×
20.01.2018
218.016.0fbc

Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Заявлена группа изобретений, которая может быть использована при производстве антибактериального антибиотика диметилванкомицина сульфата, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и анаэробами. Предлагается штамм Amycolatopsis orientalis – продуцент диметилванкомицина, депонированный в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ Ас-1984, и способ получения диметилванкомицина. Способ получения диметилванкомицина включает культивирование штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, сорбцию антибиотика из нативного раствора на катионите КБ-2 (Na), десорбцию антибиотика, нейтрализацию элюата катионитом КУ-2-20 (Н) и сорбцию (pH 6,8) антибиотика на Амберлит CG-25 (NH) с последующей элюцией диметилванкомицина (0,05-0,3) н. раствором аммиака. Водный раствор антибиотика концентрируют и осаждают ацетоном. Изобретение позволяет получить антибиотик 97,4% чистоты. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик диметилванкомицин.

Антибиотик диметилванкомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина (далбагептидам), являющимся жизнеспасающими средствами при лечении особо тяжелых инфекций.

Диметилванкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными бактериями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и многие анаэробы, в том числе возбудителя псевдомембранного колита Clostridium difficile.

Диметилванкомицин служит также исходной субстанцией в получении полусинтетических производных природной структуры для улучшения химиотерапевтических показателей, в том числе ослабления аллергизирующего действия, характерного для гликопептидных антибиотиков.

Впервые диметилванкомицин, как один из шести компонентов, был обнаружен в составе комплекса гликопептидных антибиотиков, образуемого мутантным штаммом культуры Nocardia orientalis 2450 - мирового продуцента ванкомицина [2]. Известен штамм этой культуры Amycolatopsis (прежнее название Nocardia) orientalis subsp. Eremomycini ВКПМ-Ас-807 - промышленный продуцент близкого к ванкомицину антибиотика эремомицина [3], принятый в качестве прототипа.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм №9325 - продуцент диметилванкомицина путем селекционного преобразования свойств известного штамма Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас 807 в результате последовательного двухступенчатого воздействия N-метилнитрозомочевины и гамма-лучей 60Со на споры исходной культуры и отбора оригинального мутантного продуцента диметилванкомицина среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к ванкомицину.

Полученный новый штамм №9325 депонирован в коллекции культур ГосНИИ «Генетика» под номером штамм ВКПМ-Ас-1984.

Изобретение включает способ выделения образованного диметилванкомицина при глубинном культивировании нового штамма-продуцента, предусматривающий сорбцию его из нативного раствора на карбоксильном катеоните КБ-2 в солевой форме с последующей десорбцией 0,3 н. раствором аммиака, концентрацией и хроматографической очисткой от примесей микробных метаболитов с использованием Амберлита CG-25 (NH3+) и катеонита КУ-2-20 (Н+), осаждением ацетоном субстанции 97,4% чистоты из водного раствора антибиотика.

Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. ВКПМ-Ас-1984 с антибиотической активностью 1800 мкг в 1 мл ферментационной жидкости обладает способностью синтеза диметилванкомицина в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984

Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°C. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или на среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазоне значений pH (5,0 - 10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; умеренно - сорбит; не утилизирует сахарозу, рафинозу, целлюлозу.

Антагонистические свойства. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia colli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.

Хранение штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом. Антибиотическая активность штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением зон подавления роста образцами испытуемой ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта эремомицина сульфата (100 мкг, 50 мкг, 25 мкг, 12,5 мкг). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, выращенной в течение (10-14) суток при 28°C на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и выращивают при 28°C в течение (24-36) часов на круговой качалке при (220-240) об/мин.

Состав посевной среды, %:

Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Выросшим мицелием в количестве (5-10) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Стерилизация среды в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Ферментационное культивирование проводят при 28°C в течение 120 часов на качалке при (220-240) об/мин. Диметилванкомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Содержание диметилванкомицина при биосинтезе штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 к окончанию ферментации составляет 1800 мкг в 1 мл культуральной жидкости.

Для выделения диметилванкомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия ферментационной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме.

