Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД НЕФТЕПЕРЕРАБАТЫВАЮЩИХ И НЕФТЕХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ ОТ ТОЛУОЛА

Изобретение относится к способам обезвреживания или уменьшения вредности химических отравляющих веществ путем их химического изменения биологическими способами, т.е. способами с использованием ферментов или микроорганизмов.

Известны различные штаммы микроорганизмов, способные разлагать органические соединения [патент РФ №2064017, RU 2157842 C1, RU 2157839 C1, RU 2142997 С1, 2127310 С1], предлагающий штамм бактерии Burkholderia caryophylli Jap-3, обладающий высокой нефтеокисляющей активностью в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов.

Известен способ очистки концентрированных сточных вод, содержащих ароматические углеводороды и их производные, пероксиды и альдегиды, путем аэробной обработки штаммами бактерий Pseudomonas sp.ВКПВ-3893 и Rhodococcus sp. ВКЛМВ-3892 [патент РФ №2048454 A1, SU 981247, RU 1686799 C1, RU 2084404 C1, RU 833551, WO 0132561].

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д, продуцирующий поверхностно-активные вещества, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти. Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами и углеводородов нефти [патент РФ №2344170].

Существенным недостатком вышеперечисленных способов является невозможность применения для очистки промышленных сточных вод с высоким содержанием конкретного целевого загрязнителя (в частности толуола).

Задачей данного изобретения является разработка способа очистки промышленных сточных вод от целевого загрязнителя - толуола.

Поставленная задача решается следующим образом. Преимуществом штамма-деструктора Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715 (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика, дата депонирования 09 февраля 2015 г.) является его способность роста на обедненных синтетических питательных средах и высокая степень деградации толуола в сточных водах нефтехимических производств. Изобретение позволяет повысить эффективность деструкции толуола. Полная очистка от толуола осуществляется за 48 часов.

Таксономическая характеристика:

Тип Proteobacteria, класс Gammaproteobacteria, порядок Pseudomonadales, семейство Pseudomonadaceae, род Pseudomonas, вид Pseudomonas japonica.

Морфологическая характеристика:

Грамотрицательная, подвижная, неспорообразующая прямая палочковидная бактерия, движение осуществляется посредством полярного жгутика - мультитрихии, размеры клетки 2.0-3.5×1.3-1.7 мкм.

Культуральная характеристика:

Колонии круглые, плоские, непрозрачные, белого кремового до светло-желтого цвета со слегка раскидистыми краями, на питательном агаре пиоцианин и флуоресцентные пигменты не продуцирует.

Ниже указаны диапазоны температур, определяющие активность бактерии:

- ниже 4°С - гибнет;

- от 4 до 30°С - жизнедеятельность замедляется;

- от 30 до 37°С - растет, размножается;

- от 37 до 42°С - жизнедеятельность замедляется;

- выше 42°С - гибнет;

Люминесцирующая, обнаружена продукция пигмента, на агаризованной среде образует видимые колонии в течение 3 дней при 30°С.

Биохимическая характеристика:

Положительные реакция на оксидазу и каталазу.

В качестве единственного источника углерода для роста может использовать следующие субстраты: глюкоза, малат, цитрат, фенил-ацетат, D-ксилоза и D-фукоза, альфа-циклодекстрин, гликоген, Твин 40, Твин-80, L-арабиноза, D-фруктоза, L-фукоза, мальтоза, бета-метил-D-глюкозид, уксусная кислота, лимонная кислота, муравьиная кислота, D-глюкуроновая кислота, бета-оксимасляная кислота, п-гидроксифенил уксусной кислоты, D-молочная кислота, L-молочная кислота, малоновая кислота, пропионовая кислота, хинная кислота, янтарная кислота, D-аланин, L-аланин, L-аланил-глицина, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутаминовая кислота, глиц-L-аспарагиновая кислота, L-серин и D-карнитин, L-карнитин, G-аминомасляная кислота, инозин, уридин, фенилэтиламин, путресцин, глицерол, глюкоза-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат, а также широкий спектр паразамещенных алкилфенолов с прямой цепью, а именно от 1 до 9 атомов углерода.

Продуцирует следующие ферменты: протеазы, эстеразы (С₄), эстеразы липазы (C₈), липазы (С₁₄), лейцин, валин, фосфатазы и нафтол-а-бифосфогидролазы.

