СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и может быть использовано для прогноза развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии.

Внебольничная пневмония (ВП) - это заболевание, которое характеризуется высокой распространенностью, большой летальностью и серьезными затратами на медицинскую помощь. Согласно данным официальной статистики РФ в 2012 году в России было зарегистрировано 657643 случая внебольничной пневмонии, что составило 4,59%; у лиц в возрасте 18 лет и старше заболеваемость составила 3,84%. Летальность среди больных с тяжелой пневмонией составляет от 21 до 58% [8]. Поэтому представляется весьма актуальной и своевременной разработка методов прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии, что позволило бы оптимизировать лекарственную терапию и улучшить исходы при данной патологии.

Известны способы прогноза развития таких осложнений пневмонии у военнослужащих, как инфекционно-токсический шок (ИТШ), острая дыхательная недостаточность (ОДН) и острая почечная недостаточность (ОПН) [2]. Прогноз ИТШ включает оценку клинической картины заболевания при поступлении больного, включая выявление маркеров ИТШ, и последующий анализ признаков, косвенно свидетельствующие о вероятности развития данного осложнения: характер дебюта ВП, нарушения сознания, наличие одышки, цвет кожных покровов, артериальное давление. Прогноз ОДН осуществляется путем оценки комплекса признаков: выраженность лихорадки, физикальная картина над пораженными сегментами легкого, гемодинамические показатели, данные рентгенологического исследования органов грудной клетки. Прогноз ОПН выполняется с учетом следующих признаков: нарушение сознания, выраженность лихорадки и гемодинамические показатели. Недостатками известных способов являются раздельные для каждого осложнения алгоритмы, разработанные только для мужчин, проходящих военную службу по призыву в возрасте от 18 до 22 лет, а также отсутствие возможности прогноза других осложнений внебольничной пневмонии (абсцесс, сепсис и др.).

Известен способ прогноза развития осложнений пневмонии, включающий оценку пяти параметров анамнеза (время от манифестации заболевания до обращения за медицинской помощью; стаж курения; частота госпитализаций и острых респираторных вирусных инфекций; наличие хронических очагов инфекции верхних дыхательных путей, ротовой полости, герпетическая инфекция; наличие сопутствующих заболеваний) по пятибалльной шкале с последующим расчетом прогностической вероятности развития осложнений пневмонии по математическому уравнению [3]. Недостатком известного способа является отсутствие учета активности воспалительной реакции и реактивности иммунной системы у больных пневмонией.

Наиболее близким аналогом является способ прогнозирования развития осложнений у больных внебольничной пневмонией, включающий измерение уровней прокальцитонина (ПКТ, пг/мл), фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-α, пг/мл), С-реактивного белка (СРБ, мг/л) в сыворотке крови и интегральную оценку показателей путем решения дискриминантного уравнения [4]. Недостатком способа является невысокий уровень совпадения (87,1%). Кроме того, все исследуемые параметры являются показателями воспалительного процесса с бактериальной этиологией и напрямую не характеризуют реактивность клеток иммунной системы - непосредственных участников воспаления.

Задачей изобретения является создание информативного способа раннего прогнозирования развития осложнений при лечении внебольничной пневмонии.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что до начала терапии, в течение первых суток после постановки диагноза, с помощью биолюминесцентного метода в нейтрофилах крови больных определяют активности ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Затем рассчитывают коэффициент пластического и энергетического обмена (КПЭО), представляющий собой отношение активности Г6ФДГ к активности ЛДГ. При значении КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений в течение двух недель антибиотикотерапии.

Значение 0,34 получено опытным путем, на основании сопоставления рассчитываемого КПЭО и данных последующего наблюдения за клиническим состоянием больных внебольничной пневмонией в течение 2-х недель стандартного лечения. Значение КПЭО ниже 0,34 свидетельствует о снижении уровня оттока субстратов на пластические процессы внутриклеточного метаболизма нейтрофилов и превалировании энергетических реакций, следствием чего может явиться недостаточность реакций макромолекулярного синтеза (гликопротеидов, полинуклеотидов и т.д.) и синтеза супероксид-радикала, активация перекисных процессов и, соответственно, понижение функциональной активности нейтрофилов.

