×
20.01.2018
218.016.0fbc

Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Заявлена группа изобретений, которая может быть использована при производстве антибактериального антибиотика диметилванкомицина сульфата, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и анаэробами. Предлагается штамм Amycolatopsis orientalis – продуцент диметилванкомицина, депонированный в ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ Ас-1984, и способ получения диметилванкомицина. Способ получения диметилванкомицина включает культивирование штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, сорбцию антибиотика из нативного раствора на катионите КБ-2 (Na), десорбцию антибиотика, нейтрализацию элюата катионитом КУ-2-20 (Н) и сорбцию (pH 6,8) антибиотика на Амберлит CG-25 (NH) с последующей элюцией диметилванкомицина (0,05-0,3) н. раствором аммиака. Водный раствор антибиотика концентрируют и осаждают ацетоном. Изобретение позволяет получить антибиотик 97,4% чистоты. 2 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего противобактериальный антибиотик диметилванкомицин.

Антибиотик диметилванкомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина (далбагептидам), являющимся жизнеспасающими средствами при лечении особо тяжелых инфекций.

Диметилванкомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными бактериями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и многие анаэробы, в том числе возбудителя псевдомембранного колита Clostridium difficile.

Диметилванкомицин служит также исходной субстанцией в получении полусинтетических производных природной структуры для улучшения химиотерапевтических показателей, в том числе ослабления аллергизирующего действия, характерного для гликопептидных антибиотиков.

Впервые диметилванкомицин, как один из шести компонентов, был обнаружен в составе комплекса гликопептидных антибиотиков, образуемого мутантным штаммом культуры Nocardia orientalis 2450 - мирового продуцента ванкомицина [2]. Известен штамм этой культуры Amycolatopsis (прежнее название Nocardia) orientalis subsp. Eremomycini ВКПМ-Ас-807 - промышленный продуцент близкого к ванкомицину антибиотика эремомицина [3], принятый в качестве прототипа.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм №9325 - продуцент диметилванкомицина путем селекционного преобразования свойств известного штамма Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас 807 в результате последовательного двухступенчатого воздействия N-метилнитрозомочевины и гамма-лучей 60Со на споры исходной культуры и отбора оригинального мутантного продуцента диметилванкомицина среди мутагенизированной популяции колоний актиномицета, выросших на селективном фоне устойчивости к ванкомицину.

Полученный новый штамм №9325 депонирован в коллекции культур ГосНИИ «Генетика» под номером штамм ВКПМ-Ас-1984.

Изобретение включает способ выделения образованного диметилванкомицина при глубинном культивировании нового штамма-продуцента, предусматривающий сорбцию его из нативного раствора на карбоксильном катеоните КБ-2 в солевой форме с последующей десорбцией 0,3 н. раствором аммиака, концентрацией и хроматографической очисткой от примесей микробных метаболитов с использованием Амберлита CG-25 (NH3+) и катеонита КУ-2-20 (Н+), осаждением ацетоном субстанции 97,4% чистоты из водного раствора антибиотика.

Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. ВКПМ-Ас-1984 с антибиотической активностью 1800 мкг в 1 мл ферментационной жидкости обладает способностью синтеза диметилванкомицина в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984

Длительность выращивания для изучения таксономических признаков (7-21) суток при температуре 28°C. Для засева диагностических сред используется споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозо-аспарагиновом агаре или на среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера. Данные приведены в таблице №1.

Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или слегка извилистые, распадающиеся на фрагменты различной длины; поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазоне значений pH (5,0 - 10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает, молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.

Использование источников углерода. Хорошо утилизирует глюкозу, фруктозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, рибозу, арабинозу, маннит, мальтозу; умеренно - сорбит; не утилизирует сахарозу, рафинозу, целлюлозу.

Антагонистические свойства. Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia colli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.

Хранение штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом. Антибиотическая активность штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 при глубинном культивировании определяется луночным методом диффузии в агар (среда №2 Гаузе) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 и сравнением зон подавления роста образцами испытуемой ферментационной жидкости с калибровочной кривой стандарта эремомицина сульфата (100 мкг, 50 мкг, 25 мкг, 12,5 мкг). Биологическая активность получаемой биосинтезом и химически очищенной субстанции антибиотика определяется трехдозным вариантом метода (ГФХ, стр. 949).

Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 поясняется следующим примером.

Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, выращенной в течение (10-14) суток при 28°C на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) и выращивают при 28°C в течение (24-36) часов на круговой качалке при (220-240) об/мин.

Состав посевной среды, %:

Среда стерилизуется в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Выросшим мицелием в количестве (5-10) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л) следующего состава, %:

Стерилизация среды в течение 30 мин при давлении 1,0 атм. при 120°C.

Ферментационное культивирование проводят при 28°C в течение 120 часов на качалке при (220-240) об/мин. Диметилванкомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633. Содержание диметилванкомицина при биосинтезе штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 к окончанию ферментации составляет 1800 мкг в 1 мл культуральной жидкости.

Для выделения диметилванкомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия ферментационной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме.

Способ выделения поясняется следующим примером

Пример 2

1 л ферментационной жидкости, содержащей 1,8 г антибиотика, подкисляют серной кислотой до pH 6,7. Мицелий отделяют, промывают дистиллированной водой, нативный раствор, объединенный с промывной водой (1,1 л), пропускают через колонку с катионитом КБ-2 (Na+) с десорбцией антибиотика 0,3 н. раствором аммиака. Элюат нейтрализуют при использовании катеонита КУ-2-20 (Н+) и при pH 6,8 сорбируют на Амберлит CG-25 (NH4+) с последующим вытеснением антибиотика раствором аммиака (0,05-0,3) н. и удалением избытка аммиака использованием катеонита КУ-2-20 (Н+). Водный раствор антибиотика концентрируют упариванием в вакууме и диметилванкомицин осаждается добавлением ацетона. Получено 0,738 г субстанции диметилванкомицина сульфата 97,4% чистоты (метод ВЭЖХ). Выход составляет 41% от содержания диметилванкомицина в ферментационной жидкости.

Антибиотик, полученным заявленным способом, представляет собой белый аморфный порошок, легко растворимый в воде и практически нерастворимый в органических растворителях; имеет УФ-спектр, характерный для ванкомициновой группы антибиотиков-гликопептидов с максимумом поглощения при 280 нм и батохромным сдвигом (20-25 нм) при щелочной реакции.

ВЭЖХ анализ полученного диметилванкомицина проводили на жидкостном хроматографе "Knauer" (Germany) с автоматической системой обработки данных и спектрофотометрическим детектором К-2501; колонка из нержавеющей стали длиной 150 мм с внутренним диаметром 4 мм, заполненная сорбентом "Диасфер-110-С16" (БиоХимМак СТ, Москва) с размером частиц 5 мкм. Для элюции антибиотика использовали систему, состоящую из 0,2% раствора HCOONH4 и ацетилнитрила при изменении линейного градиента элюции от 12 до 35% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин, детектирование при длине волны 280 нм, температура хроматографирования - комнатная, объем петли 20 мкл. В этих условиях время выхода диметилванкомицина - 10,97 мин, время выхода ванкомицина - 6,36 мин.

Показатели, характеризующие диметилванкомицин сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность), полностью соответствуют показателям, которые определены для диметилванкомицина сульфата, защищенного патентом US 0159180 с брутто-формула C68H79Cl2N9O24, мол. масса 1477.3 Да, УФ-спектр, λmax2O)=280 нм. Таким образом, создан новый мутантный штамм - активный продуцент диметилванкомицина Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984, отличающийся от известного по способности образовывать новый для штамма-прототипа антибиотик в виде монокомпонента, а также по характеру роста на диагностических агаровых средах и по степени усвоения источников углерода (таблица 2).

Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-1984 и способа выделения антибиотика для коммерческого получения диметилванкомицина позволяет осуществить выход целевого продукта 97,4% чистоты в количестве 0,738 г из 1 л ферментационной жидкости.