Отрицательная реакция на уменьшение нитратов, денитрификации, продукцию аргинина дигидролазы, щелочной фосфатазы, трипсина, усвоение арабинозы, маннозы, маннита, L-арабинозы, рибозы, 2-кето-глюконата, использование декстрина, D-галактозы, D-галактуроновой кислоты, гамма-оксимасляной кислоты, 2,3-бутандиола, альфа-глицерол фосфата.

Экология: бактерия выделена из загрязненной почвы промышленной площадки ООО «Газпром нефтехим Салават».

Патогенность: не обнаружена.

Накопительную культуру бактерий получали из почвенных суспензий, которые были приготовлены из образцов грунта согласно таблице 1. Для этого образец массой 1,0-1,5 г помещали в колбу с 50 см³ 0,1 М раствора хлорида натрия и помещали в термостатированный шейкер на 24 часа при температуре 27°С и скорости вращения 170-180 об/мин для культивирования.

Через 24 часа визуально оценивали рост бактерий (при наличии бактерий на внутренней поверхности колбы обнаруживается нарост в виде концентрического ободка).

С целью получения бактерий-деструкторов из исходных почвенных суспензий отбирали по 1 см³ аликвоты и помещали ее в жидкую минеральную среду, содержащую целевой загрязнитель, что позволило выделить только те виды, которые способны выживать в присутствии целевого загрязнителя. Состав минеральной среды представлен в таблице 2.

После культивирования в течение 24 часов в жидкой минеральной среде с добавлением загрязнителя снова производились визуальная оценка роста бактерий и пересев полученной культуры на твердую минеральную среду того же состава, что и жидкая, но с добавлением (2% об.) агара.

В результате инкубации в течение 48-72 часов в зависимости от скорости роста бактерий на твердой питательной среде обнаруживался рост колоний.

В ходе предварительных испытаний оценка деструктирующей способности выделенных микроорганизмов проводилась на модельных смесях, приготовленных с соответствующей концентрацией толуола в аналогичных технологических стоках.

В колбы объемом 500 см³ помещали по 200 см³ очищаемых стоков, содержащих различные загрязнения. Туда же добавляли 50 см³ суточной бактериальной суспензии соответствующего изолята. Для обеспечения аэрации в водную среду подавался воздух с расходом 0,04 л/мин. Процесс проводился при температуре 27°С и скорости вращения 120 об/мин (данные параметры оптимальны для поддержания жизнеспособности микроорганизмов).

Для достоверности результатов эксперимента опыты двукратно дублировались, с применением носителя (эксперимент №1) и без носителя (эксперимент №2). Иммобилизацию бактериальных клеток проводили на нефтяной кокс (в каждую колбу загружали по 65-70 г кокса), который предварительно прокаливали при температуре 250-300°С с целью исключения возможности развития посторонней микрофлоры. Иммобилизацию проводили в течение суток при условиях постоянного перемешивания кокса с бактериальной суспензией при 27°С и 100-120 об/мин.

Пример 1. Очистка сточной воды производства этилбензола и стирола в условиях иммобилизованных бактериальных клеток на твердый носитель в виде кокса (эксперимент №1) и в условиях неиммобилизованных клеток

Концентрация бактериальной суспензии Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715 составила 10⁶ кл/см³, содержание толуола составило не более 50 мг/дм³.

Результаты проведенных экспериментов представлены на фигуре 1.

Как видно на фигуре 1, снижение содержания толуола происходит как в условиях иммобилизации бактериальных клеток, так и без нее. Однако во втором варианте наблюдается очевидное снижение содержания толуола 50 до 5 мг/дм³. При иммобилизации же часть бактериальных клеток остается на носителе, поэтому для деструкции необходимо, чтобы молекула толуола попала на носитель, где есть бактериальные клетки.

Пример 2. Деструктирующая способность штамма Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715 при различных температурах

Для эффективной деструкции толуола штаммом Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715 был проведен эксперимент по подбору оптимальной температуры, при которой превращение толуола была бы максимальной. Результаты эксперимента представлены на фигуре 2.

Как видно на фигуре 2, максимальная деструкция толуола при концентрации его в стоке, равной 354 мг/дм³, наблюдалась при температуре 27°С.

Согласно представленным в таблице 3 данным содержание толуола в сточной воде после биологической очистки в условиях иммобилизации бактериальных клеток Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715 снизилось на 24% масс., тогда как в условиях отсутствия иммобилизации данный показатель составил 90% масс. Исходя из полученных результатов, рекомендуется проводить биологическую очистку толуолсодержащих сточных вод в условиях не иммобилизованных бактериальных клеток Pseudomonas japonica ВКПМ В-11715.