, освещение кожи непрерывно потоком равномерного рассеянного естественного света, фиксирование исследуемой поверхности в выбранном положении, устанавливание видеокамеры с функцией непрерывной цветной киносъемки в положении, обеспечивающем визуализацию и съемку всей площади кожи, осуществление непрерывной киносъемки динамики состояния кожи и цвета синяков, которую начинают одновременно с введением первого изучаемого средства, повышает эффективность, точность и расширяет сферу применения способа, поскольку создает оптимальные и стабильные условия освещенности и съемки динамики цвета кожи в области всех кровоподтеков одновременно сразу после введения всех исследуемых средств, начиная с первого препарата.

Введение исследуемых средств с регистрацией момента их введения в область красных и синих кровоподтеков, введение в каждый кровоподтек только одного испытуемого средства и введение средства в выбранной терапевтической дозе однократно, фиксирование моментов введения и моментов достижения полного обесцвечивания кожи в области каждого кровоподтека повышает эффективность, точность и расширяет сферу применения, поскольку обеспечивает проведение скрининга нескольких соединений враз, быструю оценку прямого локального действия каждого из них на красные и синие кровоподтеки при однократном введении в терапевтических дозах практически одновременно в реальном режиме времени.

Помимо этого, регистрация времени создания кровоподтеков и фиксирование места расположения каждого кровоподтека с помощью киносъемки повышает точность и эффективность, поскольку исключает путаницу по забывчивости или по случайности.

Способ осуществляют следующим образом. При необходимости проведения скрининга нескольких соединений, претендующих на роль отбеливателей кровоподтеков, используют свежую свиную венозную кровь в объеме от 0,5 до 25 мл и жизнеспособный сегмент передней брюшной стенки свиньи. Заготовленные биологические ткани привозят в лабораторию, где половину порции крови насыщают кислородом с помощью раствора 0,05-0,29% перекиси водорода. Затем осуществляют с помощью шприца, соединенного с иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, формирование искусственных кровоподтеков путем внутритканевого инъекционного введения в кожу по 0,5 мл крови отдельно насыщенной и ненасыщенной кислородом. При этом каждую последующую инъекцию осуществляют с интервалом времени, обеспечивающим стабилизацию размеров кровоподтека, созданного предыдущей инъекцией. Проколы кожи инъекционной иглой производят в шахматном порядке на расстоянии друг от друга, исключающем слияние соседних кровоподтеков. Регистрируют время создания кровоподтеков, их количество и место расположения. Перед введением изучаемых средств сегмент передней брюшной стенки располагают кожей вверх. Освещают кожу непрерывно потоком равномерного рассеянного естественного света, фиксируют исследуемую поверхность в выбранном положении, устанавливают видеокамеру с функцией непрерывной цветной киносъемки в положении, обеспечивающем визуализацию и съемку всей площади кожи. Непрерывную киносъемку динамики состояния кожи и цвета синяков начинают одновременно с введением первого изучаемого средства. Исследуемые средства вводят с регистрацией момента их введения в область красных и синих кровоподтеков, в каждый кровоподтек вводят только одно испытуемое средство, которое вводят в выбранной терапевтической дозе однократно. Фиксируют моменты введения испытуемых соединений и моменты достижения полного обесцвечивания кожи в области каждого кровоподтека. Анализируют полученные результаты и выдают заключение о наличии способности соединений быстро обесцвечивать кожу в области свежих и/или старых синих и красных кровоподтеков. Соединения, обесцвечивающие кожу в области кровоподтеков, относят к группе потенциальных отбеливателей кровоподтеков.

Пример. Для первичного скрининга фармакологической активности средств-претендентов на включение в фармакологическую группу отбеливателей кровоподтеков поступило 5 новых химических щелочных соединений, которые получили лабораторное название соответственно bl₁, bl₂, bl₃, bl₄, bl₅. Все данные соединения хорошо растворимы в жирах, поэтому могут быть применены в виде мазей для наружного применения в терапевтической концентрации 0,1-1%. В связи с этим приготовили мази, включающие отдельно 1% каждого из испытуемых соединений. Параллельно заказали и получили из цеха забоя скотины мясокомбината 20 мл венозной свиной крови и кусок жизнеспособной передней брюшной стенки свиньи, который имел размеры 15×20 см. Полученную кровь разделили на 2 половины. При этом одну половину крови тут же обогатили кислородом с помощью раствора 0,29% перекиси водорода. Обогащенная кислородом кровь приобрела ярко красный цвет. Набрали в один шприц, соединенный с инъекционной иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, венозную кровь темно-вишневого цвета объемом 10 мл и произвели в кожу изолированного сегмента передней брюшной стенки свиньи 20 внутрикожных инъекций крови по 0,5 мл, осуществляя проколы в шахматном порядке на расстоянии не менее 3 см друг от друга, что исключало слияние соседних кровоподтеков друг с другом. Для этого каждую последующую инъекцию крови осуществляли с интервалом времени, обеспечивающим стабилизацию размеров кровоподтека, созданного предыдущей инъекцией. При этом в коже появились кровоподтеки в виде 20 круглых пятен синего цвета. Зарегистрировали время создания каждого кровоподтека и места их локализации.

