Способ приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом

Изобретение относится к приготовлению цитологических препаратов метафазных хромосом, применяемых в научных и клинико-диагностических исследованиях. Хромосомные аберрации лежат в основе возникновения так называемых хромосомных патологий (болезнь Дауна, болезнь Шерешевского-Тернера и др.), а также обусловливают или сопровождают во многих случаях развитие онкологических заболеваний, прежде всего гемобластозов. В настоящее время базовым подходом к оценке кариотипа при хромосомных и онкогематологических патологиях является исследование метафазных хромосом с помощью световой микроскопии (Verma R.S., Babu A. Human chromosomes. Perga-mon Press, Inc., New York. 1989. 240 p.). Успешность проведения исследования с помощью указанного метода, как и метафазного FISH-анализа, во многом определяется качеством морфологии хромосом в приготовленном препарате. К числу важнейших параметров качества хромосомных препаратов относятся площадь разброса хромосом в отдельной метафазной пластинке, частоты наложения хромосом и разрушенных метафаз. Нестабильность в достижении оптимального разброса хромосом до сих пор остается главной проблемой метафазных FISH- и стандартных цитогенетических исследований (Barch MJ, Knusten T, Spurbeck JL. The AGT cytogenetics laboratory manual. 3rd ed. New York: Raven Press. 1997. P. 25-50).

Высокие уровни метафазных пластинок с избыточной компактностью, наложениями хромосом или разрушенными метафазами на цитологических препаратах затрудняют, а порой делают невозможным кариотипирование. В случае исследований образцов (костного мозга, периферической крови, лимфоузлов) онкогематологических больных ситуация усугубляется тем, что для оценки кариотипа опухолевых клеток необходим анализ не менее 20 метафазных пластинок с адекватными разбросами. Такого количества пригодных для анализа метафаз нередко не оказывается не только из-за высоких частот некачественных метафаз на цитологическом препарате, но и вследствие того, что цитогенетическое исследование выполняется на фоне проводимой терапии, которая, как правило, приводит к снижению уровня пролиферирующих клеток.

Известен способ приготовления цитологических препаратов хромосом, включающий равномерного нанесение 3-5 капель фиксированной (с помощью смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1) клеточной суспензии на сухое предметное стекло, предварительно очищенное погружением в 100%-ный этанол с последующим вытиранием чистой безворсовой тканью и высушенное на воздухе (Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 730 Ed. by: Lynda J. Campbell L.J, Springer Science + Business Media, LLC 2011. P. 63-78).

Недостатком данного способа приготовления хромосомных препаратов является низкий уровень метафаз с пригодными для анализа разбросами хромосом в большинстве случаев.

Известен другой способ приготовления цитологических препаратов хромосом, включающий раскапывание 1 капли полученной клеточной суспензии на предметное стекло с водяной пленкой. После выдерживания «лицевой» стороны предметного стекла над водяным паром (75°C или более) в течение 1-3 с и появления зернистости в фиксаторе (клетки становятся видимыми) высушивают предметное стекло на металлической пластине с температурным градиентом вдоль одного из ее измерений. Степень разброса регулируется благодаря наличию возможности варьировать температуру предметного стекла с помощью нагретой пластины. Согласно имеющимся данным повышение температур способствует увеличению разброса хромосом. В тех же случаях, когда не удается достичь адекватных для анализа разбросов с помощью вышеуказанных технических приемов, авторы предлагают после раскапывания клеточной суспензии выдерживать предметное стекло кратковременно над паром, затем добавлять 4-6 капель ледяной уксусной кислоты. После распределения уксусной кислоты по поверхности предметного стекла проводится быстрое высушивание над паром в течение 3-5 с в горячей области металлического плата (65-75°C) или металлического блока (Henegariu O, Heerema N.A., Wright L.L. et al Improvements in Cytogenetic Slide Preparation: Controlled Chromosome Spreading, Chemical Aging and Gradual Denaturing // Cytometry. 2001. Vol. 43, P. 101-109).

Основным недостатком указанного способа приготовления цитологических препаратов хромосом является часто низкий уровень метафаз с адекватными для анализа разбросами хромосом. При этом следует отметить, что в случае дополнительного наслаивания ледяной уксусной кислоты на нанесенный материал в среднем наблюдается улучшение качества хромосомных разбросов. Но в то же время ухудшается качество дифференциальной окраски хромосом, что делает их малоинформативными либо вовсе непригодными для кариотипирования.

В качестве прототипа способа выбран стандартный способ приготовления цитологических препаратов метафазных хромосом, включающий:

1) нанесение 1 капли суспензии фиксированных культивированных клеток, полученных из клинического образца (костный мозг, периферическая кровь) пациента, на центральную часть удерживаемого горизонтально предметного стекла с пленкой из деионизованной воды,

2) перемещение стекла на ровную поверхность с последующим удалением переместившейся к краям стекла воды с помощью фильтровальной бумаги,

3) высушивание стекла на воздухе при комнатной температуре (Cancer Cytogenetics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 220 Ed. by: J. Swansbury - Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2003 - P. 73-83).