Нейтрофильные гранулоциты представляют собой высокореактивное звено в иммунной системе. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления, от их фагоцитарной активности во многом зависит эффективность противомикробной защиты организма [5, 9]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, нейтрофилы модулируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Активированные нейтрофилы сами становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Это связано с тем, что нейтрофильные гранулоциты способны не только в качестве эффекторов продуцировать цитотоксические молекулы, но и, как регуляторные клетки, синтезировать широкий спектр различных цитокинов [6]. Функциональная активность нейтрофилов во многом определяется состоянием их внутриклеточной метаболической системы. Именно через метаболическую систему реализуется регуляторное действие ряда различных веществ, в том числе и антигенов. К числу параметров, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести несколько дегидрогеназ.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо-5-лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [1]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.

Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД. ЛДГ занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД. В случае избытка НАДН в цитоплазме ЛДГ восстанавливает пируват до лактата, который затем удаляется из клетки (анаэробная реакция ЛДГ). В то же время при активации аэробных процессов ЛДГ может окислять лактат до пирувата с образованием НАДН (аэробная реакция ЛДГ) [1].

Способ осуществляют следующим образом.

У больных до начала терапии в первые сутки после постановки диагноза внебольничной пневмонии забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином в количестве 2 мл. Выделяют нейтрофилы. Центрифугируют в двойном градиенте плотности фиколл-верографина: ρ=1,077 г/см³ - для отделения лимфоцитов; ρ=1,119 г/см³ - для выделения нейтрофилов. Подсчитывают количество нейтрофилов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофилов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активности Г6ФДГ и ЛДГ нейтрофилов одним из известных способов, например биолюминесцентным [7]. Для этого суспензию выделенных нейтрофилов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, разрушают путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0-2,0 мМ дитиотреитола. Затем непосредственно определяют активности ферментов Г6ФДГ и ЛДГ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных нейтрофилов. Конкретные значения концентраций субстратов и коферментов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

После инкубации исследуемых проб при 37°С в течение 30 минут к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН : ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1М К⁺, Na⁺-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биолюминометра, например, марки "БЛМ-8803" измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные субстратный фон ферментов. Определяют в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активностей исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДН и НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДН или НАДФН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАД(Ф)Н : ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят для каждого рН буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле:

А=Δ[С]×V/Т,

где А - активность фермента, Е на 1×10⁴ нейтрофилов (1E=1 мкмоль/мин [1]);

Δ[С] - разница концентраций НАДН или НАДФН в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

Т - время инкубации, мин.

Затем по активности дегидрогеназ рассчитывают величину КПЭО как соотношение активностей ферментов Г6ФДГ и ЛДГ, то есть КПЭО=А_Г6ФДГ/А_ЛДГ. При КПЭО ниже 0,34 прогнозируют развитие осложнений у больных внебольничной пневмонией в течение 2-х недель антибиотикотерапии.

Данный способ апробирован на 72 больных внебольничной пневмонией, поступивших на лечение в пульмонологическое отделение МБУЗ «Городская клиническая больница №20» г. Красноярска. Диагноз устанавливался согласно Российским национальным рекомендациям по внебольничной пневмонии (2010), ATS/IDSA (2005, 2007 гг.) [8]. По результатам обследования предлагаемым способом у 46 больных прогнозировалось отсутствие осложнений в течение 2-х недель антибиотикотерапии. Величина КПЭО у них составляла 0,34-454,32 (0,34 и выше). У 26 больных прогнозировалось развитие осложнений в течение 2-х недель антибиотикотерапии. Величина КПЭО у них составляла 0,01-0,33 (ниже 0,34). Результаты обследования представлены в табл. 2.

Все больные в течение двух недель получали парентеральные формы защищенных аминопенициллинов в сочетании с макролидными антибиотиками внутрь или парентерально. У 46 больных течение пневмонии протекало без осложнений с последующим выздоровлением, у 26 больных пневмония осложнилась, а именно острой дыхательной недостаточностью (n=9), абсцессом легкого (n=8), сепсисом (n=1), легочным кровотечением (n=4), плевритом (n=4). Таким образом, отмечено совпадение прогноза у 100% наблюдаемых больных.

