Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик диметилванкомицин.

Антибиотик диметилванкомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина (далбагептидам), являющимся жизнеспасающими средствами при лечении особо тяжелых инфекций.

Диметилванкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными бактериями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и многие анаэробы, в том числе возбудителя псевдомембранного колита Clostridium difficile.

Диметилванкомицин служит также исходной субстанцией в получении полусинтетических производных природной структуры для улучшения химиотерапевтических показателей, в том числе ослабления аллергизирующего действия, характерного для гликопептидных антибиотиков.

Впервые диметилванкомицин, как один из шести компонентов, был обнаружен в составе комплекса гликопептидных антибиотиков, образуемого мутантным штаммом культуры Nocardia orientalis 2450 - мирового продуцента ванкомицина [2]. Известен штамм этой культуры Amycolatopsis (прежнее название Nocardia) orientalis subsp. Eremomycini ВКПМ-Ас-807 - промышленный продуцент близкого к ванкомицину антибиотика эремомицина [3], принятый в качестве прототипа.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм №9325 - продуцент диметилванкомицина путем селекционного преобразования свойств известного штамма Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас 807 в результате последовательного двухступенчатого воздействия N-метилнитрозомочевины и гамма-лучей ⁶⁰Со на споры исходной культуры и отбора оригинального мутантного продуцента диметилванкомицина среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к ванкомицину.

Полученный новый штамм №9325 депонирован в коллекции культур ГосНИИ «Генетика» под номером штамм ВКПМ-Ас-1984.

Изобретение включает способ выделения образованного диметилванкомицина при глубинном культивировании нового штамма-продуцента, предусматривающий сорбцию его из нативного раствора на карбоксильном катеоните КБ-2 в солевой форме с последующей десорбцией 0,3 н. раствором аммиака, концентрацией и хроматографической очисткой от примесей микробных метаболитов с использованием Амберлита CG-25 (NH₃⁺) и катеонита КУ-2-20 (Н⁺), осаждением ацетоном субстанции 97,4% чистоты из водного раствора антибиотика.

Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. ВКПМ-Ас-1984 с антибиотической активностью 1800 мкг в 1 мл ферментационной жидкости обладает способностью синтеза диметилванкомицина в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984

Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°C. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или на среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазоне значений pH (5,0 - 10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; умеренно - сорбит; не утилизирует сахарозу, рафинозу, целлюлозу.

Антагонистические свойства. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia colli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.

Хранение штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом. Антибиотическая активность штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением зон подавления роста образцами испытуемой ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта эремомицина сульфата (100 мкг, 50 мкг, 25 мкг, 12,5 мкг). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, выращенной в течение (10-14) суток при 28°C на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и выращивают при 28°C в течение (24-36) часов на круговой качалке при (220-240) об/мин.

Состав посевной среды, %:

Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Выросшим мицелием в количестве (5-10) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Стерилизация среды в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Ферментационное культивирование проводят при 28°C в течение 120 часов на качалке при (220-240) об/мин. Диметилванкомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Содержание диметилванкомицина при биосинтезе штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 к окончанию ферментации составляет 1800 мкг в 1 мл культуральной жидкости.

Для выделения диметилванкомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия ферментационной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме.

Способ выделения поясняется следующим примером

Пример 2

1 л ферментационной жидкости, содержащей 1,8 г антибиотика, подкисляют серной кислотой до pH 6,7. Мицелий отделяют, промывают дистиллированной водой, нативный раствор, объединенный с промывной водой (1,1 л), пропускают через колонку с катионитом КБ-2 (Na⁺) с десорбцией антибиотика 0,3 н. раствором аммиака. Элюат нейтрализуют при использовании катеонита КУ-2-20 (Н⁺) и при pH 6,8 сорбируют на Амберлит CG-25 (NH₄⁺) с последующим вытеснением антибиотика раствором аммиака (0,05-0,3) н. и удалением избытка аммиака использованием катеонита КУ-2-20 (Н⁺). Водный раствор антибиотика концентрируют упариванием в вакууме и диметилванкомицин осаждается добавлением ацетона. Получено 0,738 г субстанции диметилванкомицина сульфата 97,4% чистоты (метод ВЭЖХ). Выход составляет 41% от содержания диметилванкомицина в ферментационной жидкости.

Антибиотик, полученным заявленным способом, представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и практически нерастворимый в органических растворителях; имеет УФ-спектр, характерный для ванкомициновой группы антибиотиков-гликопептидов с максимумом поглощения при 280 нм и батохромным сдвигом (20-25 нм) при щелочной реакции.

ВЭЖХ анализ полученного диметилванкомицина проводили на жидкостном хроматографе "Knauer" (Germany) с автоматической системой обработки данных и спектрофотометрическим детектором К-2501; колонка из нержавеющей стали длиной 150 мм с внутренним диаметром 4 мм, заполненная сорбентом "Диасфер-110-С16" (БиоХимМак СТ, Москва) с размером частиц 5 мкм. Для элюции антибиотика использовали систему, состоящую из 0,2% раствора HCOONH₄ и ацетилнитрила при изменении линейного градиента элюции от 12 до 35% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 280 нм, температура хроматографирования - комнатная, объем петли 20 мкл. В этих условиях время выхода диметилванкомицина - 10,97 мин, время выхода ванкомицина - 6,36 мин.

Показатели, характеризующие диметилванкомицин сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность), полностью соответствуют показателям, которые определены для диметилванкомицина сульфата, защищенного патентом US 0159180 с брутто-формула C₆₈H₇₉Cl₂N₉O₂₄, мол. масса 1477.3 Да, УФ-спектр, λ_max (Н₂O)=280 нм. Таким образом, создан новый мутантный штамм - активный продуцент диметилванкомицина Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, отличающийся от известного по способности образовывать новый для штамма-прототипа антибиотик в виде монокомпонента, а также по характеру роста на диагностических агаровых средах и по степени усвоения источников углерода (таблица 2).

Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 и способа выделения антибиотика для коммерческого получения диметилванкомицина позволяет осуществить выход целевого продукта 97,4% чистоты в количестве 0,738 г из 1 л ферментационной жидкости.

Источники информации

1. Shashkov A.S., Tsvetkov D.E., Grachev A.A., Lapchinskaia O.A., Lavrova-Balashova M.F., Ponomarenko V.I., Katrukha G.S., Nifantiev N.E. Structural analysis of Antibiotic INA 9301 from Amycolatopsis orientalis. Natural product communication. Vol.3(10), P. 1631-1638 (2008).

2. Патент ЕР US 0159180 (1985).

3. Патент RU 2352631 от 10.10.2008 г.