Результат интеллектуальной деятельности: Способ прогнозирования риска развития хронической ртутной интоксикации

Изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к области молекулярной биологии и генетики, и может быть использовано для прогнозирования риска развития хронической ртутной интоксикации у лиц, имеющих потенциальный контакт с парами металлической ртути.

Токсическое воздействие паров металлической ртути на человека сопровождается нежелательными эффектами со стороны многих систем и органов, включая центральную нервную систему. Поступая через легкие, липофильная Hg⁰ растворяется в крови и легко преодолевает гемоэнцефалический барьер, вступает в реакцию с органическими соединениями, задерживаясь в мозгу значительное время [1]. При этом воздействие Hg⁰ сопровождается широким спектром когнитивных, личностных, сенсорных и двигательных нарушений [1-3]. В частности, у больных в отдаленном периоде хронической ртутной интоксикации (ХРИ) отмечается прогрессирование тяжелого органического поражения головного мозга, у них регистрируются достоверные очаги субатрофии мозжечка, что расценивается как признак нейродегенеративных процессов [4]. Данный факт определяет интерес к белкам теплового шока (HSPs), поскольку известна их цитопротекторная роль при различных нейродегенеративных заболеваниях [5]. В частности, белки семейства HSP70 (HSPA1) кооперируются с некоторыми другими шаперонами при фолдинге поврежденных или вновь синтезированных белков, осуществляют конформационную регуляцию сигнальных белков, являясь ключевым компонентом поддержания клеточного гомеостаза [6-7]. В литературе отсутствуют сведения, указывающие на развитие нейродегенеративных заболеваний у экспонированных ртутью лиц, за исключением сообщения о редком случае развития синдрома Паркинсона у пациента, который в течение длительного времени подвергался профессиональному воздействию паров Hg⁰ [8]. При этом остаются не выясненными ассоциации полиморфных вариантов генов HSPs с процессами развития и прогрессирования ХРИ, которые способствовали бы выработке критериев оценки индивидуальной чувствительности организма и риска развития заболевания.

Известен способ дифференциальной диагностики начальных проявлений и первой степени ХРИ, позволяющий разграничить начальные проявления интоксикации и первую стадию заболевания, поскольку разработан на показателях группы с идентичной симптоматикой, профессиональными вредностями и стажем [9]. Недостатком данного способа является поздняя диагностика, которая выполняется уже в разгар заболевания.

Известен способ отбора стажированных работников, находящихся в контакте с парами металлической ртути, в группу риска развития хронической ртутной интоксикации, на основании результатов нейропсихологического исследования и показателей, характеризующих состояние высших психических функций [10]. Этот способ предназначен для выявления риска развития заболевания у работников, уже длительное время контактирующих с ртутью, однако не может быть использован для прогнозирования риска развития интоксикации для нового персонала.

Существуют способы прогнозирования риска развития заболевания на основании результатов молекулярно-генетических исследований. Известен способ обнаружения индивидуальной предрасположенности к развитию хронической пылевой патологии у рабочих пылеопасных профессий на основании наличия мутаций в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR): обнаружение генотипа 677Т/677Т гена MTHFR указывает на предрасположенность обследуемого к развитию профессиональных заболеваний бронхолегочной системы [11]. Данный способ основан на исследовании ассоциаций генотипов полиморфного варианта заинтересованного гена с развитием заболевания, но не может быть использован для прогнозирования развития ХРИ.

Проведенный поиск свидетельствует о том, что прототип для предлагаемого нами способа, основанного на результатах молекулярно-генетических исследований, отсутствует.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития ХРИ у лиц с потенциальным контактом с парами металлической ртути на основании выявления носительства генотипа GG локуса 1267A/G гена HSPA1B.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что не известна возможность прогноза риска развития ХРИ у носителей GG-HSPA1B (1267A/G) генотипа.

Технический результат использования изобретения - получение прогностических критериев риска развития ХРИ на основе выявления молекулярно-генетических маркеров.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития ХРИ, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфного локуса 1267A/G гена HSPA1B;

- прогнозирование повышенного риска развития хронической ртутной интоксикации в случае выявления GG HSPA1B (1267A/G) генотипа.