Источники информации

1. Shashkov A.S., Tsvetkov D.E., Grachev A.A., Lapchinskaia O.A., Lavrova-Balashova M.F., Ponomarenko V.I., Katrukha G.S., Nifantiev N.E. Structural analysis of Antibiotic INA 9301 from Amycolatopsis orientalis. Natural product communication. Vol.3(10), P. 1631-1638 (2008).

2. Патент ЕР US 0159180 (1985).

3. Патент RU 2352631 от 10.10.2008 г.

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 11-20 из 35.
25.08.2017
№217.015.b49c

Способ получения комплексного шигеллезного препарата

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа получения низкопирогенного комплексного шигеллезного препарата, обладающего протективной активностью против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне. Способ включает перемешивание равных весовых количеств...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614123
Дата охранного документа: 22.03.2017
25.08.2017
№217.015.b4ca

Штамм гриба из класса sordariomycetes - продуцент антибиотика эремоксиларина а.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614126
Дата охранного документа: 22.03.2017
25.08.2017
№217.015.d34d

Способ определения качества охлажденного и мороженого рыбного сырья

Использование: для определения качества охлажденного и мороженого рыбного сырья. Сущность изобретения заключается в том, что выполняют спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) продуктов распада аденозин-5'-трифосфата (АТР)-инозина, гипоксантина и инозин-5'-монофосфата в экстракте...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621878
Дата охранного документа: 07.06.2017
26.08.2017
№217.015.d5ac

Способ получения 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина а и его применение для ингибирования роста дрожжей рода candida

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается нового производного макролидного антибиотика олигомицина А - 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А, его структуры и способа его получения, а также применения для лечения заболеваний, вызванных дрожжевыми грибками рода...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002623087
Дата охранного документа: 22.06.2017
26.08.2017
№217.015.e7ef

Штамм bacillus pumilus и способ получения антибиотика амикумацина а с его применением

Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения амикумацина предусматривает культивирование штамма бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-12548 на жидкой питательной среде, содержащей сахарозу, глюкозу, дрожжевой экстракт, КНРО, NaCl, MgSO, (NH)SO, FeSO×7HO, MnCl×4HO, CaCO и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002627187
Дата охранного документа: 03.08.2017
29.12.2017
№217.015.f7e7

Пероральные противоопухолевые средства и способ лечения онкологических заболеваний

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой пероральное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее: терапевтически эффективное количество метансульфоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639479
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.fb49

Производные 1,4-диоксида хиноксалин-2-карбонитрила, ингибирующие рост опухолевых клеток

Изобретение относится к производным 1,4-диоксида хиноксалин-2-карбонитрила, соответствующим формуле: а также фармацевтическим композициям на их основе. Технический результат: получены новые соединения, которые обладают антипролиферативной активностью и могут быть использованы для ингибирования...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640304
Дата охранного документа: 27.12.2017
19.01.2018
№218.016.0145

Кардиопротекторная фармацевтическая субстанция и способ ее получения

Настоящее изобретение относится к способу получения неопетрозида А, который может быть использован в медицине в качестве средства, ингибирующего активность в отношении гликогенсинтазы-3β и гликогенсинтазы-3α. Предложенный способ отличается тем, что 2,3-ацетонид-D-рибозу ацилируют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002629772
Дата охранного документа: 04.09.2017
19.01.2018
№218.016.0653

Новые производные гетероаренантрацен-2-карбоксамидов, ингибирующие опухолевый рост

Изобретение относится к производным линейных гетероаренантрацендионов, содержащим в положении 2 замещенную карбоксамидную группу, соответствующим формуле, приведенной ниже, а также их таутомерным формам и фармацевтически приемлемым солям, где X означает независимо гетероатом, выбранный из О, S,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631100
Дата охранного документа: 18.09.2017
20.01.2018
№218.016.1414

Способ избирательного удаления о-ацетильных защитных групп в присутствии о-бензоильных

Изобретение относится к способу удаления защитных групп в синтетической химии углеводов, который может быть использован в химической промышленности. Предложенный способ состоит в том, что избирательно удаляют О-ацетильные защитные группы в присутствии О-бензоильных в олигосахаридах, обрабатывая...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634707
Дата охранного документа: 03.11.2017
Показаны записи 11-20 из 38.
25.08.2017
№217.015.b49c