Клинический пример 1. Больной К., 42 лет, поступил в стационар с диагнозом: внебольничная пневмония средней степени тяжести.

Проведено исследование заявленным способом. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в первые сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 0,46 мкЕ; активность ЛДГ - 2,18 мкЕ. Величина КПЭО у больного составила 0,21 (ниже 0,34), что дало основание прогнозировать развитие осложнений внебольничной пневмонии в течение 2-недельного периода антибиотикотерапии. На 2-й неделе лечения у больного развился абсцесс в нижней доле левого легкого.

Клинический пример 2. Больная М., 35 лет, диагноз при поступлении: внебольничная нижнедолевая полисегментарная пневмония левого легкого, тяжелое течение.

Проведено исследование заявленным способом. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в 1-е сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 18,46 мкЕ, активность ЛДГ - 4,27 мкЕ. Значение КПЭО у больной составило 4,32 (выше 0,34), что дало основание прогнозировать отсутствие осложнений внебольничной пневмонии в течение периода лечения. Прогноз совпал. Пневмония протекала без осложнений.

Клинический пример 3. Больной Н., 31 год, госпитализирован с тяжелой внебольничной пневмонией нижней доли левого легкого. С помощью биолюминесцентного метода, проведенного в 1-е сутки после постановки диагноза, определены: активность Г6ФДГ в нейтрофилах крови - 1,01 мкЕ, активность ЛДГ - 19,85 мкЕ. Значение КПЭО у больного составило 0,05 (ниже 0,34), что дало основание прогнозировать развитие осложнений внебольничной пневмонии в течение 2-недельного периода антибиотикотерапии. В течение первой недели, несмотря на активную антибактериальную терапию, у больного прогрессировал процесс в правом легком полисегментарного характера с развитием клиники сепсиса.

Технический результат предлагаемого способа:

- возможность раннего прогнозирования (в течение первых суток после постановки диагноза) исхода лечения больных внебольничной пневмонией;

- высокий уровень достоверности прогноза - 100%;

- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (2 мл);

- возможность своевременной профилактики развития осложнений на фоне антибиотикотерапии внебольничной пневмонии.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет в ранний период заболевания определить риск развития осложнений и может быть рекомендован для применения в клинической практике.

Источники информации

1. Биохимия. Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2004. - 784 с.

2. Борисов И.М., Шаповалова Т.Г. Прогнозирование развития осложнений внебольничной пневмонии у военнослужащих // Казанский медицинский журнал. - 2012. - Т. 93, №6. - С. 864-870.

3. Патент РФ №2290075. Способ прогноза развития осложнений пневмонии / Калинина Е.П., Романченко Е.А., Журавская Н.С., Кузьмин А.П. // Опубл. 27.12.2008.

4. Патент РФ №2444017. Способ прогнозирования развития осложнений у больных внебольничной пневмонией / Кочегарова Е.Ю., Колосов В.П., Нарышкина С.В. // Опубл. 27.02.2012.

5. Савченко А.А., Борисов А.Г. Основы клинической иммунометаболомики. Новосибирск: Наука, 2012. 263 с.

6. Савченко А.А., Здзитовецкий Д.Э., Борисов А.Г. Иммунометаболические нарушения при распространенном гнойном перитоните. - Новосибирск: Наука, 2013. - 142 с.

7. Савченко А.А. Определение активности NAD(P)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах биолюминесцентным методом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159, №5. - С. 656-660.

8. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С, Авдеев С.Н., Тюрин И.Е., Руднов В.А., Рачина С.А., Фесенко О.В. Клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике тяжелой внебольничной пневмонии у взрослых. - Москва, 2014. - 92 с.

9. Wright H.L., Moots R.J., Bucknall R.C., Edwards S.W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases // Rheumatology (Oxford). 2010. V. 49. №9. P. 1618-1631.