СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ФОКАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, неврологии и нейрохирургии и может быть использовано при создании экспериментальной модели нарушения мозгового кровообращения в бассейне средней мозговой артерии при ишемическом инсульте. Моделирование ишемии головного мозга может быть использовано для изучения патогенеза цереброваскулярных расстройств, разработки новых терапевтических стратегий и доклинической апробации лекарственных препаратов для профилактики и лечения ишемического инсульта головного мозга [Суфианова Г.З., Шапкин А.Г. Повреждение нервной ткани: механизмы, модели, методы оценки М.: Издательство РАМН, 2014 288 с.].

Известен способ моделирования ишемии мозга путем перевязки сонных артерий и геморрагической гипотензии [Hoffman W.E., Kochs Е., Werner С., Thomas С., Albrecht R.F. Dexmedetomidine improves neurologic outcome from incomplete ischemia in the rat. Reversal by the alpha 2-adrenergic antagonist atipamezole. // Anesthesiology, 1991. - 75(2). - p. 328-332]. Недостатком этого способа является низкая воспроизводимость ишемии в связи с хорошим развитием артерий Вилизиева круга у крыс. Кроме того, этот способ далек от клинических условий развития ишемического инсульта.

Известен способ моделирования ишемии мозга путем перевязки правой общей сонной, при этом дополнительно осуществляют перевязку обеих позвоночных артерий для снижения общего мозгового кровотока [Pulsinelli W.A., Brierley J.B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. // Stroke., 1979. - 10(3). - p. 267-272]. Недостатком этого метода является сложность доступа к позвоночным артериям и необходимость использовать оптические приборы при проведении операции. Также этот способ далек от реальных условий развития ишемического инсульта. Данный способ сопровождается глобальным нарушением мозгового кровообращения и приводит к высокой летальности экспериментальных животных.

Одним из наиболее близких является способ моделирования фокальной ишемии головного мозга путем клипирования общей сонной артерии и введения через бифуркацию общей сонной артерии во внутреннюю сонную до средней мозговой артерии специального окклюдера изготовленного из нейлоновой нити с силиконовым наконечником. Окклюдер фиксируют клипированием внутренней сонной артерии [Nagasawa Н., Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model cerebral artery occlusion // Stroke, 1989. - 20. - p. 1037-1043]. Данный способ приводит к развитию фокальной ишемии головного мозга за счет нарушения кровообращения в бассейне средней мозговой артерии. Данная модель используется для моделирования нарушения мозгового кровообращения в бассейне средней мозговой артерии при инсультах и транзиторных ишемических атаках. Недостатками данного способа являются: высокая травматичность, связанная с тем, что, при проведении синтетической жесткой нейлоновой нити, возможно повреждение внутричерепных сосудов и структур головного мозга с развитием внутричерепного кровоизлияния; и низкая воспроизводимость результатов ишемии головного мозга, связанная со сложностью индивидуального подбора окклюдера для каждого отдельного животного, вследствие чего при моделировании ишемии с использованием данного способа не отмечается тотальной внутрисосудистой окклюзии средней мозговой артерии, а фокальные ишемические изменения головного мозга при гистологическом исследовании у экспериментальных животных на данной модели выявляются только у 70% крыс.

Целью настоящего изобретения является снижение травматичности и повышение воспроизводимости способа моделирования фокальной ишемии головного мозга.

Технический результат достигается путем перевязки наружной сонной артерии, введения через общую сонную артерию во внутреннюю сонную до средней мозговой артерии окклюдера, изготовленного из монофиламентного синтетического рассасывающегося шовного материала на основе поликликолида и клипирования общих сонных артерий.

Технический результат способа моделирования фокальной ишемии головного мозга согласно изобретению включает введение окклюдера в среднюю мозговую артерию со стороны моделирования фокальной ишемии, отличающийся тем, что выделяют и клипируют наружную сонную и общую сонную артерии; выше места клипирования перфорируют стенку общей сонной артерии и по ходу общей и внутренней сонных артерий к средней мозговой артерии вводят окклюдер, изготовленный из монофиламентного синтетического рассасывающегося шовного материала на основе поликликолида, затем клипируют общую сонную артерию с противоположной стороны.

