Результат интеллектуальной деятельности: Бактериальный штамм, способный метаболизировать оксалаты

Настоящее изобретение относится к селекции штаммов лактобактерий и бифидобактерий, обитающих в кишечнике человека, способных метаболизировать щавелевую кислоту и/или ее соли (оксалаты). Более того, настоящее изобретение относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим указанные бактериальные штаммы.

Оксалат (соль щавелевой кислоты) является повсеместно распространенным соединением в растительном мире, широко представленным во всех видах пищи человека. Суточное потребление находится в пределах от 70 до 920 мг (в среднем 495 мг, приблизительно 5,6 мМ), но эти значения слегка превышены в пищевых рационах вегетарианцев.

Щавелевая кислота (дикарбоновая кислота) является одним из наиболее высокоокисленных органических соединений и, таким образом, действует как мощный хелатирующий агент для катионов, в частности, иона Са²⁺. Из-за этого свойства соли щавелевой кислоты (оксалаты) имеют очень незначительное применение в катаболических процессах и выработке энергии. Более того, щавелевая кислота является токсичной для большинства живых существ, и в частности для млекопитающих.

По этой причине накопление щавелевой кислоты и оксалатов в организме человека может инициировать и ухудшать ряд патологических состояний, среди которых следует упомянуть гипероксалурию, мочекаменную болезнь, почечную недостаточность, кардиомиопатии и другие расстройства сердечной деятельности. В частности, щавелевая кислота связывается с кальцием с образованием соответствующего оксалата кальция, нерастворимой соли, которая является причиной более 70% случаев диагностированных почечных камней. Более того, щавелевая кислота является мощным воспалительным агентом, повреждающим слизистую оболочку кишечника. Таким образом, избыточное присутствие этой кислоты в просвете может негативно сказаться на естественной защитной функции эпителия, изменяя его проницаемость и, следовательно, вызывая повышенную абсорбцию оксалата. В частности, толстая кишка является основным участком абсорбции оксалата, при потреблении 3-5% в нормальных физиологических условиях. Снижение уровня оксалата в просвете кишечника может, следовательно, способствовать снижению абсорбции. Это в свою очередь приведет к уменьшению концентрации оксалатов в плазме и в моче, тем самым снизив их вредоносность.

Более того, высокие уровни оксалатов в крови могут приводить к дивертикулезу или дивертикулиту. Дивертикулез, также известный как «дивертикулярная болезнь», является медицинским состоянием, характеризующимся дивертикулами в толстой кишке; они представляют собой выпячивания слизистой оболочки и подслизистого слоя толстой кишки через участки относительной слабости мышечного слоя в стенке толстой кишки. Дивертикулы определенно наиболее распространены в сигмовидной кишке, которая является частью кишечника, характеризующейся большим давлением, фактором, способствующим образованию дивертикул. Дивертикулез является патологией пищеварительного тракта, характеризующейся воспалением одной или более дивертикул. В большинстве случаев дивертикулит локализуется в толстой кишке (в частности, в нисходящей и сигмовидной кишке).

Поэтому, важно иметь возможность снижать количество оксалатов в просвете кишечника, плазме и моче так, чтобы избежать осложнений, связанных с высокими значениями оксалатов, таких как, например, гипероксалурия, мочекаменная болезнь, почечная недостаточность, кардиомиопатии и другие расстройства сердечной деятельности, камни в почках, дивертикулез и дивертикулит.

В частности, желательно иметь возможность снижать уровни оксалатов в моче двух типов субъектов:

- субъекты с гипероксалурией, которые не придерживаются питания с высоким содержанием оксалатов;

- субъекты с нормальными показателями оксалурии, которые придерживаются питания с высоким содержанием оксалатов.

Заявитель предложил решение проблемы вышеупомянутых потребностей после интенсивного научного исследования, в конце которого из весьма обширной группы штаммов был проведен отбор бактериальных штаммов, принадлежащих к родам Lactobacillus и Bifidobacterium; указанные штаммы проявляют заметную способность количественно разлагать оксалаты. Отобранные штаммы демонстрируют способность использовать оксалат в качестве источника энергии, удаляя его из среды, в которой указанный оксалат изначально находился. Таким образом, отобранные штаммы способны разлагать оксалаты.

Объект настоящего изобретения относится к бактериальным штаммам, принадлежащим к родам Lactobacillus и Bifidobacterium, и обладающим способностью разлагать оксалаты, как раскрыто в прилагаемой независимой формуле изобретения.

