×
19.01.2018
218.016.0969

Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.)

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1°С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков где недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1°С, влажности 70% в темноте. Изобретение позволяет получить каллусную культуру борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.). 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Борец бородатый – растение семейства Лютиковые (Ranunculaceae), богат дитерпеновыми алкалоидами, такими как аконитин, делькозин, ликоктонин, зонгорин и батаконин и др., кумаринами, флавоноидами, проазуленами. В народной медицине используется для лечения заболеваний ревматического происхождения и воспалений. Обладает болеутоляющим, противоопухолевым свойствами.

Известен способ получения каллусной культуры Pulsatilla taurica (статья Сидякин А.И., Мустафаева У.Ю.  Получение каллусных культур Pulsatilla taurica и их цитологический анализ // Инновации в науке / Сб. ст. по материалам XLV междунар. науч.-практ. конф. № 5 (42). Новосибирск: Изд. «СибАК», 2015, с. 43-53.) из высечек листьев проростков и ювенильных растений, полученных в культуре in vitro из семян, и высечек листьев от растений в фазу плодоношения. Способ включает ступенчатую стерилизацию исходного материала: 1 % KMnO4 (40 минут); 70% этанол (1 минута) и 3% H2O2 (5 минут), и культивирование эксплантов на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующими вариантами добавления гормонов 0,1 мг/л 2,4-Д (2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,01 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин), и 3 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л 6-БАП. Экспланты культивируют на свету или в темноте при температуре 20—24°С. Цикл выращивания культур составляет 70—90 суток.

Недостатком аналога является выбор экспланта для получения каллуса, так как известно, что для получения клеточной культуры алкалоидоносных растений, таких как борец бородатый, рационально использовать наиболее ранние ткани, в которых нет накопления алкалоидов. Несмотря на то что растение Pulsatilla taurica также относится к семейству лютиковые, как и борец бородатый, оно не содержит тех же алкалоидов, а значит, что вышеописанный способ получения каллусной культуры не подходит. Кроме того, в данном способе используется более высокая концентрация стимулятора роста, что приводит к увеличению стоимости процесса.

Известен способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) (Патент РФ 2590586, опубл.  10.07.2016, МПК C12N5/04), включающий посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4-недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадка в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5–2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Недостатками известного способа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимыми этапами являются как проращивание семян в грунте, так и проведение контроля стерильности в течение 10 дней, для чего необходимы дополнительные затраты на приготовление питательных сред. Также в данном способе используются растения 3-4-недельного возраста, а для получения культуры Aconitum barbatum Patr. ex Pers рационально использовать более ранние ткани.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения каллусной культуры аконита байкальского (Еникеев А. Г., Семенов А. А., Горшков А. Г., Максимова Л. А., Копытина Т. В., Гаманец Л. В., Швецов С. Г., Пермяков А. В., Шафикова Т. Н. Культура клеток Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics 1907 перспективный источник биологически активных соединений // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. 2011. №3-1 (98).). Способ включает стерилизацию семян в 3% растворе перекиси водорода, перенос их в пенициллиновые флаконы с агаризованной средой (соли 1/2MS, без сахарозы) и помещение флаконов в холодильник (4°С) на 2,5 месяца. По истечении указанного срока флаконы с семенами переносят в темновой термостат на 26°С. Каллусную культуру получают из этиолированных проростков на солевой среде В5 с добавлением тиамина 1мг/л, пиридоксина 0,5 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозита 100 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, 2% сахарозы, агар-агар 0,8%, pH среды 5,8. Описанный способ принят за прототип изобретения.

Недостатками прототипа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимым этапом является проращивание семян в темновом термостате, для чего необходимо определенное оборудование. Также в среду для получения каллусной культуры дополнительно добавляют инозит, что увеличивает ее стоимость.

В литературных источниках способов получения каллусной ткани Aconitum barbatum Patr. ex Pers. не было найдено.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Aconitum barbatum, перспективной в качестве возможного источника алкалоидов терапевтического действия.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Aconitum barbatum включает в себя стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1ºС на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков. При этом недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1ºС, влажности 70% в темноте.

После образования каллуса проводят его отделение и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Таблица 1 – Состав питательной среды Мурасиге-Скуга, мг/л

Полученный каллус рассаживают в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста – 2,4-D и 6-БАП. Пересадку осуществляют каждые 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводят при 26±1ºС влажности – 70% в темноте.

Технический результат - получение каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.).

