Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней.

Известен способ термохимической дезинфекции животноводческих помещений при ликвидации африканской чумы, в котором предварительную механическую очистку помещений и их герметизацию, подачу дезинфицирующего раствора с помощью мобильной газотурбинной установки «Аист-2М» путем распыления дезинфектанта, выдерживание экспозиции обеззараживания, при этом осуществляют герметизацию целлофановой пленкой всего дезинфицируемого корпуса, затем с помощью мобильной газотурбинной установки «Аист-2М» нагревают корпус внутри до температуры не менее 75°C и подают дезинфицирующий раствор 37%-ного раствора формальдегида с температурой не менее 70°C в течение 10-15 мин из расчета 10-15 мл/м³, выдерживают экспозицию обеззараживания в течение трех часов.

К недостаткам данного способа относится невозможность контроля качества дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы свиней, использование в качестве дезинфектанта формалина, канцерогенность которого доказана на животных и человеке, а также применение газотурбинной установки «Аист-2М» с точки зрения ее транспортировки.

Известен способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней, в котором осуществляют выделение ДНК из биологического материала, анализ выделенного ДНК с помощью набора реагентов, обеспечивающих экстракцию нуклеиновых кислот, постановку полимеразной цепной реакции и учет результатов анализа (см. патент РФ 2360971, кл. A61BL 2/16, 2009 г. - прототип).

Недостатком известного способа является невозможность контроля качества дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы, а также значительная трудоемкость процесса и время, затраченное на взятие проб крови или органов животных.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и упрощение процесса обнаружения вируса африканской чумы свиней.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы, включающем выделение ДНК из биологического материала, анализ выделенного ДНК с помощью набора реагентов, обеспечивающих экстракцию нуклеиновых кислот, постановку полимеразной цепной реакции и учет результатов анализа, согласно изобретению в качестве биологического материала используют предварительно продезинфицированный навоз, который произвольно отбирают не менее 10 проб в навозохранилище по краям, в середине и на разной глубине в количестве не более 50 г каждая проба, затем пробы навоза гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере, переносят в пробирки объемом 1,5 мл, центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1-2 мин, отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости в дозе не более 0,1 мл используют для выделения ДНК, при этом проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и при обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней осуществляют повторную дезинфекцию всего навоза, находящегося в навозохранилище.

Новизна заявляемого способа состоит в идентификации вируса в свином навозе, используемом в качестве биологического материала, что значительно сокращает время забора проб и позволяет контролировать качество дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».

Заявляемый способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ подготовки биоматериала для контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней осуществляют следующим образом.

Отбирают пробы предварительно дезинфицированного навоза с помощью пробоотборника в навозохранилище по краям, в середине и на разной глубине массой 50 г каждая, количество - не менее 10. Данная масса каждой пробы необходима для достоверного прохождении анализа, а количество проб зависит от размера и объема хранилища. Затем пробы навоза гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков для проведения наиболее качественной идентификации вируса. После чего для качественного прохождения анализа готовят 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере, специальными дозаторами переносят в пробирки объемом 1,5 мл, изготовленные специально для центрифуги. Далее пробы подвергают центрифугированию при 12 тыс. об/мин в течение 1-2 мин, так как при меньшем времени центрифугирования не произойдет необходимого разделения фаз суспензии, а большее время центрифугирования нецелесообразно. Затем аликвоту надосадочной жидкости отстаивают и используют в дозе, необходимой для качественного исследования - не более 0,1 мл, при анализе с помощью набора реагентов «ПЦР-АЧС-ФАКТОР» http://faktor.ru/catalog/veterinasriya/produktsiaya/ptsr_asf_faktor/.ru. Анализ проводят в три этапа: экстракция нуклеиновых кислот, проведение полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, учет результатов анализа.

Пример конкретного осуществления способа

Контроль качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней осуществляют в навозохранилище ГБУ «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», в котором навозную жижу заранее дезинфицируют в соответствии с «Инструкцией о мероприятиях по предупреждению и ликвидации африканской чумы свиней» (№115-6а от 21.11.1980 г.): навозную жижу в жижесборнике смешивают с сухой хлорной известью (с содержанием активного хлора не менее 25%) из расчета 1,5 кг извести на каждые 10 л навозной жижи. Навоз в навозохранилище посыпают с поверхности сухой хлорной известью из расчета 0,5 кг/м², затем перемещают в траншею и закапывают на глубину 1,5 м. Далее с помощью пробоотборников в середине, по краям навозохранилища, и на разной глубине навозной массы, берут 10 проб по 50 г. После чего с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков навоз из проб гомогенизируют и готовят из него 10%-ную суспензию на стерильном физиологическом растворе, после чего полученную суспензию переносят в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 12 тыс. об/мин в течение 1,5 мин. Отцентрифугированную суспензию отстаивают и аликвоту надосадочной жидкости используют в дозе 0,1 мл для выделения ДНК вируса африканской чумы свиней при проведении полимеразной цепной реакции с флуоресцентным детектором в режиме реального времени.

Устанавливают пробирки в реакционный модуль прибора «Rotor-Gene 3000/6000» (Q), в котором осуществляют полимеразную цепную реакцию с флуоресцентным детектором в режиме реального времени. В соответствии с протоколом анализа прибор программируют, устанавливают параметры температурно-временного режима амплификации, детекцию флуоресцентного сигнала назначают после стации отжига праймеров, после чего начинают процесс амплификации с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов полимеразной цепной реакции непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

Учет результатов полимеразной цепной реакции проводят по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Образец считают положительным (вирус африканской чумы свиней присутствует), если наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы. Образец считают отрицательным (вирус африканской чумы свиней отсутствует), если не наблюдают рост специфического сигнала, при этом значения контрольных образцов находятся в пределах нормы.

При обнаружении хотя бы в одной из проб фрагмента генома вируса африканской чумы свиней проводят повторную дезинфекцию всего навоза, содержащегося в навозохранилище.

Таким образом, способ контроля качества дезинфекции свинарников от вируса африканской чумы свиней, позволяющий идентифицировать вирус в пробах навоза, расширяет функциональные возможности и позволяет следить за качеством дезинфекции животноводческих помещений от вируса африканской чумы свиней.