Указанный технический результат в способе прогнозирования ХРИ достигается следующим образом. Осуществляют забор образцов периферической венозной крови обследуемых по стандартной процедуре в Vacuette tube K3E (с K₃ EDTA). ДНК выделяют согласно инструкции к коммерческому комплекту реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "АмплиПрайм ДНК-сорб-В" (ООО "НекстБио", Москва). Выделенную ДНК хранят при -20°C. Затем последовательно выполняют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в амплификаторе "Терцик" ("ДНК-Технология", Россия) и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержит 10 пМ каждого праймера, 2,5 мкл 10-кратного буфера, 2,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ каждого dNTP и 1 ед. Taq-полимеразы. Параметры амплификации: денатурация 3 мин при 94°C; 35 циклов амплификации по схеме (денатурация 1 мин при 94°C, отжиг 1 мин при 60°C, синтез 1 мин при 72°C); элонгация 8 мин при 72°C. Для генотипирования используют олигонуклеотидные праймеры f: 5'-CATCGACTTCTACACGTCCA-3' и r: 5'-CAAAGTCCTTGAGTCCCAAC-3', синтезированные фирмой "Медиген" (Новосибирск, Россия), эндонуклеазу рестрикции PstI ("Thermo scientific", Литва), как это описано в работе Wu et al. (2004) [12]. К 10,5 мкл смеси (9 мкл H₂O : 1 мкл 10-кратного буфера: 0,5 мкл рестриктазы PstI) добавляют по 5 мкл соответствующего ПЦР продукта, осторожно перемешивают и кратко центрифугируют на вортексе. Последующую инкубацию образцов проводят при 37°C в течение 16 часов в термостате "Термит" ("ДНК-Технология", Россия). Электрофорез осуществляют в TAE-буфере в 1,5% агарозном геле (150 B, 80 Вт, 400 мА, 25 мин), результаты реакций оценивают на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете после окрашивания этидиумом бромидом. Специфичность продукта рестрикции оценивают относительно стандартного маркера молекулярного веса ДНК ("Thermo scientific", Литва): при наличии фрагмента размером 1118 пар нуклеотидов (пн) идентифицируется A аллель, при наличии двух фрагментов размером 936 и 181 п.н. - G аллель. При выявлении у обследуемого GG-генотипа прогнозируют высокую вероятность развития ХРИ.

С целью выявления ассоциации полиморфного локуса 1267A/G гена HSPA1B с формированием ХРИ были обследованы находившиеся на стационарном лечении в клинике 120 рабочих (только мужчины) производства каустика, подвергшиеся хроническому воздействию паров ртути. Обследуемые были распределены в две группы: группа 1 (n=46) - контактировавшие с ртутью и не имеющие диагноза хроническая ртутная интоксикация, группа 2 (n=74) - с установленным диагнозом ХРИ. Средний возраст и стаж работы в контакте с парами ртути для пациентов из группы 1 составили 52,4 (38-62) и 16,9 (6-32) лет, для группы 2 - 47,8 (32-60) и 19,3 (5-34) лет соответственно.

Обследование было выполнено в два этапа. Через 2-3 года после завершения первого этапа были получены образцы ранее не изученных индивидов, которые дополнили выборку. За время между двумя обследованиями было отмечено не только изменение стадии заболевания для 14,3% пациентов из группы 2 (со 2-й стадии на 3-ю), но и нескольким индивидам из группы 1 был поставлен диагноз ХРИ.

Многолетние наблюдения за рабочими (с конца 70-х годов прошлого века) и клиническое обследование были выполнены специалистами в области профессиональной патологии на базе клиники Института. У пациентов с диагнозом профессиональной ХРИ выявлено прогрессирование тяжести клинических проявлений интоксикации и формирование органического поражения нервной системы [2].

Названные группы были сформированы из рабочих двух предприятий Иркутской области. На первом предприятии технология ртутного электролиза применялась с 1979 по 2006 год, на втором - с 1943 по 1998 год, после чего использовалась диафрагменная технология производства каустика.

Статистический анализ выполнен с использованием пакета прикладных программ "STATISTICА 6.1" (StatSoft, USA) и программы с открытым доступом SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats_web). Различия между группами по частотам генотипов оценивали с помощью точного критерия Фишера при выборе двухстороннего критерия статистической значимости. Логистическую регрессию выполняли для выявления ассоциаций изученных полиморфных локусов с ХРИ для трех видов генетических моделей - рецессивной, доминантной и аддитивной. Результаты анализа представляли в виде отношения шансов (OR), 95% доверительного интервала (CI) и точного уровня значимости p. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез p<0,05. Использовали χ²-тест для проверки соответствия равновесию Харди-Вайнберга.

В результате проведенного молекулярно-генетического исследования выявлены отличия в распределении генотипа GG локуса 1267A/G гена HSPA1B между группами рабочих. Это выражалось в его повышенной частоте (p=0,003 ; OR=12,41, 95% CI 1,62-263,72) в группе пациентов с диагнозом ХРИ по сравнению с группой рабочих без данного заболевания (таблица 1). GG генотип был обнаружен у 16 из 74 пациентов из группы с диагнозом ХРИ, что составляло 21,6%. При этом 15 из 16 носителей такого генотипа имели ХРИ (93,8%).