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5–1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (1,8 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Пример 2.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 – 1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (2,2 мг/л) и 6-БАП (0,8 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого, в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков, отличающийся тем, что недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1C, влажности 70% в темноте.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 151-160 из 179.
16.08.2019
№219.017.c0c1

Устройство оптической накачки твердотельного лазерно-активного элемента для усиления оптического излучения

Изобретение относится к лазерной технике. Устройство оптической накачки твердотельного лазерно-активного элемента для усиления оптического излучения осуществляет введение энергии накачки в лазерно-активную среду с боковых сторон активного элемента. Последовательное поперечно-продольное введение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002697434
Дата охранного документа: 14.08.2019
03.09.2019
№219.017.c6c1

Катализатор для жидкофазной конверсии биовозобновляемого сырья и способ его получения

Изобретение относится к области создания новых каталитически активных материалов, в частности материалов, содержащих в своем составе каталитически активные центры различной природы. Изобретение касается катализатора для жидкофазной конверсии биовозобновляемого сырья, содержащего пористый...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002698912
Дата охранного документа: 02.09.2019
07.09.2019
№219.017.c844

Способ термической обработки монокристаллов сплава fe-ni-co-al-ti-nb, ориентированных вдоль направления [001], с двойным эффектом памяти формы

Изобретение относится к области металлургии, а именно к обработке монокристаллов сплава Fe-Ni-Co-Al-Ti-Nb, и может быть использован в машиностроении, авиационной, космической промышленности, механотронике и микросистемной технике для создания исполнительных механизмов, датчиков, актюаторов,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002699470
Дата охранного документа: 05.09.2019
12.09.2019
№219.017.c9e9

Способ очистки лактида

Изобретение относится к химической промышленности, а именно к способу очистки лактида, содержащего примеси мезо-лактида, молочной кислоты и низкомолекулярных олигомеров молочной кислоты, методом перекристаллизации из серии органических растворителей, отличающемуся тем, что перекристаллизация...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002699801
Дата охранного документа: 11.09.2019
06.10.2019
№219.017.d2f2

Гранулированное комплексное удобрение и способ его получения

Изобретения относятся к сельскому хозяйству. Гранулированное комплексное удобрение состоит из гранул носителя и активного наполнителя, причем гранулы носителя изготовлены из гидросиликата кальция CaO⋅SiO⋅HO с размером 1-3 мм и развитой внутренней поверхностью до 300 м/г, в качестве активного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002702189
Дата охранного документа: 04.10.2019
02.11.2019
№219.017.dd9a

Способ получения трехслойного материала сталь х17н2 - v-4,9ti-4,8cr - сталь х17н2

Изобретение относится к области металлургии, а именно к способам получения сплавов на основе ванадия, и может быть использовано для получения высококачественных композиций на его основе с титаном и хромом, предназначенных для атомной энергетики. Способ получения трехслойного материала сталь...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002704945
Дата охранного документа: 31.10.2019
19.11.2019
№219.017.e3ae

Способ получения адсорбента для осушки содержащих влагу газов

Изобретение относится к способу получения адсорбента для осушки содержащих влагу газов. Для получения адсорбента продукт центробежной термической активации гидраргиллита (ЦТА ГГ) в щелочном растворе, сушат, размалывают, пептизируют и пластифицируют в растворе азотной кислоты, формуют полученную...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002706304
Дата охранного документа: 15.11.2019
21.11.2019
№219.017.e492

Способ хирургического устранения дефектов свода черепа

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии, и может быть использовано для хирургического лечения больных с костными дефектами свода черепа. Сверхэластичный четырехслойный сетчатый вязаный имплантат, повторяющий конфигурацию костного дефекта, выполненный из никелид-титановой нити...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002706501
Дата охранного документа: 19.11.2019
22.11.2019
№219.017.e525

Способ получения кристаллической глиоксалевой кислоты

Изобретение относится к способу получения кристаллической глиоксалевой кислоты. Способ осуществляют путем концентрирования водного раствора глиоксалевой кислоты с массовой концентрацией 50% на ротационном испарителе при остаточном давлении 15 мбар и температуре 40°С до массовой концентрации...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002706701
Дата охранного документа: 20.11.2019
29.11.2019
№219.017.e804

Способ изготовления высокочастотного транзистора с дополнительным активным полевым электродом

Изобретение относится к электронной технике и предназначено для создания мощных полевых транзисторов с затвором Шоттки и дополнительным активным полевым («Field plate» - FP) электродом. Может быть использовано в мощных СВЧ транзисторах на основе нитридных (GaN) гетероэпитаксиальных структур для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002707402
Дата охранного документа: 26.11.2019
Показаны записи 111-111 из 111.
20.02.2020
№220.018.0456

Способ моделирования нарушений коагуляционного звена системы гемостаза

Изобретение относится к медицине, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений свертывающей системы крови на фоне действия цитостатиков. Цисплатин вводят внутрибрюшинно однократно мышам по 10 мг/кг, крысам по 4 мг/кг,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002714597
Дата охранного документа: 18.02.2020
+ добавить свой РИД