Способ комплексной переработки гриба трутовика лекарственного

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности, к комплексной переработке растительного лекарственного сырья.

Основой технологии извлечения биологически активных веществ из растительного сырья являются процессы экстракции.

Комплексная переработка гриба трутовика лекарственного (Fomitopsis officinalis Will., сем. трутовиковых - Polyporaceae, класс базидиомицетов - Basidiomycetes), произрастающего на лиственнице сибирской, называемого также лиственничная губка, характеризуется тем, что сырье измельчают и подвергают экстракции органическими растворителями и водой.

Известен способ переработки гриба (плодового тела) трутовика лекарственного, в котором гриб измельчают до размера частиц не более 0,25 мм, экстрагируют смесью хлороформ-спирт этиловый 96% (1:2) при соотношении сырья и экстрагента 1:40 в течение 120-ти часов, упаривают при температуре 50-60°С до остаточной влажности 5%, высушивают при температуре 60°С и давлении 0,5 атм до полного удаления хлороформа и спирта этилового, полученную массу растворяют в спирте этиловом 70% в соотношении 1:10 (патент RU 2409378 C1, опубл. 20.01.2011).

Недостатком известного способа являются его ограниченные функциональные возможности, поскольку он обеспечивает экстракцию только липофильных веществ из плодового тела гриба трутовика.

Известен способ получения агарициновой кислоты из гриба трутовика лекарственного, включающий экстракцию измельченного сырья этанолом при определенных условиях, упаривание экстракта до определенного значения, отделение агарициновой кислоты, очищение перекристаллизацией при определенных условиях (Патент RU 2330676 С1, опубл. 10.08.2008).

Недостатком данного способа являются его ограниченные функциональные возможности и низкий коэффициент использования природного сырья, поскольку он обеспечивает выделение только агарициновой кислоты.

Известен способ переработки березового гриба - чаги путем экстракции горячей водой с помощью ультразвука частотой 20-55 КГц, интенсивностью 0,1-2,3 Вт/см² при 60-65°С в течение 50-60 мин. В результате получают средство, обладающее противоязвенной и адаптогенной активностью (Патент SU 1805968 A3, опубл. 30.03.93).

Недостатком известного способа является низкий коэффициент использования сырья, поскольку извлекаются только водорастворимые компоненты сырья, и не предусматривается дальнейшая переработка сырья. В результате целевой продукт содержит только водорастворимые вещества чаги, а биологически активные вещества, такие как терпены, каротиноиды, токоферолы и другие, не извлекаются из сырья.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом является способ комплексной переработки гриба трутовика лекарственного, заключающийся в том, что сырье измельчают до размера частиц 1-3 мм и подвергают четырехступенчатой экстракции, при этом на первой ступени сырье экстрагируют сжиженным диоксидом углерода при давлении 6,0-7,0 МПа, температуре 22-26°С в течение 10-12 часов с выделением углекислотного экстракта, затем на второй ступени остаток экстрагируют диэтиловым эфиром при температуре 34-36°С в течение 2-3 часов с выделением эфирного экстракта и остатка, который на третьей ступени экстрагируют 70-96% этиловым спиртом в течение 3-6 часов при температуре 78-80°C с выделением спиртового экстракта, на четвертой ступени остаток экстрагируют водой при температуре 98-100°С в течение 3-5 часов с последующим настаиванием в течение 10-12 часов при температуре 18-22°С, с выделением водного экстракта (Патент RU 2257222 С1, опубл. 27.07.2005).

Недостатками известного способа являются: низкий коэффициент (эффективность) использования сырья, поскольку не полностью экстрагируют компоненты биологически активных веществ, а также не выделяют хитин-глюкановый комплекс.

Задачей изобретения является разработка комплексной технологии с получением максимального количества разнообразных биологически активных продуктов.

Технический результат заключается в повышении эффективности использования гриба трутовика лекарственного при его комплексной переработке.

