Результат интеллектуальной деятельности: Штамм Pseudomonas libanensis B-3041D для очистки почвенных и водных сред от нефтяных углеводородов

Изобретение относится к области биотехнологии и касается выделения и применения нового природного штамма бактерии для очистки почвенных и водных сред от нефтяных углеводородов, в том числе для окисления нафтеновых углеводородов и полиароматических соединений в диапазоне температур от +4 до +22°С.

Известен штамм бактерий Exiguobacterium sp. ELA-6, обладающий способностью утилизировать нефть и нефтепродукты, который может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С [RU №2564105, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 27.09.2015].

Известен штамм бактерий Serratia plymuthica ELA-9, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) и может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С [RU №2560272 С1, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 20.08.2015].

Известен биопрепарат, содержащий нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis. [SU №1805097 А1, МПК C02F 3/34, E02B 15/04, опубл. 1993.03.30].

Известен консорциум штаммов микроорганизмов - деструкторов: Alcaligenes denitrificans, ВКМ В - 2085 Д, Bacillus species ВКМ В - 2086 Д, Psendomonas putida ВКМ В - 2087 Д, Aeromonas species ВКМ В - 2088 Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов и вод от нефти, нефтепродуктов и остаточной замазученности [RU №2115629 С1, МПК C12F 3/34, В09С 1/10, опубл. 1998.07.20].

Известен консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов: Bacillus species ВКМ В - 2078 Д, Aeromonas species BKM B - 2079 Д, Alcaligenes eutrophus ВКМ В 2075 Д, Alcaligenes eutrophus ВКМ В - 2076 A, Alcaligenes denitrificans ВКМ В 2077 Д, используемый для очистки почв, почвогрунтов, вод от нефтяных загрязнений. [RU №2182529 С1, МПК В09С 1/10, C02F 3/34, C12N 1/20, C12N 1/26, опубл. 2002.05.20].

Известен штамм архебактерий Bacillus sp.ВКПМ В-5061 - деструктор нефтепродуктов и фосфатов, используемый при очистке почвы и сточных вод. [RU №2204597 С2, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, опубл. 2003.05.20].

Известные штаммы и биопрепараты направлены на очистку от нефти и нефтепродуктов в водных средах и почвах, но нет описания по снижению конкретных нефтепродуктов - ПАУ, алканов.

Наиболее близким аналогом является штамм бактерий из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами, прибрежной экосистемы юга Дальнего Востока, используемый для очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений, Bacillus sp. [RU №2083667 С1, МПК C12N 1/20, B09C 1/10, C02F 3/34, опубл. 1997.07.10].

В описании патента нет данных по снижению конкретных нефтепродуктов - ПАУ, алканов. Недостатком штамма является недостаточная эффективность очистки в условиях пониженных температур.

Задача изобретения - получение нового природного штамма бактерии, обеспечивающего биодеструкцию в почвенных и водных средах нефтяных углеводородов, в том числе нафтеновых углеводородов и полиароматических соединений. Предлагаемый штамм эффективен для очистки от нефтяных загрязнений почвенных и водных сред в температурном диапазоне от +4 до +22°С.

В этом состоит технический результат.

Для достижения технического результата из загрязненных нефтью почв Усинского района Республики Коми выделен способный к нефтеокислению природный бактериальный штамм Pseudomonas libanensis ВКМ B-3041D. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина.

Описание условий, необходимых для культивирования штамма: Штамм культивируют методом глубинной ферментации на среде 1 следующего состава:

на 1000 мл воды NaNO₃ - 3.0; KH₂PO₄ - 1.0; KCl - 0.5; MgSO₄×5H₂O - 0.5; FeSO₄ - 0.01; NaCl - 1.5; пептон ферментативный - 20.0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1.0; алканы (или сырая нефть) - 10.0; культивирование при 15-25°С в шейкере при 220 об/мин, 3-5 суток.

Штамм характеризуется следующими признаками:

I. Культурально-морфологические:

Грамотрицательные прямые подвижные палочки. Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, прозрачные, с желтовато-зеленоватым оттенком. Консистенция слизистая. Выделяет в среду дифундирующий зеленоватый флюоресцирующий пигмент.

II. Физиолого-биохимические:

Аэроб. Оксидазоположительный, каталазоположительный, хемоорганотроф.

III. Хемотаксономические: Штамм обладает высокой нефтеокисляющей активностью в отношении нафтеновых углеводородов, способен эффективно снижать концентрацию растворенных в воде углеводородов и ряда ПАУ. Чувствителен к повышенной кислотности среды, способен проявлять высокую активность и в почвенной, и в водной среде.

IV. Данные молекулярно генетического анализа:

Результат анализа фрагмента гена 16S рРНК штамма 13-1 показал принадлежность к роду Pseudomonas, к филогенетически плотной "Pseudomonas fluorescens-группе".

На основании полученных результатов анализа фрагмента гена gyrB штамм идентифицирован как Pseudomonas libanensis Dabboussi et.al. 1999.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Рекомендуемые метод и условия сохранения: Длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - NaNO₃ - 3.0; KH₂PO₄ - 1.0; KCl - 0.5; MgSO₄×5H₂O - 0.5; FeSO₄ - 0.01; агар микробиологический - 20.0; пептон ферментативный - 20.0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1.0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.