Затем набрали в другой шприц, также соединенный с инъекционной иглой, предназначенной для внутрикожных инъекций, венозную кровь, насыщенную кислородом и имеющую ярко красный цвет, объемом 10 мл и произвели в кожу изолированного сегмента передней брюшной стенки свиньи 20 внутрикожных инъекций крови по 0,5 мл, осуществляя проколы в шахматном порядке также на расстоянии не менее 3 см друг от друга в оставшемся свободном участке кожи. В результате инъекций крови в коже появилось 20 кровоподтеков красного цвета. Зарегистрировали время создания каждого кровоподтека, а также количество всех кровоподтеков и место расположения каждого из них.

Сразу после окончания этого перед введением изучаемых средств сегмент передней брюшной стенки расположили кожей вверх, осветили кожу непрерывным потоком равномерного рассеянного естественного света, зафиксировали исследуемую поверхность в выбранном положении, установили видеокамеру с функцией непрерывной цветной киносъемки в положении, обеспечивающем визуализацию и съемку всей площади кожи. После этого начали смазывать всю кожу в области размещения каждого кровоподтека в группе, включающей по 2 синих и по 2 красных кровоподтеков, отдельно каждой мазью, включающей одно из испытуемых соединений, а именно - bl_1, bl₂, bl₃, bl₄, bl₅. Кроме этого произвели внутритканевые инъекции в кожу в области аналогичной группы кровоподтеков отдельно по 0,5 мл раствора 0,29% перекиси водорода. Одновременно с введением на кожу первого изучаемого средства начали непрерывную киносъемку динамики состояния кожи и цвета синяков. Исследуемые средства вводили с регистрацией момента их введения в область красных и синих кровоподтеков. При этом в каждый кровоподтек вводили только одно испытуемое средство, которое наносили накожно, смазывая всю площадь кои над каждым синяком мазью, содержащей 1% испытуемого соединения однократно. Фиксировали моменты введения средств и моменты достижения полного обесцвечивания кожи в области каждого кровоподтека. Выждали 15 минут после последней инъекции и завершили серию экспериментов. На проведение скрининга было потрачено 40 минут. Получили следующие результаты.

Кожа над синими и красными кровоподтеками, оставшимися без введения испытуемых растворов и эталонного отбеливателя кровоподтеков, сохранила свой цвет без изменений, а именно - осталась синего цвета в области синих кровоподтеков и красного цвета в области красных кровоподтеков.

Кожа над 2-мя синими и 2-мя красными кровоподтеками, внутрь которой над каждым кровоподтеком была произведена инъекция по 0,5 мл раствора 0,29% перекиси водорода, обесцветилась практически полностью через 30 секунд после инъекции и затем сохранилась обесцвеченной.

Кожа над красными и синими кровоподтеками, в область которых были нанесены мази, включающие по 1% одного из испытуемых соединений, а именно - bl_1, bl₂, bl₃, bl₄, bl₅, сохранила свой цвет, то есть осталась синей над синими кровоподтеками и красноватой - над красными кровоподтеками.

Следовательно, однократное введение мазей, содержащих 1% одного из испытуемых щелочных соединений bl_1, bl₂, bl₃, bl₄, bl₅, нe обесцвечивает кожу в области свежих красных и синих кровоподтеков при однократном применении. Поэтому мази каждого из 5 испытуемых соединений, имеющих лабораторное название bl_1, bl₂, bl₃, bl₄, bl₅, не обладают фармакологической активностью, характерной для отбеливателей кровоподтеков.

Раствор 0,29% перекиси водорода обесцвечивает кожу в области свежих красных и синих кровоподтеков через 30 секунд после однократной инъекции. Поэтому раствор 0,29% перекиси водорода обладает фармакологической активностью, характерной для отбеливателей кровоподтеков. В связи с этим целесообразно продолжение фармакологических исследований этого препарата.

Таким образом, предложенный способ повышает эффективность, скорость, точность, безопасность и расширяет сферу применения за счет быстрого искусственного создания нескольких десятков стандартных кровоподтеков и быстрого получения информации о динамике цвета кожи в области каждого из них после введения нескольких испытуемых соединений различными технологиями враз. В частности, способ обеспечивает быстрый скрининг соединений при однократном введении их в область синих и красных, свежих и старых кровоподтеков в условиях отсутствия ушиба мягких тканей и локального воспаления.

Список литературы

1. Urakov A.L., Ammer К., Urakova N.A., Chemova L.V., Fisher E.L. Infrared thermography can discriminate the cause of skin discolourations. Thermology international. 2015. Vol. 25. №4. P. 209-215.

2. Ураков А.Л., Габдрахманова Л.Д. Отбеливатели татуировок. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2015. №10. С. 97-100.

3. Ураков А.Л., Уракова Н.А., Никитюк Д.Б., Фишер Е.Л., Чернова Л.В., Эль-Хассаун X. Отбеливатели кровоподтеков. Новая фармакологическая группа лекарственных средств. Успехи современного естествознания. 2015. №1. С. 1102-1107.

4. Габдрахманова Л.Д. Отбеливатели татуировок. Новая фармакологическая группа лекарственных средств. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2015. Т. 17 (8). С. 25-26.

5. Urakov A.L., Ammer К., Urakova N.A., Chemova L.V., Fisher E.L. Infrared thermography can discriminate the cause of skin discolourations. Thermology international. 2015. Vol. 25. №4. P. 209-215.

6. (RU 2538662) Ураков А.Л., Уракова H.A., Решетников А.П., Сойхер М.Г., Сойхер Е.М., Копылов В.М., Чернова Л.В. Гипероксигенированное средство Е.М. Сойхер для насыщения венозной крови кислородом. Патент №2538662. 2015. Бюл. №1.