Способ выделения поясняется следующим примером

Пример 2

1 л ферментационной жидкости, содержащей 1,8 г антибиотика, подкисляют серной кислотой до pH 6,7. Мицелий отделяют, промывают дистиллированной водой, нативный раствор, объединенный с промывной водой (1,1 л), пропускают через колонку с катионитом КБ-2 (Na+) с десорбцией антибиотика 0,3 н. раствором аммиака. Элюат нейтрализуют при использовании катеонита КУ-2-20 (Н+) и при pH 6,8 сорбируют на Амберлит CG-25 (NH4+) с последующим вытеснением антибиотика раствором аммиака (0,05-0,3) н. и удалением избытка аммиака использованием катеонита КУ-2-20 (Н+). Водный раствор антибиотика концентрируют упариванием в вакууме и диметилванкомицин осаждается добавлением ацетона. Получено 0,738 г субстанции диметилванкомицина сульфата 97,4% чистоты (метод ВЭЖХ). Выход составляет 41% от содержания диметилванкомицина в ферментационной жидкости.

Антибиотик, полученным заявленным способом, представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и практически нерастворимый в органических растворителях; имеет УФ-спектр, характерный для ванкомициновой группы антибиотиков-гликопептидов с максимумом поглощения при 280 нм и батохромным сдвигом (20-25 нм) при щелочной реакции.

ВЭЖХ анализ полученного диметилванкомицина проводили на жидкостном хроматографе "Knauer" (Germany) с автоматической системой обработки данных и спектрофотометрическим детектором К-2501; колонка из нержавеющей стали длиной 150 мм с внутренним диаметром 4 мм, заполненная сорбентом "Диасфер-110-С16" (БиоХимМак СТ, Москва) с размером частиц 5 мкм. Для элюции антибиотика использовали систему, состоящую из 0,2% раствора HCOONH4 и ацетилнитрила при изменении линейного градиента элюции от 12 до 35% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 280 нм, температура хроматографирования - комнатная, объем петли 20 мкл. В этих условиях время выхода диметилванкомицина - 10,97 мин, время выхода ванкомицина - 6,36 мин.

Показатели, характеризующие диметилванкомицин сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность), полностью соответствуют показателям, которые определены для диметилванкомицина сульфата, защищенного патентом US 0159180 с брутто-формула C68H79Cl2N9O24, мол. масса 1477.3 Да, УФ-спектр, λmax2O)=280 нм. Таким образом, создан новый мутантный штамм - активный продуцент диметилванкомицина Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, отличающийся от известного по способности образовывать новый для штамма-прототипа антибиотик в виде монокомпонента, а также по характеру роста на диагностических агаровых средах и по степени усвоения источников углерода (таблица 2).

Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 и способа выделения антибиотика для коммерческого получения диметилванкомицина позволяет осуществить выход целевого продукта 97,4% чистоты в количестве 0,738 г из 1 л ферментационной жидкости.

Источники информации

1. Shashkov A.S., Tsvetkov D.E., Grachev A.A., Lapchinskaia O.A., Lavrova-Balashova M.F., Ponomarenko V.I., Katrukha G.S., Nifantiev N.E. Structural analysis of Antibiotic INA 9301 from Amycolatopsis orientalis. Natural product communication. Vol.3(10), P. 1631-1638 (2008).

2. Патент ЕР US 0159180 (1985).

3. Патент RU 2352631 от 10.10.2008 г.

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 31-35 из 35.
13.12.2019
№219.017.ed74

Новые производные эремомицина и их применение для лечения бактериальных инфекций

Изобретение относится к производному эремомицина, которое может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности, соответствующему формуле: где Ру - независимо означает пиридин-2-ил, пиридин-3-ил, пиридин-4-ил, n=1-3, а также его кватернизованным N-Cалкильным производным,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002708628
Дата охранного документа: 10.12.2019
27.12.2019
№219.017.f3b7

Способ получения противогрибкового антибиотика эмерициллипсина а

Изобретение относится к способу получения нового пептидного противогрибкового антибиотика эмерициллипсина А, продуцируемого штаммом F -1428, с противогрибковой активностью в отношении 1402м, 497м 2015, а также 988м 2015 и 1133м 2011, обладающих природной резистентностью ко всем применяемым...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002710377
Дата охранного документа: 26.12.2019
13.01.2020
№220.017.f4e7