Дальнейший анализ (логистической регрессии для трех генетических моделей) выявил ассоциацию гомозиготного по редкому аллелю генотипа GG локуса HSPA1B (1267A/G) с риском развития ХРИ, о чем свидетельствовали OR=12,41, p=0,001 и OR=2,25, p=0,005 для рецессивной и аддитивной модели соответственно (таблица 2).

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что маркером риска развития ХРИ является гомозиготный по редкому аллелю GG-HSPA1B (+1267A/G) генотип. Носителям GG генотипа, имеющим высокую индивидуальную чувствительность к воздействию ртути и риск развития хронической ртутной интоксикации, следует рекомендовать смену места работы, назначить динамическое наблюдение за состоянием здоровья и программу профилактических мероприятий в случае наличия в анамнезе контакта с ртутью.

Важно отметить, что носительство данного GG-генотипа было также выявлено у одного обследованного из группы 1 (возраст - 33 года, продолжительность контакта с парами Hg⁰ - 13 лет). Полученные результаты подчеркивают необходимость наблюдения этого молодого человека, имеющего высокий потенциальный риск развития ХРИ в будущем. Обоснованность такой рекомендации подтверждается фактами постановки диагноза ХРИ рабочим, которые на первом этапе обследования были отнесены к группе не имеющих данное заболевание.

Пример 1

Пациент Г., 43 года, стаж работы в условиях контакта с парами металлической ртути 19 лет (здесь и далее данные на момент забора образцов крови для генотипирования). По данным санитарно-гигиенической характеристики уровень содержания ртути на рабочем месте превышал ПДК в 1,5-2 раза. Содержание ртути в моче 5,0 мкг/л, в крови 6,0 мкг/л - в пределах допустимых значений. В неврологическом статусе без отклонений, при осмотре психиатром выявлен легкий астенический синдром. На первом этапе обследования выявлено носительство GG-HSPA1B (+1267A/G) генотипа при отсутствии признаков клинического проявления ртутной интоксикации.

На втором этапе обследования у пациента Г. были выявлены изменения, расцененные как признаки ранних субклинических проявлений ртутной интоксикации. Позднее пациенту был установлен диагноз: профессиональная хроническая ртутная интоксикация 1-2 ст. (умеренно выраженное эмоционально-лабильное (астеническое) расстройство с дистимоподобными колебаниями настроения, аффектами субдепрессивного, эксплозивного характера, легкими когнитивными нарушениями, преимущественно в сфере мнестической деятельности; цефалгический синдром по типу головной боли напряжения; нерезко выраженный дрожательный гиперкинез). Пациент направлен на медико-социальную экспертизу (МСЭ) для определения группы инвалидности и установления процента утраты трудоспособности. Пациент отстранен от работы в контакте с ртутью и другими нейротоксикантами.

Заключение: носительство GG-генотипа ассоциирует с ХРИ.

Пример 2

Пациент Б., 52 года, стаж работы в условиях контакта с парами металлической ртути 24 года. По санитарно-гигиенической характеристике содержание паров ртути на рабочем месте превышало ПДК за различные годы в 2-11 раз. Содержание ртути в моче находилось в пределах нормативных значений (17,1 мкг/л). При осмотре неврологом - оживленные рефлексы с рук, другой неврологической симптоматики не выявлялось. Психиатром установлено легкое астеническое расстройство. Выявленные изменения у пациента Б. были расценены как признаки ранних субклинических проявлений ртутной интоксикации. Пациент Б. был взят на динамическое наблюдение. На первом этапе обследования выявлено носительство GG-HSPA1B (+1267A/G).

При повторном обследовании в клинике у больного сформировалась профессиональная хроническая ртутная интоксикация 1-й стадии: эмоционально-лабильное (астеническое) расстройство с умеренно выраженными эмоционально-личностными нарушениями (ипохондрический компонент с эмоционально-аффективной неустойчивостью, аффекты эксплозивного характера), легкое когнитивное расстройство; вегетативная дисфункция, циркуляция ртути в организме. Пациент оставлен на прежнем месте работы при условии отсутствия контакта с ртутью.

В динамике отмечено прогрессирование заболевания, пациенту установлен диагноз: профессиональная хроническая ртутная интоксикация 2-й стадии (токсическая энцефалопатия, органическое расстройство личности по астеническому типу с умеренно выраженными эмоционально-волевыми и умеренными когнитивными нарушениями в сфере мнестической и ассоциативно-мыслительной деятельности; диссомнические нарушения). Пациент направлен на МСЭ для определения группы инвалидности и установления процента утраты трудоспособности.