К недостатку способа относится нередко низкое содержание метафазных пластинок с пригодными для анализа разбросами хромосом в цитологическом препарате, что вызывает значительные затраты времени на поиск указанных пластинок, а во многих случаях не позволяет проводить полноценный анализ кариотипа.

Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.

Технический результат заключается в ускорении и повышении точности анализа кариотипа гемопоэтических клеток.

Данный технический результат достигается тем, что предложен способ приготовления хромосомных препаратов, включающий нанесение 1-2 капель суспензии фиксированных культивированных клеток, полученных из костного мозга или периферической крови пациента, на горизонтально удерживаемое предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты. Этапы получения хромосомных препаратов, связанные с перемещением предметного стекла на ровную поверхность с последующими удалением переместившейся к краям стекла воды с помощью фильтровальной бумаги и высушиванием стекла на воздухе при комнатной температуре, проводятся стандартно.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что благодаря раскапыванию суспензии фиксированных клеток, полученных из костного мозга или периферической крови пациента, на предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты удается повысить содержание метафазных пластинок с адекватными для анализа разбросами хромосом в цитологических препаратах не менее чем в 3 раза. Применение указанного раствора уксусной кислоты лабилизует клеточную мембрану, делая ее более чувствительной к разрывам. При этом данный подход без дополнительных технических приемов эффективен при широком спектре атмосферных условий (относительная влажность, температура) и приемлемом качества дифференциального окрашивания хромосом.

Способ осуществляют следующим образом.

Для приготовления цитологических препаратов хромосом с применением, в частности, краткосрочного культивирования образец костного мозга (периферической крови или лимфоузла) ставится на культивирование при 37°C в течение 18-24 ч в стерильной одноразовой пластиковой пробирке (объем 15 мл) в 5 мл культуральной смеси из расчета 1-2 млн ядросодержащих клеток на 1 мл культуральной смеси. Культуральная смесь включает 4 мл среды RPMI-1640, 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамин с конечной концентрацией 292 мкг/мл, антибиотики пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 мкг/мл), а также колцемид (конечная концентрация - 0,02 мкг/мл) для накопления метафазных клеток. После инкубации клетки осаждаются центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин, удаляется супернатант, осадок суспендируется в 7-10 мл нагретого до 37°C гипотонического (0,075 М) раствора KCI, и клетки инкубируются в течение 10 мин при 37°C. Затем клетки центрифугируются при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляется, а осадок тщательно разбивается встряхиванием примерно в 0,5 мл супернатанта. Далее по каплям при осторожном перемешивании добавляется 7-10 мл фиксатора, суспензия выдерживается в течение 20 мин при комнатной температуре, и проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин. После окончания центрифугирования осадок вновь ресуспендируется в 5 мл фиксатора, а суспензия выдерживается 7-10 мин при комнатной температуре. После этого проводится центрифугирование при 1000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяется 4-6 раз в зависимости от качества полученных препаратов. После последнего центрифугирования осадок клеток суспендируется в 0,5 мл свежего фиксатора.

На заключительном этапе приготовления хромосомных препаратов одна или 2 капли (одна вблизи матового поля, другая у противоположного края стекла) клеточной суспензии наносятся на горизонтально удерживаемое предметное стекло с пленкой из 55% водного раствора уксусной кислоты. Сама пленка создается нанесением 6-8 капель указанного раствора с помощью пастеровской пипетки на предметное стекло и последующим распределением по всей поверхности последнего (за исключением матового поля) полирующими движениями пипетки. После аккуратного перемещения предметного стекла с нанесенной клеточной суспензией на горизонтальную поверхность проводится высушивание препарата на воздухе при комнатной температуре.

Пример. Для оценки кариотипа опухолевых клеток у больной Р. хроническим миелолейкозом, получающей терапию ингибитором тирозинкиназ иматинибом, 0,5 мл пунктата костного мозга с концентрацией ядросодержащих клеток 20×10⁶/мл было поставлено на культивирование в течение 24 ч с ночной колцемидизацией (конечная концентрация колцемида - 0,02 мкг/мл). После окончания культивирования обработка клеток проводилась стандартным способом. Полученная клеточная суспензия наносилась на горизонтально удерживаемые предметные стекла с пленками из деионизованной воды и 55% водного раствора уксусной кислоты. После высушивания предметных стекол хромосомные препараты подвергались «старению» (ночная инкубация в термостате при 60°C) с последующим дифференциальным G-окрашиванием и анализировались. В хромосомных препаратах, полученных с применением раскапывания суспензии фиксированных клеток на предметные стекла с пленками из воды и 55% водного раствора уксусной кислоты, было обнаружено соответственно 14 и 47 метафазных пластинок с пригодными для анализа разбросами. Затраты времени на поиск 14 адекватных для анализа метафаз в препарате, полученном с применением пленки из деионизованной воды, были примерно в 3 раза больше, чем в препарате, приготовленном с применением 55% водного раствора уксусной кислоты. При анализе кариотипа клеток в препарате, полученном с применением пленки из раствора уксусной кислоты, было выявлено 2 цитогенетических клона: 46,XX,t(9;22)(q34;q11)[4]/46,XX[43]. При исследовании же препарата, приготовленного с применением водной пленки, был выявлен только один цитогенетический клон клеток с нормальным кариотипом: 46,ХХ[14].