Объект настоящего изобретения также относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим указанные бактериальные штаммы, как раскрыто в прилагаемой независимой формуле изобретения.

Предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут проиллюстрированы в подробном описании, которое следует далее.

На фиг.1 показано сравнение между хроматограммой культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата, до (А) и после (Б) очистки посредством ТФЭ (твердофазной экстракции).

На фиг.2 показана хроматограмма культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата (положительный эталон).

На фиг.3 показана хроматограмма бактериального штамма В. breve BR03 DSM 16604.

На фиг.4 показана хроматограмма бактериального штамма L paracasei spp.paracasei LPC09 DSM 24243.

На фиг.5 показаны кривые окисления (величина рН), полученные как функция времени (Т=0, 3, 6, 8 и 10 часов), когда штамм L. paracasei spp.рэгвсвзв! LPC 09 DSM 24243 выращивали в культуральной среде MRS (deMann-Rogosa-Sharpe, среда де Манн-Рогоза-Шарпа), не содержащей сахара (источник углерода), к которой соответственно были добавлены другие источники углерода (волокна).

Заявитель разработал способ, обеспечивающий идентификацию и количественное определение способности к разложению оксалатов у культур штаммов, принадлежащих к родам Lactobacillus и Bifidobacterium.

Заявитель установил, что следующие бактериальные штаммы обладают подтвержденной способностью использовать оксалаты в качестве источника энергии:

1) L. paracasei spp.paracasei LPC 09, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 23.11.2010, с депозитным номером DSM 24243.

2) L. gasseri LGS 01, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 24.05.2006, с депозитным номером DSM 18299.

3) L gasseri LGS 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 24.05.2006, с депозитным номером DSM 18300.

4) L. acidophilus LA 07, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 23.11.2010, с депозитным номером DSM 24303.

5) L. acidophilus LA 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 06.08.2008, с депозитным номером DSM 21717.

6) L. plantarum LP 01, депонированный компанией Mofin Sri, Новара (Италия), в институте депонирования BCCM-LMG (Бельгийская координированная коллекция микроорганизмов) (Бельгия) 16.10.2001, с депозитным номером LMG-P-21021.

7) L. reuteri LRE 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23879.

8) L. reuteri LRE 02, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23878.

9) В. breve BR 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 16.07.2004, с депозитным номером DSM 16604.

10) В. longum BL 03, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 20.07.2004, с депозитным номером DSM 16603.

11) L. rhamnosus GG, АТСС 53103, имеющийся в общественной коллекции АТСС (Американская коллекция типовых культур).

12) L. reuteri LRE 04, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 05.08.2010, с депозитным номером DSM 23880.

13) L. rhamnosus LR 06, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 14.11.2008, с депозитным номером DSM 21981.

14) В. lactis BA 05, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 15.06.2006, с депозитным номером DSM 18352.

15) L. casei spp.rhamnosus LR 04, депонированный компанией Probiotical SpA, Новара (Италия) 20.07.2004, с депозитным номером DSM 16605.

В предпочтительном воплощении композиция содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере одного штамма, выбранного из указанных выше штаммов с (1) по (15); предпочтительно штаммы выбраны из указанных выше штаммов с (1) по (8).

В контексте настоящего изобретения «бактериальный штамм» означает живые и/или убитые клетки, и/или их части, компоненты/производные, и/или ферменты.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к роду Lactobacillus и обладают способностью разлагать и использовать оксалат в качестве источника энергии в количестве более чем 50%. Преимущественно, указанная способность составляет более чем 60%. Преимущественно, указанная способность составляет более чем 70%.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus paracasei. Предпочтительный штамм представляет собой L. paracasei spp.paracasei LPC 09 DSM 24243.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus gasseri. Несколько предпочтительных штаммов выбраны из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и L gasseri LGS 02 DSM 18300.

Отобранные бактериальные штаммы принадлежат к виду Lactobacillus acidophilus. Несколько предпочтительных штаммов выбраны из группы, содержащей или, альтернативно, состоящей из L. acidophilus LA02 DSM 21717 и L. acidophilus LA 07 DSM 24303.

Композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один бактериальный штамм для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита.

Композиция может представлять собой пищевую композицию, или пищевую добавку, или медицинское устройство, или фармацевтическую композицию.

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере двух штаммов, выбранных из указанных выше штаммов с (1) по (15), предпочтительно штаммы выбраны из указанных выше штаммов с (1) по (8).

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из по меньшей мере двух штаммов, выбранных из указанных выше штаммов с (1) по (5).

