ЭКСТРАКТ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к пищевой биотехнологии, а именно к получению обогащенных продуктов питания, для повышения адаптационных возможностей организма в условиях стресса, повышения умственной и физической работоспособности, улучшения кратковременной и долговременной памяти, улучшения углеводного и липидного обмена, профилактики и компенсации абдоминального ожирения. Изобретение находит применение в функциональном питании, восстановительной медицине, гериатрии и спорте.

Известно, что современный человек подвергается действию факторов стресса различной природы, силы и продолжительности действия. В регуляции стресса принимает участие гормон стресса кортизол, который в ответ на утомление, физическую нагрузку, голодание, страх и другие экстренные стрессовые ситуации мобилизует в организме метаболические процессы: расщепление белков (в том числе мышечных) до аминокислот, запуск процессов глюконеогенеза в печени, повышение уровня глюкозы в крови, а также накопление жира. Стресс невысокой интенсивности и продолжительности выполняет защитное действие и помогает преодолеть человеческому организму вызовы на стрессовые воздействия. При этом после снятия стрессовой нагрузки уровень кортизола возвращается на базовый уровень. В условиях хронического стресса, когда уровень кортизола постоянно повышен, под его влиянием происходит подавление функций щитовидной железы, повышается артериальное давление, возникает гипергликемия, снижается иммунитет, нарастает количество брюшного жира при нормальной массе тела, уменьшается плотность костей. В свою очередь, это может привести к различным заболеваниям, таким как сахарный диабет, инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз и другие заболевания. Многие известные лекарственные средства, направленные на лечение отдельных сердечно-сосудистых заболеваний или нарушений обмена веществ, не устраняют их главную причину, обусловленную хроническим стрессом [Дильман В.М. Большие биологические часы (Введение в интегральную медицину). М.: Знание, 1981. 208 с.].

В настоящее время большое внимание уделяется антистрессовой фиторегуляции с применением лекарственных растений, которые эффективны не только для лечения различных заболеваний, но и как метод нормализации физиологических функций и психофизиологического состояния здоровых людей. Показана их эффективность для адаптации организма в ситуациях как острого стресса, так и длительного воздействия стрессоров, для повышения работоспособности и ускорения восстановления после нагрузок. Для профилактики и коррекции стрессовых состояний, к которым относятся утомление, астения, снижение работоспособности, используются адаптогены - вещества преимущественно растительного происхождения, повышающие неспецифическую устойчивость организма к неблагоприятным стрессовым воздействиям. Адаптогены действуют на центры гормональной регуляции, оптимизируя секрецию кортизола и обеспечивая тонизирующее и стимулирующее действие на функции нервной системы и организма в целом. Они эффективны как на ранней стадии стресса, так и на стадии стрессового истощения, активизируя метаболические процессы. Адаптогены характеризуются также антиоксидантным действием и обеспечивают защиту от повреждения клеточных структур свободными радикалами. Они обладают иммуностимулирующим действием, повышают физическую и умственную работоспособность, устойчивость к различным физиологическим и психологическим стресс-факторам, сокращают сроки адаптации к ним. Известными адаптогенами являются настойки и препараты на основе женьшеня, элеутерококка, аралии, лимонника, родиолы и некоторых других растений, однако они имеют противопоказания при бессоннице, повышенной нервной возбудимости и гипертонии [Дырдымов И.В. Женьшень, элеутерококк (к механизму биологического действия). М., 1976. 184 с.; Яременко К.В. Оптимальное состояние организма и адаптогены. СПб., 2007. 129 с.]. Этих недостатков лишены лекарственные препараты и биологически активные добавки на основе растений, содержащих фитоэкдистероиды [Володин В.В., Матаев С.И. Экдистероидсодержащие растения - источники новых адаптогенов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова, 2011. Т. 7. №2, С. 52-59.].

