ЭТИЛ (3S,4R,5S)-4-АЦЕТАМИДО-5-АМИНО-3-(1-ЭТИЛПРОПОКСИ)ЦИКЛОГЕКС-1-ЕН-1-КАРБОКСИЛАТА ЭТОКСИСУКЦИНАТ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО ПРЕПАРАТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к новому химическому веществу этоксисукцинату этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-овой кислоты, обладающему противовирусной способностью.

Заболевания, вызванные мутирующими вирусами гриппа, становятся все более угрожающими. Для предупреждения возникновения эпидемии гриппа проводят вакцинацию населения. В качестве лекарственных средств, используемых при лечении гриппа, применяют иммуностимулирующие препараты, такие как амиксин, кагоцелл и противогриппозные препараты, воздействующие непосредственно на вирус. Это блокаторы М2-каналов римантадин и амантадин и ингибиторы нейроаминидазы фосфат осельтамивира и занамивир. Одним из наиболее близких по составу к предлагаемому препарату является фосфат осельтамивира.

Один из наиболее близких по техническому результату к предлагаемому средству является фосфат осельтамивира, который выбран в качестве препарата сравнения.

Задачей заявляемого изобретения является расширение ряда противовирусных препаратов с помощью впервые синтезированного соединения.

В патентах US 2009/0076296, WO 98/07685 упоминается о возможности применения кроме фосфата осельтамивира ряда фармацевтически приемлемых кислых солей осельтамивира, таких как: хлорид, бромид, нитрат, сульфат, цитрат, формиат, цитрат, фумарат, малонат, ацетат. В патенте WO 2007/077570 описано получение соли винной кислоты (тартарат осельтамивира). Однако физические свойства этих солей осельтамивира не описаны. В то же время, анион в солевом препарате во многом определяет растворимость соединения в воде и изменяет скорость всасываемости в желудочно-кишечном тракте и в целом биодоступность и лекарственную активность. С другой стороны, использование некоторых анионов может увеличить токсичность солевого соединения или изменить его лекарственную направленность.

Поставленная задача решается применением этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината в качестве противовирусного средства.

Этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината получают обработкой этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата основания этоксиянтарной кислотой в среде этилацетата. Продукт получен с выходом 86% в виде белых хорошо растворимых в воде кристаллов. Строение полностью подтверждено физико-химическими методами анализа.

Новое свойство предлагаемого в качестве изобретения средства явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалистов. Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Проведенные исследования позволили установить достаточно высокую противовирусную активность этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения способа получения заявляемого изобретения.

Пример 1

3,8 г этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата растворяют при 40°С в 50 мл этилацетата. Этоксиянтарную кислоту 1,99 г растворяют в 10 мл этилацетата и смешивают с приготовленным раствором осельтамивира-основания. Перемешивают 7 ч на магнитной мешалке при комнатной температуре. Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом, промывают на фильтре небольшим количеством этилацетата. Вес готового продукта 4,99 г (86%).

ЯМР ¹Н (DMSO, δ м.д., J/Гц): 8,074-8,052 (1Н, d, СН, J=7,6); 6,660 (1Н, s, СН); 4,195-4,132 (3Н, m, СН₂, СН); 3,788-3,702 (2Н, m, СН₂); 3,644-3,570 (1Н, m, СН); 2,770-2,758 (1Н, dd, J=5,2, J=12,3, J=4,9); 2,572-2,533 (1H, t, CH₂); 2,402-2,354 (1H, dd, CH₂); 2,322-2,252 (1H, m, CH); 1,875 (3H, s, CH₃); 1,084-1,049 (3H, t, CH₃); 0,856-0,771 (6H, tt, 2CH₃).

Спектр ЯМР ¹³C (DMSO, δ м.д.): 174,6 (С); 172,8 (C=O); 170,9 (C=O); 165,6 (C=O); 138,7 (C=O); 127,7 (CH); 81,6 (CH); 76,1 (CH); 74,7 (CH); 64,9 (CH); 61,1 (CH); 53,3 (2CH), 49,5 (CH₂); 29,4 (2CH₂); 26,1 (CH₂); 25,5 (CH₂); 23,6 (CH₃); 15,7 (CH₃); 14,5 (CH₃); 9,8 (CH₃); 9,4 (CH₃).

