×
19.01.2018
218.016.0969

Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.)

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1°С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков где недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1°С, влажности 70% в темноте. Изобретение позволяет получить каллусную культуру борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.). 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Борец бородатый – растение семейства Лютиковые (Ranunculaceae), богат дитерпеновыми алкалоидами, такими как аконитин, делькозин, ликоктонин, зонгорин и батаконин и др., кумаринами, флавоноидами, проазуленами. В народной медицине используется для лечения заболеваний ревматического происхождения и воспалений. Обладает болеутоляющим, противоопухолевым свойствами.

Известен способ получения каллусной культуры Pulsatilla taurica (статья Сидякин А.И., Мустафаева У.Ю.  Получение каллусных культур Pulsatilla taurica и их цитологический анализ // Инновации в науке / Сб. ст. по материалам XLV междунар. науч.-практ. конф. № 5 (42). Новосибирск: Изд. «СибАК», 2015, с. 43-53.) из высечек листьев проростков и ювенильных растений, полученных в культуре in vitro из семян, и высечек листьев от растений в фазу плодоношения. Способ включает ступенчатую стерилизацию исходного материала: 1 % KMnO4 (40 минут); 70% этанол (1 минута) и 3% H2O2 (5 минут), и культивирование эксплантов на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующими вариантами добавления гормонов 0,1 мг/л 2,4-Д (2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,01 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин), и 3 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л 6-БАП. Экспланты культивируют на свету или в темноте при температуре 20—24°С. Цикл выращивания культур составляет 70—90 суток.

Недостатком аналога является выбор экспланта для получения каллуса, так как известно, что для получения клеточной культуры алкалоидоносных растений, таких как борец бородатый, рационально использовать наиболее ранние ткани, в которых нет накопления алкалоидов. Несмотря на то что растение Pulsatilla taurica также относится к семейству лютиковые, как и борец бородатый, оно не содержит тех же алкалоидов, а значит, что вышеописанный способ получения каллусной культуры не подходит. Кроме того, в данном способе используется более высокая концентрация стимулятора роста, что приводит к увеличению стоимости процесса.

Известен способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) (Патент РФ 2590586, опубл.  10.07.2016, МПК C12N5/04), включающий посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м2с, отбор эксплантов 3-4-недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадка в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5–2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Недостатками известного способа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимыми этапами являются как проращивание семян в грунте, так и проведение контроля стерильности в течение 10 дней, для чего необходимы дополнительные затраты на приготовление питательных сред. Также в данном способе используются растения 3-4-недельного возраста, а для получения культуры Aconitum barbatum Patr. ex Pers рационально использовать более ранние ткани.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения каллусной культуры аконита байкальского (Еникеев А. Г., Семенов А. А., Горшков А. Г., Максимова Л. А., Копытина Т. В., Гаманец Л. В., Швецов С. Г., Пермяков А. В., Шафикова Т. Н. Культура клеток Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics 1907 перспективный источник биологически активных соединений // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. 2011. №3-1 (98).). Способ включает стерилизацию семян в 3% растворе перекиси водорода, перенос их в пенициллиновые флаконы с агаризованной средой (соли 1/2MS, без сахарозы) и помещение флаконов в холодильник (4°С) на 2,5 месяца. По истечении указанного срока флаконы с семенами переносят в темновой термостат на 26°С. Каллусную культуру получают из этиолированных проростков на солевой среде В5 с добавлением тиамина 1мг/л, пиридоксина 0,5 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозита 100 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, 2% сахарозы, агар-агар 0,8%, pH среды 5,8. Описанный способ принят за прототип изобретения.

Недостатками прототипа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимым этапом является проращивание семян в темновом термостате, для чего необходимо определенное оборудование. Также в среду для получения каллусной культуры дополнительно добавляют инозит, что увеличивает ее стоимость.

В литературных источниках способов получения каллусной ткани Aconitum barbatum Patr. ex Pers. не было найдено.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Aconitum barbatum, перспективной в качестве возможного источника алкалоидов терапевтического действия.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Aconitum barbatum включает в себя стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1ºС на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков. При этом недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1ºС, влажности 70% в темноте.

После образования каллуса проводят его отделение и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Таблица 1 – Состав питательной среды Мурасиге-Скуга, мг/л

Полученный каллус рассаживают в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста – 2,4-D и 6-БАП. Пересадку осуществляют каждые 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводят при 26±1ºС влажности – 70% в темноте.

Технический результат - получение каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.).

Пример 1

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5–1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (1,8 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Пример 2.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 – 1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (2,2 мг/л) и 6-БАП (0,8 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.

Недозрелые семена борца бородатого, в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.

Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.), включающий стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1С на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков, отличающийся тем, что недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1C, влажности 70% в темноте.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 141-150 из 179.
08.06.2019
№219.017.758a

Способ определения антикоагулянтного потенциала сосудистой стенки

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения антикоагулянтного потенциала сосудистой стенки. Для этого проводят двукратную оценку вязкостных параметров крови методом низкочастотной пьезотромбоэластографии (НПТЭГ) до и после...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002690856
Дата охранного документа: 06.06.2019
09.06.2019
№219.017.7629

Голографический способ определения характеристик оптических систем: фокусных расстояний и фокальных отрезков

Изобретение относится к оптическому приборостроению и может быть использовано в оптических системах наблюдения, регистрации изображений, оптических измерительных системах, голографических системах, при проведении испытаний оптических систем для определения бесконтактным методом характеристик...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002690974
Дата охранного документа: 07.06.2019
09.06.2019
№219.017.7634

Цифровой демодулятор двоичных сигналов с относительной фазовой манипуляцией второго порядка

Изобретение относится к области радиотехники и может быть использовано в устройствах приема цифровых информационных сигналов для цифровой демодуляции двоичных сигналов с относительной фазовой манипуляцией второго порядка (ОФМ2). Достигаемый технический результат – обеспечение высокоскоростной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002690959
Дата охранного документа: 07.06.2019
09.06.2019
№219.017.7645

Способ регистрации интегральных размерно-количественных характеристик планктона

Изобретение относится к океанологическим исследованиям и предназначено для проведения исследований планктона путем фиксации исследуемого объема импульсами когерентного оптического излучения. В способе регистрации интегральных размерно-количественных характеристик планктон при перемещении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002690976
Дата охранного документа: 07.06.2019
13.06.2019
№219.017.8126

Способ получения пористой керамики с бимодальным распределением пористости

Изобретение относится к технологии получения пористого материала из ультрадисперсного оксидного керамического порошка и добавок-порообразователей и может быть использовано для получения фильтрующих керамических материалов или материалов медицинского назначения. Технический результат - получение...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002691207
Дата охранного документа: 11.06.2019
15.06.2019
№219.017.837f

Способ получения сплава на основе ванадия с добавлением ti и cr в вакуумной дуговой печи

Изобретение относится к области специальной металлургии и может быть использовано для получения высококачественных сплавов на основе ванадия, содержащих не более 10 мас.% титана и хрома в соотношении 0,8-1,2. В качестве исходных шихтовых материалов используют порошки ванадия, титана и хрома...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002691445
Дата охранного документа: 13.06.2019
19.06.2019
№219.017.8418

Способ биоиндикации экологического состояния акватории посредством мониторинга планктона

Изобретение относится к области экологии и охране окружающей среды и может быть использовано для наблюдения за экологическим состоянием акваторий с помощью биоиндикаторов, например планктона. В водной среде с взвешенными частицами передают в выбранном направлении коллимированный поток...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002691553
Дата охранного документа: 17.06.2019
20.06.2019
№219.017.8d65

Комплексное лекарственное средство в таблетированной форме для коррекции синдрома повышенной вязкости крови

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к таблетированному лекарственному средству для лечения синдрома повышенной вязкости крови. Таблетированное лекарственное средство для лечения синдрома повышенной вязкости крови, включающее густой экстракт надземной части манжетки...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002691936
Дата охранного документа: 19.06.2019
20.06.2019
№219.017.8d6a

Способ лечения цирроза печени в эксперименте

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть применимо для лечения цирроза печени в эксперименте стимуляцией репаративной регенерации. Осуществляют дистрофирующее защемление на время репарации маргинального участка печени клипсой, выполненной в виде двух сомкнутых,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002691913
Дата охранного документа: 18.06.2019
16.08.2019
№219.017.c062

Фотовозбуждаемый лазерный интегрально-оптический сенсор

Изобретение относится к области измерительной техники и касается фотовозбуждаемого лазерного интегрально-оптического сенсора. Сенсор состоит из источника возбуждения, прозрачной подложки, тонкопленочной лазерно-активной среды, чувствительного слоя, оптических элементов вывода излучения. При...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002697435
Дата охранного документа: 14.08.2019
Показаны записи 111-111 из 111.
20.02.2020
№220.018.0456

Способ моделирования нарушений коагуляционного звена системы гемостаза

Изобретение относится к медицине, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений свертывающей системы крови на фоне действия цитостатиков. Цисплатин вводят внутрибрюшинно однократно мышам по 10 мг/кг, крысам по 4 мг/кг,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002714597
Дата охранного документа: 18.02.2020
+ добавить свой РИД