Указанный технический результат достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Грибы (плодовые тела) трутовика лекарственного измельчают до частиц с размерами не более 150 мкм при помощи вихревой мельницы. Далее проводят трехступенчатую экстракцию в аппарате Сокслета при 25-кратном избытке экстрагента в течение 5-6 часов. Для этого измельченное сырье в виде порошка светло-коричневого цвета экстрагируют на первой ступени гексаном, растворитель отгоняют на ротационном испарителе и получают гексановый экстракт в количестве 2,0-2,6%, содержащий эфирное масло, каротиноиды, витамины Е, А и стерины. Остаток, полученный после экстракции гексаном, на второй ступени экстрагируют этилацетатом, растворитель отгоняют на ротационном испарителе и получают этилацетатный экстракт в количестве 25,0-30,0%, содержащий каротиноиды, жирные ненасыщенные кислоты, агарициновую кислоту, витамин А и стерины. Остаток, полученный после экстракции этилацетатом, на третьей ступени экстрагируют метиловым спиртом, растворитель отгоняют на ротационном испарителе и получают метиловый экстракт в количестве 20,0-24,0%, содержащий каротиноиды, биофлавоноиды, витамин К и агарициновую кислоту. Остаток, полученный после экстракции метиловым спиртом, на четвертой ступени экстрагируют водой при 4-8-кратным избытке в воздушном термостате при 69-71°С в течение 4-х часов, фильтруя и повторяя операцию еще три раза. Фильтраты объединяют, получают водный экстракт четвертой ступени в количестве 2,0-3,2%, содержащий углеводы, часть дубильных веществ, витамины В1, В2, В6, Р.

Нерастворимый остаток (жом) подвергают нагреванию при 90-92°С при перемешивании в течение 5-6 часов с 6%-ным водным раствором гидроксида натрия (NaOH) при соотношении остаток:гидроксид натрия, равном 1:10, охлаждают, фильтруют и промывают водой, к полученному осадку добавляют 2% водный раствор хлористого водорода, при соотношении остаток:раствор хлористого водорода, равном 1:10, смесь нагревают до 60-62°С при перемешивании в течение 5-6 часов, охлаждают, фильтруют, осадок промывают водой и получают продукт, содержащий хитин-глюкановый комплекс. Выход составляет 1,3-1,4%.

В результате получают четыре грибных экстракта, содержащих биологически активные компоненты, в том числе эфирные масла, каротиноиды, органические кислоты, витамины, стероиды и биофлавоноиды, которые могут с успехом использоваться в косметологии, пищевой промышленности, в медицине и ветеринарии. Например, гексановый и водный экстракты гриба обладают выраженной антимикробной активностью и могут быть использованы в медицине в качестве противовоспалительного средства. Кроме этого, дополнительно получают продукт, содержащий хитин-глюкановый комплекс, который может быть использован для изготовления противоожоговой мази, эмульсий, пластырей и других ранозаживляющих средств наружного применения, а также для выделения грибного хитина.

Комплексная переработка гриба трутовика лекарственного предлагаемым способом позволяет повысить эффективность использования сырья, более конкретно, повысить выход извлекаемых биологически активных веществ до 58,8-60,2% (выход извлекаемых веществ в условиях способа-прототипа составляет 50,2%), а также дополнительно получать продукт, содержащий хитин-глюкановый комплекс.

Определяющими отличиями предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются

1. Исходное сырье измельчают до частиц с размером не более 150 мкм, что позволяет увеличить выход экстрагируемой фракции и снизить энергозатраты на экстрагирование. (В прототипе сырье измельчают до частиц с размерами 1-3 мм).

2. Измельченное сырье подвергают трехступенчатой экстракции в аппарате Сокслета при 25-кратном избытке экстрагента в течение 5-6 часов, при этом на первой ступени экстракцию осуществляют гексаном, на второй ступени - этилацетатом, на третьей ступени - метиловым спиртом, а на четвертой ступени - остаток, полученный после экстракции метиловым спиртом, экстрагируют водой при 4-8-кратном избытке экстрагента, что позволяет максимально извлекать биологически активные вещества, такие как эфирные масла, каротиноиды, органические кислоты, витамины, стероиды и биофлавоноиды. (В прототипе на первой ступени экстракцию проводят диоксидом углерода, на второй - диэтиловым эфиром, на третьей - 70-96% этиловым спиртом, на четвертой - водой).

