Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИИ Bacillus stratosphericus, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ ЭТАНОЛ ИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ БИОМАССЫ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для промышленного производства этанола, а также в различных отраслях, например в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве для производства кормов.

К настоящему времени известны различные микроорганизмы, используемые для получения спирта. Наиболее распространенным продуцентом биоэтанола являются дрожжи - Saccharomyces cerevisiae. Эти микроорганизмы способны выдерживать высокие концентрации спирта и сахара, растут при высокой концентрации клеток, что позволяет им достигать значительной скорости наработки этанола. Однако все представители этого вида не способны к сбраживанию пентасахаров, что делает не выгодным их использование для переработки лигноцеллюлозной биомассы.

Например, известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae В-3855 - продуцент этилового спирта. Штамм является термотолерантным, способен эффективного сбраживать мелассную питательную среду с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см³ при температурах 30-32°С (патент RU 2492229 С1, оп. 10.09.2013). Однако этот микроорганизм имеет ряд существенных недостатков: низкая скорость роста и требовательность к субстрату.

Были предприняты попытки использования других видов дрожжей, способных к сбраживанию ксилозы до этанола. Наиболее изучены в этом направлении три вида дрожжей: Pichia stipites (заявка WO 2009004273 A1, оп. 08.01.2009); Pachysolen tannophilus (заявка WO 1982003874 A1, оп. 11.11.1982) и Candida lusitaniae (заявка WO 2010072093 Al, оп. 01.07.2010). Главным недостатком этих микроорганизмов является их чувствительность к воздействию ингибирующих агентов, образующихся в результате гидролиза лигноцеллюлозной биомассы.

Известен способ получения этанола путем сбраживания пентозы гидролизатов кукурузной кочерыжки дрожжами Pachysolen Zannophilus (Besic S., Grba S. Fermentation of hydrolyzate of corn stover hemicellulose to ethanol by Pachysolen tannophlus. Kem. Ind. 1990, v. 39, N2, p. 57-67, однако данный способ характеризуется низким выходом этанола из гидролизатов древесины, так как гексоза (преобладающая в древесине) и пентоза эффективно сбраживаются разными видами дрожжей при различных условиях проведения процесса.

Другим распространенным продуцентом этилового спирта является бактерия Zymomonas mobilis. Данные бактерии способны продуцировать этиловый спирт в высоких концентрациях (заявка WO 1986004357 A1, оп. 31.07.1986). Недостатком является их не способность к сбраживанию пентасахаров.

Известно, что бактерии рода Clostridium при сбраживании различных углеводов синтезируют этанол. Так, штамм Clostridium acetobutylicum ВКМ B-2512D является продуцентом н-бутилового спирта, ацетона и этанола (патент RU 2393213 С1, оп. 27.06.2010).

Также известен штамм Clostridium thermocellum (заявка WO 2012109578 А2, оп. 16.08.2012), способный продуцировать этиловый спирт. Данный штамм несет мутантный генотип с делецией в гене фермента формиат пируват лиазы, что приводит к прекращению наработки формиата, соответственно к снижению выхода побочных продуктов.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов бактерий, способных эффективно усваивать пентасахара, которые могут составлять до 40% от всех сахаров, содержащихся в растительной биомассе быстрорастущих травянистых растений. Такие растения являются наиболее перспективными источниками биомассы, которая может быть использована в качестве возобновляемого источника энергии и вещества целлюлозосодержащего сырья.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм бактерий Clostridium acetobutylicum, являющийся продуцентом бутанола, ацетона и этанола из целлюлозосодержащего сырья (патент RU 2381270 С1, оп. 10.02.2010). Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов, ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером B-2531D. Для культивирования штамма применяют питательные среды, содержащие автолизат кормовых дрожжей, биотин и парааминобензойную кислоту. Ферментацию ведут при термостатировании при 36-37°С в течение 40 часов. Выход этанола составляет 0,01-1,35%.

Недостатками известного штамма являются его анаэробность, что требует дополнительного оборудования и усложняет условия культивирования, а также потребность штамма в факторах роста (необходимость добавления в питательные среды пищевого сырья, например муки или отрубей, а также минеральных добавок).

Задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом этанола, способного к конверсии целлюлозосодержащего сырья в биоэтанол и устойчивого к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата.

Поставленная задача достигается получением штамма Bacillus stratosphericus, обладающего способностью продуцировать этанол из лигноцеллюлозной биомассы.

Технический результат: упрощение условий культивирования штамма и расширение ассортимента штаммов-продуцентов для переработки лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала донного осадка озера Соленое, Новосибирская область (Баганский район) в результате целенаправленного поиска.

Полученный штамм Bacillus stratosphericus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11677.

Штамм Bacillus stratosphericus ВКПМ В-11677 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамположительные палочки, растут на средах LB-бульон, LB-агар, среда Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой. При росте на агаризованной среде LB образует колонии неправильной формы белого цвета. Профиль колоний слегка выпуклый, размеры варьируют от 3 до 5 мм. Рост в жидких средах (LB-бульон) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, мезофил. Оптимальная температура роста 30-37°С. Хорошо растет в пределах рН среды от 6,5 до 7,5. Штамм характеризуется способностью использовать в качестве субстратов пептон, дрожжевой экстракт. Не утилизирует цитрат, маннитол, малонат, инозитол, адонитол, сорбитол, дульцит, пируват, сахара (глюкозу, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, рамнозу, мелибиозу, раффинозу) и аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин, триптофан, фенилаланин). Не способен к гидролизу мочевины.

Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим действием.

Штамм является непатогенным и не включен в списки, приведенные в санитарных правилах СП 1.3.2322-08; штамм не несет опасных генетических конструкций.

Штамм идентифицирован на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют на среде Гетчинсона с глицерином при температуре -70°С.

Для культивирования штамма применяют среды следующего состава: Среда LB (г/л): хлорид натрия - 5.0; триптон - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0.

Среда Гетчинсона (г/л): NaNO₃ - 2.5, K₂HPO₄ - 1, (NH₄)₂SO₄ - 0.15, MgCl₂ - 0.15, NaCl - 0.1, CaCl₂ - 0.1, лигноцеллюлозная биомасса - 15, FeCl₃*6H₂O - 50 мкг.

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus stratosphericus, обладающий способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в биоэтанол, имеет ряд преимуществ, заключающихся в следующем.

1. Бактерии рода Bacillus имеют часть ферментов целлюлозолитического комплекса и, следовательно, продуцент этанола на основе штаммов Bacillus может стать хорошей основой для последующих работ, направленных на создание штамма, способного к прямой конверсии лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол.

2. На основе бактерий рода Bacillus возможно создание эффективных комплексов микроорганизмов, деградирующих лигноцеллюлозную биомассу и продуцирующих этанол.

3. Бактерии рода Bacillus обладают достаточно высокой скоростью роста и скоростью катаболических процессов, следовательно, скорость переработки лигноцеллюлозной биомассы в биоэтанол будет выше у других организмов.

4. Штамм бактерий Bacillus stratosphericus обладает устойчивостью к содержанию в среде ацетата и этанола, что делает его перспективным для использования в условиях производства.

5. Штамм является аэробом и мезофиллом, в связи с чем упрощаются условия его культивирования, поскольку не требуется дополнительный нагрев и поддержание высокой температуры среды культивирования.

6. Штамм проявляет более активный рост на лигноцеллюлозной биомассе, чем на богатых питательных средах (мясо-пептонный агар, Лурия-Бертани бульон), что будет способствовать удешевлению технологии переработки растительной биомассы.

7. Штамм устойчив к токсичным составляющим лигноцеллюлозого гидролизата, что позволит упростить технологию переработки растительной биомассы.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальной способностью перерабатывать лигноцеллюлозную биомассу в биоэтанол, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Bacillus stratosphericus и определение содержания этанола в культуральной жидкости.

Для получения биомассы и определения содержания биоэтанола в культуральной жидкости культуру штамма-продуцента рассевали штрихом на чашках с агаризованной средой Гетчинсона с лигноцеллюлозной биомассой таким образом, чтобы были получены отдельные колонии. Засеянные чашки культивировали в суховоздушном термостате в течение 24-48 часов при температуре 37°С. Затем 20 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы инокулировали одной колонией нарабатываемого штамма. Культивировали при 37°С в течение 12 часов на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 200 оборотов в минуту. После этого к 200 мл среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы в литровой конической колбе добавляли 4 мл наработанной культуры. Культивирование проводили при 37°С на орбитальном шейкере при скорости перемешивания 250 оборотов в минуту до достижения оптической плотности OD600~0.90-0.95. В полученной таким образом культуральной жидкости определяли содержание этанола.

Содержание этанола в культуральной жидкости определяли методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на хроматографе Agilent Technologies 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973N и кварцевой колонной DB-1. Газ-носитель - гелий с постоянным потоком 1 мл/мин. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 50°С, выдержка при начальной температуре 5 мин, далее нагрев до температуры 250°С со скоростью 25°С/мин, выдержка при конечной температуре 7 мин. Ввод пробы осуществляли с помощью микрошприца, объем вводимой пробы 1 мкл, температура инжектора 250°С. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Через 15 часов культивирования отбирали 350 мкл культуральной жидкости в пробирку (1,7 мл) и добавляли 1050 мкл 0,5 M ТОА (триоктиламин) в ТБФ (трибутилфосфат). Экстракцию проводили при помощи перемешивания на шейкере (15 минут). Затем отбирали 1 мл органического растворителя с экстрактом в стеклянный бокс для хроматографа. Концентрацию этилового спирта определяли сравнением площадей пиков экспериментальных образцов с калибровочными растворами. Выход этанола составил 0,3%.

Пример 2. Наработка биоэтанола штаммом Bacillus stratosphericus.

Для определения количества биоэтанола, нарабатываемого штаммом Bacillus stratosphericus, было проведено культивирование штамма в вихревом биореакторе "Vortex-5" с программируемым блоком управления («Центр вихревых технологий», Россия) следующим образом.

Предварительно исследуемую культуру выращивали на питательной среде Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы при температуре 37°С в 1/10 объема от предполагаемого объема культуральной жидкости в биореакторе. Через 12 часов переносили инокулят в биореактор, заполненный 3-мя литрами среды Гетчинсона с фильтратом лигноцеллюлозной биомассы. В ходе культивирования поддерживали температуру 37°С и рН 7.0. Начальный этап культивирования проводили в аэробных условиях. Перемешивание осуществляли вихревым образом при помощи воздушной мешалки (2600 об/мин). В полученной культуральной жидкости определяли содержание этанола аналогично примеру 1. Выход этанола составил 0,4%.

Использование предлагаемого штамма позволит упростить процесс культивирования последнего и расширить ассортимент штаммов, обладающих способностью переработки лигноцеллюлозной биомассы в этанол.