Фитоэкдистероиды - полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки насекомых, обнаружены во многих видах дикорастущих растений. Фитоэкдистероиды не токсичны для млекопитающих. Выявлено выраженное актопротекторное [RU, патент №2276991, приоритет от 09.02.2005, опубликовано 27.05.2006], стресс- и гематопротекторное [RU, №2375071, приоритет от 06.11.2008, опубликовано 10.12.2009], противолучевое [RU, №2326672, приоритет от 21.03.06, опубликовано 20.06.2008], противодиабетическое [RU, патент №2337698, приоритет от 06.02.2007, опубликовано 10.11.2008], антиатеросклеротичекое и противоишемическое [RU, патент №2337701, приоритет от 06.02.2007, опубликовано 10.11.2008] действие.

Экдистероиды вводятся в организм в чистом виде или в форме экстрактов растений. Для этого используются лекарственные растения с относительно высоким содержанием экдистероидов, например, левзея сафлоровидная, из корневищ которой получают жидкие и сухие экстракты и выделяют очищенный 20-гидроксиэкдизон в качестве субстанции тонизирующего лекарственного препарата экдистен [Куракина И.О., Булаев В.М. Экдистен - тонизирующее средство в таблетках по 0.005 г // Новые лекарственные препараты. М., 1990. Вып. 6. С. 16-18.]. Для получения биологически активных добавок к пище в последнее время не рекомендовано использование растений, относящихся к списку лекарственных. В этих целях могут быть использованы пищевые растения, однако примеров известных видов пищевых растений, содержащих фитоэкдистероиды, мало. К ним относятся, например, шпинат и квиноа [Bakrim A., Maria A., Sayah F. et al. Ecdysteroids in spinach (Spinacia oleracea L.): biosynthesis, transport and regulation of levels // Plant Physiology and Biochemistry, 2008. V. 46. P. 844-854.; Foucaultetal A.-S., Even P., Lafont R. et al. Quinoa extract enriched in 20-hydroxyecdysone affects energy homeostasis and intestinal fat absorption in mice fed a high-fat diet // Physiology and Behavior, 2014. V. 128. P. 226-231.]. Указанные пищевые растения содержат незначительное количество фитоэкдистероидов, поэтому фармакологическая ценность продуктов, полученных непосредственно из вышеназванных видов пищевых растений или из экстрактов, получаемых традиционным путем, является недостаточной из-за низкого содержания в них фитоэкдистероидов. По этой же причине выделение индивидуальных фитоэкдистероидов из названных видов растений экономически нерентабельно. Таких недостатков в значительной степени лишены специальным образом получаемые растительного сырья с низким содержанием ценных микронутриентов обогащенные продукты питания.

Известен функциональный пищевой продукт для снижения избыточной массы тела, содержащий фитоэкдистероиды из пищевого растения квиноа, и способ его получения [RU, патент №2491083, конвенционный приоритет от 19.11.2008, опубликовано 27.08.2013]. Квиноа или рисовая лебеда (Chenopodium quinoa) - псевдозерновая культура, однолетнее растение семейства Маревые (Chenopodiaceae), произрастающее на склонах гор Анд в Южной Америке. Квиноа как сельскохозяйственная культура, имеет древнее происхождение и была одним из важнейших видов пищи индейцев. Содержание фитоэкдистероидов в зернах квиноа не выше 0,01-0,02%. Чтобы организм человека получил эффективную концентрацию фитоэкдистероидов, необходимо потребить не менее 100 г необработанных сухих зерен. Авторами данного изобретения предлагается использовать обогащенный продукт, содержащий в 50 раз больше фитоэкдистероидов, чем исходные зерна квиноа. Согласно заявленному способу для получения обогащенного продукта зерна квиноа вначале экстрагируют кипящей водой в соотношении 1:4 для удаления сапонинов, придающих экстракту горький вкус. Экдистероиды извлекают из зерен квиноа путем вторичной экстракции смесью этанол-вода (1:1) при температуре 80°С. Сухой экстракт обрабатывают абсолютным этанолом. Этанольную фракцию фильтруют и конечный продукт высушивают. Способ предполагает также использование бутанола вместо этанола. Содержание фитоэкдистероидов в обогащенном продукте от 2 до 7%, что на два порядка выше, чем в исходном сырье. Данный обогащенный экстракт добавляют в пищевые продукты, например, йогурты, другие молочные продукты и напитки, или включают в состав желатиновых капсул для получения биологически активных добавок к пище. Согласно патенту содержание фитоэкдистероидов в одной капсуле содержится 7,5 мг фитоэкдистероидов. Рекомендуемая доза для профилактики или компенсации абдоминального ожирения составляет 4 капсулы или 30 мг фитоэкдистероидов в сутки. Указанный способ имеет ряд недостатков, таких как использование импортного растительного сырья зерна квиноа, неизбежные потери фитоэкдистероидов на стадии первичной водной экстракции при удалении сапонинов (растворимость фитоэкдистероидов в воде составляет около 2 г/л), применение больших объемов этанола удорожает производство, а использование бутанола нежелательно при получении пищевых добавок.