3. Нерастворимый остаток (жом) подвергают нагреванию с 6%-ным водным раствором гидроксида натрия при весовом соотношении остаток: гидроксид натрия, равном 1:10, смесь нагревают до 90-92°С в течение 5-6 часов, охлаждают, фильтруют и промывают водой, к полученному осадку добавляют 2% водный раствор хлористого водорода, при соотношении остаток: раствор хлористого водорода, равном 1:10, смесь нагревают до 60-62°С в течение 5-6 часов, охлаждают, фильтруют и осадок промывают водой, что позволяет дополнительно получать продукт, содержащий хитин-глюкановый комплекс.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Плодовые тела гриба трутовика лекарственного (1 кг) измельчали сначала на кусочки с размерами до 1 см в диаметре, а затем на частицы с размерами не более 150 мкм при помощи вихревой мельницы. На фиг. 1 представлена микрофотография порошка гриба трутовика лекарственного (масштабный отрезок 100 мкм). Затем измельченную биомассу гриба (порошок) в количестве 50 г с влажностью 6,1% экстрагировали в аппарате Сокслета на первой ступени гексаном в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:25, в течение 6 часов. После отгонки растворителя на ротационном испарителе получили 1,22 г (2,60% от а.с.с.) гексанового экстракта (образец №1). Остаток, полученный после экстракции гексаном, на второй ступени экстрагировали этилацетатом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:25, в течение 6 часов. После отгонки на ротационном испарителе получили 13,82 г (29,44% от а.с.с.) этилацетатного экстракта. Остаток, полученный после экстракции этилацетатом, на третьей ступени экстрагировали метиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:25, в течение 6 часов. После отгонки на ротационном испарителе получили 11,43 г (24,35% от а.с.с.) спиртового экстракта. Остаток, полученный после экстракции метиловым спиртом, на четвертой ступени экстрагировали водой в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:8, в конической колбе в воздушном термостате при 69°С в течение 4-х часов, фильтруя и повторяя операцию еще три раза, отгоняли от объединенного экстракта воду на ротационном испарителе, и получили водный экстракт в количестве 1,94 г (4,13% от а.с.с.) (образец №2). Итоговое извлечение составило 28,41 г (60,2% от а.с.с).

К невысушенному нерастворимому остатку добавили 100 мл 6%-ного раствора гидроксида натрия и нагревали при 92°С с перемешиванием на магнитной мешалке в течение 5 часов, охлаждали до температуры 22°С и фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр, промывая затем водой до нейтральной реакции раствора по универсальной индикаторной бумаге. Осадок переносили в коническую колбу, добавляли 40 мл 6%-ного раствора соляной кислоты и нагревали при 62°C с перемешиванием на магнитной мешалке в течение 5 часов, охлаждали до температуры 22°С и фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр, промывая затем водой до нейтральной реакции раствора по универсальной индикаторной бумаге. После высушивания в эксикаторе над концентрированной серной кислотой получили 0,66 г (1,4% от а.с.с.) хитин-глюканового комплекса.

Пример 2.

Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что экстракцию органическими растворителями проводили в течение 5 часов, а экстракцию водой проводили при соотношении сырье-экстрагент, равном 1:6, в конической колбе в воздушном термостате при 71°C в течение 4-х часов. Получили 0,94 г (2,00% от а.с.с.) гексанового экстракта, 13,84 г (29,50% от а.с.с.) этилацетатного экстракта, 11,27 г (24,04% от а.с.с.) метанольного экстракта и 1,52 г (3,24% от а.с.с.) водного экстракта. Итоговое извлечение составило 27,57 г (58,78% от а.с.с).

К невысушенному нерастворимому остатку добавили 100 мл 6%-ного раствора гидроксида натрия и нагревали при 90° с перемешиванием на магнитной мешалке в течение 6 часов, охлаждали до температуры 22°С и фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр, промывая затем водой до нейтральной реакции раствора по универсальной индикаторной бумаге. Осадок переносили в коническую колбу, добавляли 40 мл 6%-ного раствора соляной кислоты и нагревали при 60°C с перемешиванием на магнитной мешалке в течение 6 часов, охлаждали до температуры 22° и фильтровали под вакуумом через стеклянный фильтр, промывая затем водой до нейтральной реакции раствора по универсальной индикаторной бумаге. После высушивания в эксикаторе над концентрированной серной кислотой получили 0,65 г (1,39% от а.с.с.) хитин-глюканового комплекса.