Композиция для применения в лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита содержит или, альтернативно, состоит из:

а) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243; или

б) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243 и L. gasseri LGS 01 - DSM 18299; или

в) L paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243 и L. gasseri LGS 02 - DSM 18300; или

г) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 -DSM 18299 и L gasseri LGS 02 - DSM 18300; или

д) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L gasseri LGS 02 - DSM 18300 и L. acidophilus LA 07 -DSM 24303; или

е) L. paracasei spp. paracasei LPC 09 -DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L. gasseri LGS 02 - DSM 18300 и L. acidophilus LA 02 - DSM 21717; или

ж) L. paracasei spp. paracesei LPC 09 - DSM 24243, L. gasseri LGS 01 - DSM 18299, L. gasseri LGS 02 - DSM 18300, L. acidophilus LA 07 - DSM 24303 и L. acidophilus LA 02 - DSM 21717.

Все из вышеописанных композиций и, в частности, перечисленные выше композиции с (а) по (ж), могут дополнительно содержать фруктоолигосахариды (FOS) и/или инулин. Фруктоолигосахариды (FOS) и/или инулин включены в количестве, составляющем от 1 до 30% по массе относительно массы композиции, предпочтительно от 3 до 15%, даже более предпочтительно от 5 до 10% по массе.

Объект настоящего изобретения относится к бактериальному штамму, принадлежащему к виду Lactobacillus paracasei или Lactobacillus gasseri и способному разлагать щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 60%. Указанный штамм способен разлагать щавелевую кислоту и/или ее соли в количестве более чем 70%. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus paracasei, представляет собой L paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus gasseri, выбран из группы, содержащей штамм L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамм L. gasseri LGS 02 DSM 18300. Указанный штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus gasseri, выбран из группы, состоящей из штамма L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамма L. gasseri LGS 02 DSM 18300.

Объект настоящего изобретения относится к пищевой композиции, или пищевой добавке, или медицинскому устройству, или фармацевтической композиции, содержащим бактериальную композицию; где указанная бактериальная композиция содержит по меньшей мере один бактериальный штамм, как описано выше, для применения в профилактическом или терапевтическом лечении гипероксалурии, мочекаменной болезни, почечной недостаточности, кардиопатий, камней в почках, дивертикулеза и дивертикулита. Указанная бактериальная композиция содержит штамм L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243. Указанная бактериальная композиция содержит штамм L. gasseri LGS 01 DSM 18299 и штамм L. gasseri LGS 02 DSM 18300. Указанная бактериальная композиция дополнительно содержит штамм L. acidophilus LA02 DSM 21717 и штамм L. acidophilus LA 07 DSM 24303. Указанная бактериальная композиция состоит из L. paracasei spp. paracasei LPC- 09 DSM 24243, L. acidophilus LA02 DSM 21717 и/или L. acidophilus LA 07 DSM 24303. Указанная композиция дополнительно содержит фруктоолигосахариды и/или инулин.

Экспериментальная часть

1. Анализируемые бактериальные штаммы

Было исследовано примерно 70 штаммов, принадлежащих к родам Bifidobacterium и Lactobacillus; они поступили из внутренней коллекции штаммов компании Probiotical SpA в Новаре и международных коллекций, таких как, например, DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) - Германия, или были найдены в литературных источниках. Отобранные штаммы показаны в таблице 1, в которой продемонстрирован процент разложения оксалата исследуемыми бактериальными штаммами. Эксперимент проводили при использовании культуральной среды, содержащей 5 мМ оксалата аммония.

Бактериальные штаммы с (1) по (5), с (7) по (10) и с (12) по (15), перечисленные в таблице 1, были депонированы компанией Probiotica! SpA, Новара (Италия). Штамм (6) был депонирован компанией Mofin Sri, Новара (Италия). Штамм (11) получен из коллекции АТСС. Все штаммы имеются в наличии и являются общедоступными согласно условиям, установленным Будапештским договором.

2. Принятые условия культивирования

Получение штаммов, которые должны быть подвергнуты анализу, заключалось в серии из трех последовательных пересевов в MRS-бульоне (с добавлением 1% цистеин-HCl, в анаэробных условиях, для бифидобактерий), инкубируемом при 37°C, до достижения достаточного роста. Эта стратегия культивирования делает возможной полную активацию штамма. Штаммы затем инокулировали при одинаковом процентном соотношении посевного материала (2%) в экспериментальную среду, специально созданную для обеспечения максимального роста молочнокислых бактерий и бифидобактерий, дополненную 5 мМ оксалата аммония (количество, равное среднесуточному потреблению щавелевой кислоты). Полученные таким образом культуры инкубировали в течение 24 часов при 37°C.