Заключение: носительство GG-генотипа ассоциирует с ХРИ.

Пример 3

Пациент Ж., 47 лет, стаж работы в условиях контакта с парами металлической ртути 26 лет. По санитарно-гигиенической характеристике содержание паров ртути на рабочем месте превышало ПДК в различные годы в 3,5-9 раз. Содержание ртути в моче находилось в пределах нормативных значений (10,0 мкг/л), в крови - 4,0 мкг/л. При осмотре неврологом - дистальный умеренный гипергидроз рук и ног, другой неврологической симптоматики не выявлялось. Психиатром установлен легкий астенический синдром. Выявленные изменения у пациента Ж. были расценены как признаки ранних субклинических проявлений ртутной интоксикации. Пациент Ж. был взят на динамическое наблюдение. На первом этапе обследования выявлено носительство GG-HSPA1B (+1267A/G) генотипа.

При повторном обследовании в клинике у больного сформировалась профессиональная хроническая ртутная интоксикация 1-2-й стадии: органическое астеническое тревожное расстройство с сенситивно-обсессивным компонентом (тревожно-мнительные мысли, навязчивые сомнения), аффектами субдепрессивного характера, мотивационно-волевыми нарушениями (эпизоды апато-гипобулии), легкими когнитивными расстройствами; вегетативная дисфункция в виде кардиоваскулярных нарушений по смешанному типу, перманентное течение, периферические вегетативные расстройства, дрожательный гиперкинез с интенционным компонентом, пирамидная недостаточность, микроциркуляция ртути в организме. Пациент направлен на МСЭ для определения группы инвалидности и установления процента утраты трудоспособности, работа в контакте с ртутью и другими нейротоксикантами противопоказана.

Заключение: носительство GG-генотипа ассоциирует с ХРИ.

Литература

1. Concise international chemical assessment document 50. Elemental mercury and inorganic mercury compounds: human health aspects. WHO, Geneva, Switzerland, 2003.

2. Bast-Pettersen R., Ellingsen D.G., Efskind J., Jordskogen R., Thomassen Y. A neurobehavioral study of chloralkali workers after the cessation of exposure to mercury vapor // Neurotoxicology. 2005. N 3. P. 427-437.

3. Wastensson G., Lamoureux D., , Beuter A., Barregard L. Quantitative assessment of neuromotor function in workers with current low exposure to mercury vapor // Neurotoxicology. 2008. N 4. P. 596-604.

4. Лахман О.Л., Катаманова E.B., Константинова Т.Н., Шевченко О.И., Мещерягин В.А., Андреева О.И., Русанова Д.В., Судакова Н.Г. Современные подходы к классификации профессиональной интоксикации ртутью // Экология человека. 2009. №12. С. 22-27.

5. Turturici G., Sconzo G., Geraci F. Hsp70 and its molecular role in nervous system diseases // Biochemistry Research International. 2011. URL: http://dx.doi.org/10.1155/2011/618127 (дата обращения: 14.02.2015).

6. Kampinga H.H., Hageman J., Vos M.J., Kubota H., Tanquay R.M., Bruford E.A., Cheetham M.E., Chen В., Hightower L.E. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins // Cell Stress Chaperones. 2009. N 1. P. 105-111.

7. Vos M.J., Hageman J., Carra S., Kampinga H.H. Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families // Biochemistry. 2008. N 27. P. 7001-7011.

8. Miller K., Ochudlo S., Opala G., Smolicha W., Siuda J. Parkinsonism in chronic occupational metallic mercury intoxication // Neurol Neurochir Pol. 2003. N 5. P. 31-38.

9. Способ дифференциальной диагностики начальных проявлений и первой степени хронической ртутной интоксикации. Патент RU 2513299 C1, заявка №2012157970/14, дата подачи заявки 27.12.2012.

10. Способ отбора стажированных работников, находящихся в контакте с парами металлической ртути, в группу риска развития хронической ртутной интоксикации. Патент RU 2460458 C1, заявка №2011107967/14, дата подачи заявки 01.03.2011.

11. Способ обнаружения индивидуальной предрасположенности к развитию висцеропатий у рабочих пылеопасных профессий. Патент RU 2354972 C2, заявка №2006146793/15, дата подачи заявки 26.12.2006.

12. Wu Y.R., Wang С.К., Chen СМ., Hsu Y., Lin S.J., Lin Y.Y., Fung H.C., Chang K.H., Lee-Chen G.J. Analysis of heat-shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of Parkinson's disease // Hum Genet. 2004. N 3. P. 236-241.