Способ получения комплексного шигеллезного препарата

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа получения низкопирогенного комплексного шигеллезного препарата, обладающего протективной активностью против шигеллеза Флекснера 2а и шигеллеза Зонне. Способ включает перемешивание равных весовых количеств...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614123
Дата охранного документа: 22.03.2017
25.08.2017
№217.015.b4ca

Штамм гриба из класса sordariomycetes - продуцент антибиотика эремоксиларина а.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614126
Дата охранного документа: 22.03.2017
25.08.2017
№217.015.d34d

Способ определения качества охлажденного и мороженого рыбного сырья

Использование: для определения качества охлажденного и мороженого рыбного сырья. Сущность изобретения заключается в том, что выполняют спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР) продуктов распада аденозин-5'-трифосфата (АТР)-инозина, гипоксантина и инозин-5'-монофосфата в экстракте...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621878
Дата охранного документа: 07.06.2017
26.08.2017
№217.015.d5ac

Способ получения 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина а и его применение для ингибирования роста дрожжей рода candida

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается нового производного макролидного антибиотика олигомицина А - 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А, его структуры и способа его получения, а также применения для лечения заболеваний, вызванных дрожжевыми грибками рода...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002623087
Дата охранного документа: 22.06.2017
26.08.2017
№217.015.e7ef

Штамм bacillus pumilus и способ получения антибиотика амикумацина а с его применением

Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения амикумацина предусматривает культивирование штамма бактерий Bacillus pumilus ВКПМ В-12548 на жидкой питательной среде, содержащей сахарозу, глюкозу, дрожжевой экстракт, КНРО, NaCl, MgSO, (NH)SO, FeSO×7HO, MnCl×4HO, CaCO и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002627187
Дата охранного документа: 03.08.2017
29.12.2017
№217.015.f7e7

Пероральные противоопухолевые средства и способ лечения онкологических заболеваний

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой пероральное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее: терапевтически эффективное количество метансульфоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639479
Дата охранного документа: 21.12.2017
29.12.2017
№217.015.fb49

Производные 1,4-диоксида хиноксалин-2-карбонитрила, ингибирующие рост опухолевых клеток

Изобретение относится к производным 1,4-диоксида хиноксалин-2-карбонитрила, соответствующим формуле: а также фармацевтическим композициям на их основе. Технический результат: получены новые соединения, которые обладают антипролиферативной активностью и могут быть использованы для ингибирования...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002640304
Дата охранного документа: 27.12.2017
19.01.2018
№218.016.0145

Кардиопротекторная фармацевтическая субстанция и способ ее получения

Настоящее изобретение относится к способу получения неопетрозида А, который может быть использован в медицине в качестве средства, ингибирующего активность в отношении гликогенсинтазы-3β и гликогенсинтазы-3α. Предложенный способ отличается тем, что 2,3-ацетонид-D-рибозу ацилируют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002629772
Дата охранного документа: 04.09.2017
19.01.2018
№218.016.0653

Новые производные гетероаренантрацен-2-карбоксамидов, ингибирующие опухолевый рост

Изобретение относится к производным линейных гетероаренантрацендионов, содержащим в положении 2 замещенную карбоксамидную группу, соответствующим формуле, приведенной ниже, а также их таутомерным формам и фармацевтически приемлемым солям, где X означает независимо гетероатом, выбранный из О, S,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002631100
Дата охранного документа: 18.09.2017
20.01.2018
№218.016.1414

Способ избирательного удаления о-ацетильных защитных групп в присутствии о-бензоильных

Изобретение относится к способу удаления защитных групп в синтетической химии углеводов, который может быть использован в химической промышленности. Предложенный способ состоит в том, что избирательно удаляют О-ацетильные защитные группы в присутствии О-бензоильных в олигосахаридах, обрабатывая...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002634707
Дата охранного документа: 03.11.2017
+ добавить свой РИД