Пример 3.

Для сравнения с образцом №2 (водный экстракт), полученным при комплексной переработке трутовика лекарственного заявляемым способом, получили тотальный водный экстракт из исходного сырья.

Для этого измельченную биомассу гриба трутовика лекарственного в количестве 25 г с влажностью 6,1% экстрагировали водой в конической колбе в воздушном термостате при 70°С в течение 4-х часов, фильтруя и повторяя операцию еще три раза. После концентрирования на ротационном испарителе объединенных фильтратов получили 13,23 г (56,4% от а.с.с.) тотального водного экстракта (образец №3).

Пример 4. Исследование антимикробной активности полученных образцов грибных экстрактов.

Определение антибактериальной активности образцов полученных грибных экстрактов проводили, применяя метод лунок в толще агара (Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. Москва: Академия, 2005, 608) согласно известной методике (Айрапетова А.Ю. и др., Известия Самарского научного центра Российской академии наук, 2011, 13(1-4).

Для тестирования использовали штаммы бактерий из коллекции ИЦиГ СО РАН. В качестве препарата сравнения использовали аптечную настойку календулы.

Определение антибактериальной активности проводили на чашках Петри в шести повторностях. В чашки наливали по 15 мл расплавленной агаризованной среды LB (Лурия-Бертани). Слой агара в чашке Петри заливали 0,5-1 мл суспензии каждого микроорганизма в физиологическом растворе. Излишек взвеси удаляли, подсушивали поверхность агара в течение 30 минут. Затем сверлом (7 мм диаметром) делали 6 отверстий на одинаковом расстоянии от центра чашки и друг от друга. Лунки заполняли образцами грибных экстрактов, растворителем (отрицательный контроль) и аптечной настойкой календулы (положительный контроль). Чашки оставляли при комнатной температуре на 30 минут, после чего их ставили в термостат при температуре 37°С, не переворачивая. Под крышку каждой чашки Петри помещали стерильный фильтр во избежание попадания конденсата на лунки. Зоны угнетения роста микроорганизмов измеряли через 16 часов. Оценку результатов проводили по диаметру зон задержки роста вокруг лунки, включая диаметр самой лунки:

- отсутствие зоны задержки роста - испытуемая культура не чувствительна к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста 10 мм - умеренная чувствительность культуры к данной концентрации препарата;

- диаметр зоны задержки роста более 10 мм - высокая чувствительность испытуемой культуры к данной концентрации препарата.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1, из которой видно, что образцы №1, 2 обладают антимикробной активностью в отношении бактерий рода Bacillus, Klebsiella pneuminiae, Salmonella typhimurium в большей степени, чем препарат сравнения - настойка календулы. Также образец №1 обладает большей антимикробной активностью в отношении Salmonella typhimurium, чем образец №2, препарат сравнения, а также водный экстракт трутовика лекарственного (образец №3). При этом образцы №1, 2 не подавляют рост штамма бактерии Escherichia coli (представитель кишечной микрофлоры).

Предлагаемый способ позволяет осуществлять более эффективное использование гриба трутовика лекарственного при его комплексной переработке с получением дополнительных биологически активных компонентов. Применение четырехступенчатой экстракции с использованием экспериментально подобранных растворителей, а также варьирование технологических параметров (измельчение сырья, соотношения сырья и экстрагента, температуры, продолжительности ступеней экстракции) позволяет расширить ассортимент биологически активных веществ, получаемых из трутовика лекарственного и получить экстракты, не подавляющие рост кишечной микрофлоры, но избирательно действующие в отношении патогенных микроорганизмов. Полученные гексановый, этилацетатный, метанольный и водный экстракты трутовика лекарственного могут быть использованы для получения антимикробных препаратов медицинского и ветеринарного назначения.