ИК: 3543,7; 2973,9; 2939,1; 2878,6; 1715,1; 1660,3; 1566,9; 1463,7; 1446,5; 1376,0; 1300,4; 1247,5; 1190,3; 1115,6; 1063,5; 1031,0; 945,7; 900,1; 861,2; 777,5; 735,0; 649,6; 555,8.

Для лучшего понимания изобретения приводим пример результатов исследования противовирусной активности заявляемого средства в сравнении с действием фосфата осельтамивира.

Пример 2

Исследование цитотоксичности и противовирусной активности этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината в сравнении с действием фосфата осельтамивира в отношении вирусов гриппа in vitro с помощью колориметрического метода.

Были проведены экспериментальные исследования по определению токсичности и противовирусной активности этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината в сравнении с действием фосфата осельтамивира в отношении двух штаммов вируса гриппа (ВГ): A/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 и A/Aichi/2/68 (H3N2), полученных из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская обл.) в перевиваемой культуре клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Оценку противовирусной активности проводили через 3 суток культивирования клеток MDCK с ВГ и препаратами. Через 3 суток инкубирования инфицированного ВГ монослоя клеток с препаратами и без препаратов в культуральную среду вносили витальный (прижизненный) краситель - нейтральный красный на 1,5 часа. После этого монослой промывали двукратно физраствором, вносили лизирующий буфер и через 30 мин на планшетном ридере «Emax» (Molecular Devices, США) определяли оптическую плотность (ОП), которая является показателем количества клеток в монослое, неразрушенных под влиянием вируса или препарата. Результаты измерения ОП в зависимости от концентрации препарата были представлены в полулогарифмической системе координат. При этом по оси абсцисс (X) приведена концентрация препаратов в логарифмической шкале измерения, а по оси ординат (Y) - ОП в линейной шкале измерения. По показателям ОП рассчитывали 50%-ную токсическую концентрацию (ТС₅₀ в мкг/мл) и 50%-ную ингибирующую (эффективную) концентрацию (IC₅₀ в мкг/мл) препарата при помощи компьютерной программы SoftMaxPro-4.0. ТС₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой разрушаются (теряют жизнеспособность) 50% клеток в монослое. IC₅₀ - это концентрация вещества в питательной среде, при которой не разрушаются (остаются жизнеспособными) 50% клеток от сохраняющих жизнеспособность при максимальном подавлении размножения вируса веществом в нетоксических концентрациях.

На основании этих показателей рассчитывали терапевтический индекс (TI) (или индекс селективности - SI) препарата: TI (SI)=ТС₅₀ мкг/мл : IC₅₀ мкг/мл [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева Р.У. М.: ОАО Издательство «Медицина». 2005; 832 с.].

Как следует из таблицы 1, ТС₅₀ для фосфата осельтамивира, равная 865,0 мкг/мл, меньше, чем для этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината (1506 мкг/мл), т.е. препарат сравнения проявляет более высокую токсичность, чем заявляемое средство.

При этом есть основания полагать, что и фосфат осельтамивира и этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината проявляют более высокую ингибирующую активность в отношении штамма ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) (IC₅₀=0,036 и 0,056 мкг/мл соответственно), чем в отношении штамма ВГ A/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 (IC₅₀=1,056 и 1,603 мкг/мл соответственно). В результате чего, в отношении штамма ВГ A/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 TI фосфата осельтамивира, равный 819,13, и этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината (939,49) имеют более низкие значения, чем в отношении штамма ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) (24028 и 26893 соответственно) (табл. 1).

Следует отметить, что этил (3S,4R,5S)-4-ацетамидо-5-амино-3-(1-этилпропокси)-циклогекс-1-ен-1-карбоксилата этоксисукцината обладал некоторыми преимуществами по сравнению с фосфатом осельтамавира: проявлял более низкую токсичность для культуры клеток MDCK (судя по ТС₅₀) и более высокую противовирусную активность (судя по TI) в отношении штаммов ВГ А/Bishkek/03/2009 (H1N1)pdm09 и A/Aichi/2/68 (H3N2) in vitro.