Ценным пищевым растением, содержащим фитоэкдистероиды, является шпинат огородный (Spinacia oleracea) - однолетнее травянистое растение из семейства маревых (Chenopodiaceae). Шпинат культивируется в зонах умеренного климата, в частности, в России. В пищу употребляются, в основном, листья этого растения, которые содержат белок, сахара, аскорбиновую кислоту, витамины группы В, каротин, лютеин, полифенолы, органические кислоты, фитоэкдистероиды, минеральные соли (железо, магний, калий, фосфор, натрий, кальций, йод). Листья шпината употребляют вареными (в супах и в качестве гарнира для вторых блюд) и сырыми (в салатах). Свои ценные питательные качества они сохраняют в консервированном и свежезамороженном виде. Листья также можно сушить и после размалывания использовать в виде порошка как приправу для различных блюд. Используется сок из свежих листьев шпината.

Шпинат рекомендуется вводить в рацион здоровых людей для повышения функциональных резервов человека в периоды гиповитаминоза, при переутомлении, при интенсивных физических нагрузках, а также для компенсации неблагоприятного воздействия факторов внешней (например, низкие температуры, неоптимальный световой режим, повышенный радиационный фон) и производственной среды (ионизирующее излучение, вредные химические факторы), для регуляции углеводного и липидного обмена лицам с диабетом 2 типа, страдающих ишемической болезнью сердца, различными формами анемии, а также при ослаблении зрения и памяти у пожилых людей.

Недостатками шпината, используемого в пищу в цельном виде - листьях (свежих, свежезамороженных, вареных или высушенных) или свежеприготовленном соке, является относительно низкое в суточном рационе содержание фитоэкдистероидов, ответственных за биологическую ценность и лечебно-профилактическое действие шпината. В то же время в шпинате содержится большое количество оксалатов, которые противопоказаны людям, страдающим или предрасположенным к почечнокаменной болезни, ревматизму и подагре. В одной чашке сырых не нарезанных листьев шпината массой 30 г содержится около 200 мг оксалата. При допустимой суточной норме оксалатов 50 мг в день человек, страдающий этими заболеваниями, может употреблять в день всего лишь 0,25 чашки (или 6 г) сырого шпината, что явно недостаточно для получения экдистероидов и других микронутриентов в количествах, необходимых для проявления ими своего метаболического действия. При содержании 20-гидроксиэкдизона в свежих листьях шпината 0,02-0,04% лица, страдающие почечнокаменной болезнью, и с другими противопоказаниями приема оксалатов получат приблизительно 1,0-2,0 мг экдистероидов с разрешенной порцией шпината в четверть чашки. Для проявления своего лечебно-профилактического действия в отношении нарушения липидного и углеводного обмена, компенсации метаболического синдрома минимальная суточная доза экдистероидов должна составлять от 5 до 30 мг, а для лиц, занятых тяжелым физическим трудом, испытывающих вредные производственные факторы, такие как повышенный радиационный фон, действие экотоксикантов, а также для спортсменов эти дозы должны быть еще выше - до 50-100 мг в сутки.