Штамм streptomyces tendae - продуцент противобактериального антибиотика ина 5812

Изобретение может быть использовано в биотехнологии для производства противобактериального антибиотика ИНА 5812. Антибиотик ИНА 5812 по химическому строению является оригинальным линейно-циклическим гликопептидным соединением, активным в отношении грамположительных патогенов in vitro и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002710733
Дата охранного документа: 10.01.2020
27.01.2020
№220.017.fa14

Противоопухолевое производное нафтоиндол-3-карбоксамида

Изобретение относится к новому соединению - (S)-3-(3-аминопирролидин-1-карбонил)-4,11-дигидрокси-2-метилнафто[2,3-ƒ]индол-5,10-диону и его фармацевтически приемлемой соли. Соединения обладают противоопухолевой активностью и могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002712191
Дата охранного документа: 24.01.2020
03.07.2020
№220.018.2df9

Способ выделения и очистки нафтохиноновых противогрибковых антибиотиков астолидов а и в

Изобретение относится к способу получения антибиотиков. Противогрибковые антибиотики астолиды А и В экстрагируют из мицелия штамма Streptomyces hygroscopicus ВКПМ Ас2079. Способ включает экстракцию биомассы полярными органическими растворителями с ультразвуковой обработкой, а также...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002725187
Дата охранного документа: 30.06.2020
Показаны записи 31-38 из 38.
29.03.2019
№219.016.ece4

Вращающийся парашют

Купол вращающегося парашюта состоит из центральной части, к которой прикреплены две, три, четыре или более лопасти. Центральная часть купола имеет профилированные щели, расположенные у нижней кромки по радиусу к полюсу купола перед и за креплением лопастей к центральной части. Изобретение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002682947
Дата охранного документа: 22.03.2019
29.03.2019
№219.016.f342

Хроматографический способ очистки эремомицина

Изобретение относится к технологии очистки гликопептидов. Осветленную жидкость, содержащую эремомицин, компактируют с сульфированным стирол-дивинилбензольным катионитом, проводят элюирование и нанесение нейтрализованного элюата на колонку с гидрофобным стирол-дивинилбензольным сорбентом. После...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002333963
Дата охранного документа: 20.09.2008
10.04.2019
№219.017.03e8

Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины (варианты)

Изобретение относится к способу переработки древесины, в частности к способу выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины сучковой зоны лиственницы или пихты. Способ выделения секоизоларицирезинола и дигидрокверцетина из древесины, в котором измельченную древесину сучковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002359666
Дата охранного документа: 27.06.2009
31.05.2019
№219.017.715a

Штамм amycolatopsis umgeniensis - продуцент антибиотика эремомицина

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве ценного антибиотика эремомицина сульфата. Штамм Amycolatopsis umgeniensis, обладающий способностью продуцировать эремомицин, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002689699
Дата охранного документа: 28.05.2019
26.11.2019
№219.017.e6c6

Вращающийся парашют

Изобретение относится к вращающимся парашютам. Купол парашюта состоит из центральной части круглой, квадратной или многоугольной формы, к которой с противоположных сторон прикреплены две лопасти и полотнища для укладки лопастей на нижнюю кромку центральной части вдоль участка соединения с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002707165
Дата охранного документа: 22.11.2019
29.11.2019
№219.017.e820

Вращающийся парашют

Изобретение относится к вращающимся парашютам. Вращающийся парашют содержит центральную часть и лопасти со стропами, полотнища для укладки лопастей на центральной части, пояс рифления центральной части, резак пояса рифления, систему подсоединения лопасти к центральной части посредством пояса...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002707482
Дата охранного документа: 26.11.2019
13.01.2020
№220.017.f4e7

Штамм streptomyces tendae - продуцент противобактериального антибиотика ина 5812

Изобретение может быть использовано в биотехнологии для производства противобактериального антибиотика ИНА 5812. Антибиотик ИНА 5812 по химическому строению является оригинальным линейно-циклическим гликопептидным соединением, активным в отношении грамположительных патогенов in vitro и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002710733
Дата охранного документа: 10.01.2020
31.01.2020
№220.017.fb41

Вращающийся парашют

Изобретение относится к вращающимся парашютам. Купол парашюта состоит из центральной части круглой, квадратной или многоугольной формы, к которой с противоположных сторон прикреплены две лопасти и полотнища для укладки лопастей. Лопасти укладываются на нижнюю кромку центральной части вдоль...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002712382
Дата охранного документа: 28.01.2020
+ добавить свой РИД