Структура материала на основе поликликолида обеспечивает незначительное набухание и постепенное размягчение окклюдера при контакте с кровью, что позволяет предупредить повреждение сосудистой стенки при интравазальном введении окклюдера, при этом размягченный дистальный конец окклюдера в процессе моделирования легко повторяет изгибы внутренней сонной артерии в полости черепа. В отличии от других рассасывающихся материалов, способных набухать при контакте с кровью, синтетический материал на основе полигликолида не вызывает местной аллергической и воспалительной реакции. К преимуществам предложенного метода относится также легкость изготовления окклюдера, стандартность предлагаемого окклюдера не требует индивидуального подбора окклюдера нужного диаметра для каждого экспериментального животного. Введение окклюдера через общую сонную, и фиксация окклюдера путем клипирования общей сонной артерии в отличии от прототипа, в котором производится введение окклюдера через бифуркацию общей сонной артерии и фиксация окклюдера путем клипирования внутренней сонной артерии, вследствие высокого и не всегда типичного расположения бифуркации общей сонной артерии у экспериментальных животных, а также глубокого расположения внутренней сонной артерии облегчает и уменьшает травматичность хирургического доступа к брахиоцефальным артериям, уменьшает вероятность массивного кровотечения. Клипирование наружной сонной артерии со стороны окклюзии предотвращает ложное введение окклюдена в наружную сонную артерию, что облегчает моделирование фокальной ишемии головного мозга. Клипирование общей сонной артерии с противоположной стороны позволяет снизить перфузию головного мозга и дополнительно увеличивает воспроизводимость модели. Клипирование артерий в отличие от перевязки позволяет моделировать транзиторную ишемию головного мозга, что приближает модель к реальной клинической картине развития ишемического инсульта у человека. Указанные признаки позволяют снизить суммарные финансовые расходы при моделировании ишемии головного мозга.

Способ осуществляется следующим образом. У экспериментального животного осуществляется доступ к общим сонным артериям. С этой целью рассекают мягкие ткани передней поверхности шеи срединным разрезом. Выделяют общие сонные и наружную сонную артерии со стороны предполагаемой окклюзии (слева или справа по усмотрению исследователя). Клипируют постоянной клипсой наружную сонную артерию со стороны окклюзии для предупреждения проведения окклюдера в этот сосуд и развития кровотечения через анастомозы при введении окклюдера. Клипируют постоянной клипсой общую сонную артерию со стороны окклюзии (для предупреждения кровотечения ниже места введения окклюдера в общую сонную артерию). Иглой с круглым сечением выполняют перфорацию стенки общей сонной артерии со стороны окклюзии чуть выше места перевязки. Через вкол в общую сонную артерию вводят окклюдер, который медленно, для предупреждения повреждения сосуда в месте бифуркации, проводят на глубину 15-20 мм по ходу общей и внутренней сонных артерий к средней мозговой до ощущения затруднения дальнейшего продвижения. Окклюдер фиксируют в сосуде путем наложения временной клипсы на общую сонную артерию выше места перфорации стенки сосуда. Дополнительно, с целью снижения общей перфузии головного мозга и повышения воспроизводимости модели выполняют временное или постоянное клипирование общей сонной артерии с противоположной, стороны. В случае моделирования транзиторной фокальной ишемии головного мозга через определенное время, например через 30 минут, окклюдер извлекается, выше места прокола стенки сосуда и введения окклюдера производится наложение постоянной клипсы на общую сонную артерию, также снимается клипса с общей сонной артерии противоположной стороны. Рану ушивают в обратном порядке.

Окклюдер изготавливается из синтетического рассасывающегося монофиламентного шовного материала на основе поликликолида, например из шовного материала Caprosyn. Для крыс весом 150-300 г оптимальной нитью является Caprosyn 5.0. Нить нарезают на фрагменты по 30 мм. Для удобства оценки глубины введения окклюдера, на нарезанных фрагментах нити можно с использованием красящего вещества установить отметки, фиксирующие определенную дистанцию, например 20 мм.

Предложенный способ моделирования фокальной ишемии головного мозга поясняется графическим материалом.

На фигуре 1 представлена схема расположения окклюдера в сосудистом русле, где: 1 - общая сонная артерия; 2 - наружная сонная артерия; 3 - внутренняя сонная артерия; 4 - a. ophthalmica; 5 - передняя мозговая артерия; 6 - средняя мозговая артерия; 7 - окклюдер. Пример конкретного применения способа.