3. Очистка образцов посредством ТФЭ (твердофазной экстракции)

В конце периода инкубации бульонные культуры центрифугировали, и надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) ввод образцов выявил неясный хроматографический профиль. В частности, оказалось, что хроматографический пик щавелевой кислоты перекрывает пик глюкозы, присутствующей в образцах. Для того чтобы устранить вышеупомянутую проблему, образцы очищали при использовании колонок для ТФЭ (твердофазная экстракция), специфичных для органических кислот.

Протокол очистки с помощью колонок для ТФЭ требовал стадии оптимизации для получения лучшего конечного выхода. В частности использовали различные реагенты применительно к стадии кондиционирования колонки и конечной элюции аналита. Эта очистка путем твердофазной экстракции сделала возможным получение совершенно четкого хроматографического пика щавелевой кислоты, как можно увидеть на фиг.1А-Б. Использованный протокол был следующим:

Тип колонки для ТФЭ: Phenomenex Strata-XA

Активация: 1 мл метанола

Кондиционирование: 2 мл формиата натрия, 20 мМ

Загрузка пробы: 1 мл образца

Смывание примесей: 1 мл ацетата аммония, 25 мМ плюс 1 мл метанола

Элюция: 2×500 мкл HCl, 1 М плюс 2×500 мкл HCl, 3 М

4. ВЭЖХ-анализ (высокоэффективная жидкостная хроматография)

Количество оксалата, разлагаемого каждым отдельным штаммом, анализировали посредством ВЭЖХ, вычисляя разницу между концентрацией оксалата, присутствующего в культуральной среде (5 мМ) в момент времени ТО (до ферментации), и остаточной концентрацией после роста микроорганизма. Результаты для отдельных штаммов выражают в процентах, принимая концентрацию оксалата в момент времени ТО за 100. Например, результат для штамма L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243, равный примерно 70%, показывает, что последний способен использовать количество оксалата, равное примерно 3,5 мМ оксалата (70% 5 мМ). Использованный протокол ВЭЖХ был следующим:

Тип колонки: Phenomenex Hydro-RP 250×4,6 мм

Тип детектора: УФ и видимая область спектра со считыванием при 220 нм

Скорость потока при элюции: 0,7 мл/мин

Объем вводимой пробы: 20 мкл

Температура колонки: 30°C

Тип элюции: изократическая

Подвижная фаза: 20 мМ фосфат калия, рН 2,0

Бактериальные штаммы, принадлежащие к роду Lactobacillus, которые демонстрировали высокую активность разложения в отношении щавелевой кислоты, являются указанными выше штаммами с (1) по (5).

А. Определение кривых окисления для штамма L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243.

Штамм LPC09 реактивировали перед экспериментом посредством пересева в среду MRS и инкубировали в аэробных условиях при 37°C. Стадии реактивации повторяли три раза перед экспериментом при инкубировании в течение ночи. В конце третьей стадии реактивации клетки осаждали посредством центрифугирования, промывали стерильной водой и ресуспендировали перед инокулированием в культуральные среды, обогащенные волокном. Используемые среды готовили на основе среды MRS, не содержащей сахара (источники углерода), обогащенной соответственно:

- Глюкозой (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°C, 15 мин), контрольная среда.

- Фруктоолигосахаридами - FOS (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- GOS-Glu - галактоолигосахариды с остатком глюкозы (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- GOS-Gal - галактоолигосахариды с остатком галактозы (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- XOS - ксилоолигосахариды (раствор, стерилизованный фильтрацией, фильтр 0,20 мкл).

- Ларексом (Lar) - волокно лиственницы (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°C, 15 мин).

- Инулином (Inu) (раствор, стерилизованный тепловой обработкой, 121°С, 15 мин).

Конечная концентрация источников углерода для всех сред составляла 20 г/л.

Составленные таким образом среды затем инокулировали штаммом LPC09 в процентном отношении 4% и инкубировали при 37°С в аэробных условиях.

В нулевой момент времени и через 3, 6, 8 и 10 часов проводили измерения значений рН, чтобы построить кривые окисления, показанные на графике фиг.5.

В таблице 2 показаны кривые окисления (значения рН), полученные как функция времени (Т=0, 3, 6, 8 и 10 часов), когда штамм L. paracasei spp. paracasei LPC 09 DSM 24243 выращивали в культуральной среде, как описано выше.

Таблица 2