Известен способ приготовления полифенольных экстрактов из листьев шпината [RU 2519640, приоритет 04.05.2009, опубликовано 20.06.2014], который принят нами за прототип. Способ получения экстрактов шпината включает добавление к водному экстракту листьев шпината пищевого масла, проведение экстракции, концентрирование в вакууме и разделение масляной и водной фазы. Предложенный способ позволяет получить экстракт (концентрат) из водной фазы, обогащенной полифенолами более 50%. Недостатками данного способа и полученных полифенольных экстрактов является то, что способ получения не учитывает достижение необходимого концентрирования фитоэкдистероидов в конечном продукте и не предполагает удаление из целевой водной фазы экстракта оксалатов, ухудшающих потребительские свойства экстракта и ограничивающих его применение для большого круга лиц, для которых противопоказано употребление оксалатов.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение экстракта (концентрата) из листьев шпината, обогащенного фитоэкдистероидами (по большей части 20-гидроксиэкдизоном) и не содержащего оксалатов и разработка эффективного способа получения экстракта из листьев шпината, позволяющего увеличить содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом обогащенном концентрате до 1,0-20,0 мг на 1 г сухого экстракта и уменьшить содержание оксалатов до 0,01%.

Получаемый экстракт (концентрат) может быть применен в качестве профилактического средства для преодоления негативных последствий стресса, ускорения восстановления после сильных физических и умственных нагрузок, в частности, для людей экстремальных профессий, спортсменов и для лиц, занятых тяжелым физическим трудом, подверженных вредным природным и производственным факторам, пожилым людям, испытывающих состояние хронического стресса.

Технический результат достигается тем, что высушенные измельченные листья шпината экстрагируют водой при соотношении вода:листья 40:1 при температуре 40-90°С в течение 10-90 мин, получаемый водный экстракт отделяют от биомассы, в частном случае, центрифугированием. Водный экстракт подвергают ультрафильтрации при комнатной температуре для удаления взвешенных и коллоидных веществ, преимущественно, пигментов и липидов. Затем низкомолекулярную фракцию экстрагируют путем твердофазной экстракцией фитоэкдистероидов с использованием гидрофобных сорбентов при соотношении сорбент:фракция 7:1 или в низкомолекулярную фракцию добавляют сорбент, при соотношении фракция:сорбент 7,5:1 и инкубируют 1 час, далее сорбент промывают водой. Десорбцию фитоэкдистероидов с сопутствующими веществами проводят известными способами, например водными растворами низших спиртов с концентрацией спирта от 5 по 80 объемных процентов, в частном случае, 70%-ным этанолом. Полученный экстракт упаривают и высушивают, в частном случае, с помощью лиофильной сушки. Содержание 20-гидроксиэкдизона в сухом концентрате варьируется от 1,0 до 20,0 мг на 1 г сухого препарата в зависимости от объемной доли низшего спирта в растворителе, применяемом на стадии десорбции экдистероидов. Содержание оксалатов не превышает 0,01%.

Примеры осуществления способа

Пример 1. Листья шпината измельчают и проводят водную экстракцию при соотношении вода/листья шпината 40:1 в интервале температуре 40-90°С в течение 10-90 мин. Разделение проводят центрифугированием в течение 15 минут при скорости 2000 об/мин с отбрасыванием осадка. Удаление взвешенных и коллоидных частиц из экстракта проводят ультрафильтрацией на установке «Minitan» («Millipore», США) в тангенциальном потоке с использованием мембран с диаметром пор 10 кД при комнатной температуре. Полученную высокомолекулярную фракцию отбрасывают. Низкомолекулярную фракцию пропускают через слой сорбента «Диасорб-100 С₁₆» (ЗАО «БиоХимМак») при соотношении сорбент:фракция 7:1 с последующей двукратной промывкой сорбента дистиллированной водой для удаления оксалатов. Десорбцию экдистероидов с сопутствующими веществами проводят 70%-ным раствором этилового спирта при соотношении сорбент:растворитель 1:10. Растворитель отгоняют под вакуумом, а конечный продукт высушивают на лиофильной сушилке. Конечный обогащенный концентрат представляет собой легкие хлопья бежевого цвета, хорошо растворимые в воде. Содержание 20-гидроксиэкдизона составляет 20 мг на 1 г сухого экстракта (концентрата). Потери 20-гидроксиэкдизона в процессе обогащения экстракта составляют не более 5%. Продукт не содержит оксалатов.