Эксперимент выполнен на 18 крысах обоего пола, весом 150-200 г. Все инвазивные процедуры проводили под достаточным обезболиванием (золетил - 100 в дозировке 5 мг/кг, внутримышечно). Все экспериментальные животные были разделены на 3 основные группы. В первой (основной) группе (N=8) моделировали ишемию головного мозга по предложенному способу путем интравазального введения окклюдера из синтетического монофиламентного рассасывающегося шовного материала на основе поликликолида Caprosyn 5.0 в левую среднюю мозговую артерию на глубину 15 мм. Через 30 минут окклюдер извлекался, на левую общую сонную артерию накладывалась постоянная клипса. Рана ушивалась в обратном порядке. Во второй (контрольной) группе (N=5) в качестве окклюдера использовалась нейронная нить с силиконовым наконечником. Окклюдер вводился через бифуркацию общей сонной артерии во внутреннюю сонную артерию до средней мозговой артерии. Условия моделирования ишемии головного мозга у данной группы крыс соответствовали прототипу. В третьей (ложнооперированной) группе (N=5) производилась только постоянное клипирование левой общей сонной артерии, без введения окклюдера.

На 3 сутки проводилась оценка неврологического статуса крыс по 4-бальной шкале (0 - норма, 1 - умеренный гемипарез, 2 - выраженный гемипарез, 3 - грубая неврологическая симптоматика). Крысы забивались через 72 ч. Для световой микроскопии мозг крысы фиксировали в 96% этиловом спирте. Парафиновые срезы окрашивали метиленовым синим, гематоксилин-эозином и по методу Ниссля.

Клинически у всех ишемизированных крыс основной (первой) группы выявлялся птоз на стороне поражения, признаки нарушения кровоснабжения тканей глазного яблока с соответствующей стороны, гиподинамия, гемипарез, атаксия. Неврологические изменения у ишемизированных крыс данной группы варьировали от 1 до 3 баллов. Средний неврологический балл составлял 2,1±0,2. У крыс контрольной группы неврологические изменения были выявлены только у 3 крыс из 5. Средний неврологический балл у животных данной группы составлял 1,2±0,5 (Р<0,05 в сравнении с основной группой). В ложнооперированной серии неврологический дефицит транзиторно отмечался только у одного животного в первые сутки после операции. Гистопатологические ишемические изменения у крыс основной группы были обнаружены во фронтопариетальных отделах коры и медиальных отделах хвостатого ядра левой гемисферы и варьировали от гибели единичных нейронов до формирования крупноочаговых инфарктов с поражением 50% объема хвостатого ядра. При всех типах повреждений нейроны подвергались коагуляционному некрозу с потерей отростков, гомогенизацией и хроматолизом цитоплазмы, пикнозом ядер, растворением глыбок базофильного вещества Ниссля и в итоге превращением в клетки - тени. Отмечалась распространенная нейрофагия, отек перецеллюлярного и переваскулярного пространств. В случаях формирования крупноочаговых инфарктов в зону некроза было вовлечено и белое вещество.

Гистопатологические изменения были выявлены у всех крыс основной группы и коррелировали с выраженностью неврологического дефицита. У крыс контрольной группы гистопатологические изменения были обнаружены у 75% животных. В двух случаях отмечалось наличие признаков кровоизлияния в базальных отделах левой лобной области, что является признаком повреждения сосудов при проведении нейлонового окклюдера. Данный факт снижает достоверность полученных результатов в контрольной группе. В ложнооперированной серии гистологических нарушений выявлено не было.

На примере ложнооперированной серии показано, что постоянное клипирование общей сонной артерии не сопровождается у крыс выраженными клиническими и гистопатологическими нарушениями. У крыс контрольной группы, которым осуществлялось моделирование фокальной ишемии головного мозга с использованием нейлоновой нити с силиконовым наконечником, в соответствии с прототипом изобретения были получены сомнительные клинические результаты, отмечалась высокая частота травматического повреждения сосудов головного мозга при проведении окклюдера и отмечалась низкое воспроизведение модели.

Таким образом, предлагаемый способ моделирования фокальной ишемии головного мозга позволяет максимально приблизить модель к естественным условиям развития ишемического инсульта в бассейне средней мозговой артерии, обеспечить высокую воспроизводимость и снижение травматичности при проведении эксперимента. Предложенный способ моделирования фокальной ишемии головного мозга отвечает критериям новизны, изобретательского уровня и промышленной применимости в плане разработки новых терапевтических стандартов и доклинической апробации новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения ишемического инсульта головного мозга.