Способность штамма к биодеструкции нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах. Результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Биодеструкция углеводородов в водной среде в присутствии штамма Pseudomonas libanensis ВКМ B-3041D.

Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт с сырой нефтью в качестве единственного источника углерода. На 1 л воды добавляли NaNO₃ - 5.0 г; KH₂PO₄ - 3.0 г; KCl - 0.5 г; MgSO₄×5H₂O - 0.5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение 20 минут в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной на среде 1 суспензией живой культуры. В колбы добавили (по схеме опыта) 0.5 г сырой нефти и 5 мл наработанного штамма Pseudomonas libanensis ВКМ В-3041D (титр клеток 10⁹ КОЕ/мл). Контрольную колбу микроорганизмами не заражали.

Условия опыта: культивирование в течение 7, 14, 21 суток (220 об/мин) при комнатной температуре.

Спустя 7, 14, 21 суток в пробах проводили определение содержания нефтепродуктов.

Содержание нефтепродуктов в почве анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98. Результаты приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, в присутствии испытуемого штамма в течение опыта происходит последовательное снижение нефтепродуктов в пробе. В течение 21 суток опыта общая концентрация нефти снизилась на 40%.

В течение опыта проводили оценку состава алкановой и полиароматической фракций нефти. Для этого из повторных опытных колб экстракцией гексаном извлекали нефтяную фазу. Далее методом колоночной хроматографии проводили разделение экстрактов. На колонке с оксидом алюминия отделяли фракцию н-алканов и полициклических ароматических соединений (фракция F1) от полярных соединений. Далее на колонке с силикагелем фракцию F1 разделяли на фракции н-алканов (F2) и полициклических ароматических соединений (F3).

Качественное и количественное определение содержания н-алканов проведено на хромато-масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo) в режиме селективной регистрации ионов (SIM) при энергии электронов 70 эВ. Сканирование в режиме SIM вели по трем ионам с массами 57, 71 и 85, характерным для предельных углеводородов. Идентификацию н-алканов на хроматограмме проводили предварительно в режиме полного ионного тока по их стандартным растворам. Методом внутреннего стандарта (внутренний стандарт - н-декан, 0.05 мг/см³) исследовали количественное содержание н-алканов.

В основу определения полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) в почве положена методика М 03-04-2002 - измерение массовой доли бенз[а]пирена в пробах почв, грунтов донных отложений и твердых отходов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием анализатора "Флюорат-02" в качестве флуориметрического детектора.

На фигуре 1 приведен график изменения структуры алкановой фракции нефти за 7 суток в присутствии Pseudomonas libanensis ВКМ B-3041D.

За 7 суток в присутствии культуры исследуемого штамма происходит незначительное изменение структуры алкановой фракции нефти, наблюдается снижение до 20-25% массовой доли алканов с длиной цепи С₂₇-С₃₀, на 50-70% снижается доля гомологов с длиной цепи С₁₃-С₁₄. (фиг. 1)

В более значительной степени за 7 суток произошло снижение массовой доли отдельных ПАУ. Так наблюдали быструю и эффективную трансформацию низкомолекулярных ПАУ: уменьшение в сравнении с контролем массы флуорена в 266 раз, фенантрена в 151 раз, антрацена в 6 раз, флуорантен исчез полностью, пирена в 4,5 раза, масса бенз[а]антрацена снизилась в 5 раз, тогда как высокомолекулярные ПАУ не окислялись, и наблюдали конденсацию «тяжелых» ПАУ: бенз[а]пирена, дибенз[a,h]антрацена и бенз[ghi]перилена (табл. 2).

Таким образом, представленный штамм проявляет активность для снижения массы нефтяных углеводородов и разрушения полиаренов в загрязненных нефтью водных средах.

Пример 2. Влияние биопрепарата на основе штамма Pseudomonas libanensis ВКМ B-3041D на очищение почвы от нефти

Дерново-подзолистую почву (300 г) увлажняли водой, загрязняли сырой нефтью (9 г), перемешивали в вегетационных сосудах, затем обрабатывали поливом рабочим раствором биопрепарата, полученного методом глубинной ферментации на среде 1 из штамма Pseudomonas libanensis ВКМ B-3041D. Рабочий раствор с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл вносили в количестве 30 мл в загрязненную почву и перемешивали. Контрольную, загрязненную нефтью почву, не обрабатывали. Часть опытных сосудов помещали в криокамеру при температуре от +4 до +7°С, часть в термостат при температуре +20 - +22°С. Опытные сосуды увлажняли поливом по мере подсыхания.

В начале опыта и течение опыта через 1,5 и 3 месяца пробы почвы анализировали по показателям загрязнения нефтью. Результаты приведены в табл. 3. Эффективность очистки при температуре +4 - +7°С за 3 месяца составила 33%, при температуре +20 - +25°С - 60%.

Таким образом, получен технический результат, показывающий эффективность полученного штамма для очистки от нефтяных загрязнений почвенных сред в температурном диапазоне от +4 до +22°С.