Пример 2. Экстракцию листьев шпината водой и ультрафильтрацию водного экстракта проводят, как в примере 1. Далее 30 мл низкомолекулярной фракции встряхивают 30 минут, добавляют 4,0 г сорбента «Диасорб-100 C₁₆» и инкубируют 1 час при встряхивании. Сорбент отделяют от водного экстракта центрифугированием. Супернатант №1 декантируют и отбрасывают. Сорбент дважды промывают дистиллированной водой. Далее к сорбенту добавляют 40 мл 70%-ного этанола и встряхивают 1 час. Сорбент отделяют от супернатанта №2 центрифугированием. Сорбент повторно промывают 70%-ным этанолом. Отделяют сорбент, собирают супернатант №3 и объединяют его с супернатантом №2. Растворитель удаляют под вакуумом на роторном испарителе при 60°С и проводят лиофильную сушку конечного обогащенного концентрата. Содержание 20-гидроксиэкдизона составляет 15 мг на 1 г сухого экстракта (концентрата). Продукт не содержит оксалатов.

Пример 3. Продукт получают по примеру 1 до стадии высушивания продукта. Далее растворитель отгоняют до образования густого экстракта, и продукт применяют в жидком виде.

Пример 4. Продукт получают по примеру 2 до стадии высушивания продукта. Далее растворитель отгоняют до образования густого экстракта, и продукт применяют в жидком виде.

Оборудование и условия проведения анализа 20-гидроксиэкдизона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: Колонка Luna С18 (250*4.6 мм), 5 мкм с форколонкой; скорость элюирования 0,75 мл/мин; ультрафиолетовый проточный детектор UV/VIS 151, длина волны 254 нм; Элюент А - 20% ацетонитрил, Элюент В - 60% ацетонитрил; линейный градиент В от 0 до 50% за 25 минут. Сухой образец растворяют в 50%-ном этиловом спирте в течение 1 часа на лабораторном встряхивателе, затем помещают в ультразвуковую ванну на 15 минут и отфильтровывают через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего вводят в колонку хроматографа.

Пример применения. Влияние экстракта (концентрата экдистероидов) на биомаркеры общего адаптационного синдрома (ОАО) у крыс после стрессорного воздействия. Стрессорное воздействие моделировали электрокожным раздражением током 0,4 мА в течение 8 секунд на лапы крыс линии Вистар. Крысы опытных групп получали ежесуточно в индивидуальных поилках водный раствор экстракта из расчета 2 мг 20-гидроксиэкдизона (суммарно) на 1 кг массы тела крысы в течение 30 дней (эксперимент 1) и 5 мг 20-гидроксиэкдиона в течение 15 дней (эксперимент 2). Животные контрольной группы получали в течение всех экспериментов воду. Стрессорное воздействие проводилось в предпоследние дни экспериментов.

При использованной в эксперименте 1 низкой дозировки экстракта не было выявлено достоверных различий содержания в плазме крови биомаркеров центральной стресс-системы и стресс-лимитирующих систем: кортикостерона, β-эндорфина, норадреналина и простагландина Е2 (таблица 1).

Однако произошло достоверное увеличение массы тимуса на 18% (таблица 2) и снижение активности апоптоза на 7% для степени ДНК повреждений и на 24% для индекса апоптоза в этом органе по сравнению со стрессированными крысами контрольной группы (рис. 1).

Потребление обогащенного экстракта даже в весьма низкой дозировке (2 мг/кг), не влияя на уровень биохимических маркеров в крови, оказало адаптогенное действие, снижая активность апоптоза в клетках этого органа у стрессированных животных.

В отличие от низкой дозировки ежесуточное потребление экстракта в дозе 5 мг 20-гидроксиэкдизона на 1 кг массы тела в течение 15 дней (эксперимент 2) достоверно снижало экскрецию с мочой кортикостерона более чем в 2,5 раза и норадреналина в 1,9 раз (таблица 3).

Таким образом, потребление экстракта ограничивает напряженность протекания у животных общего адаптационного синдрома, вызываемого электрокожным раздражением. В зависимости от дозировки экстракта показателями его стресс-протекторного действия были или снижение экскреции с мочой основных медиаторов стресса-кортикостерона и норадреналина или активности апоптоза в тимусе. При этом потребление экстракта в дозах 2-5 мг 20-гидроксиэкдизона на кг массы тела не оказывало неблагоприятного воздействия на ростовые показатели крыс в экспериментах продолжительностью 15-30 суток.