Результат интеллектуальной деятельности: Способ оценки состояния пародонта человека на устойчивость к развитию хронического генерализованного пародонтита на основании количественного определения бактерии-пародонтопротектора Veillonella parvula методом ПЦР в реальном времени

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, стоматологии и клинико-лабораторной диагностики, в частности к определению степени обсемененности пародонта человека Veillonella parvula - компонентом нормальной микрофлоры и потенциальным антагонистом пародонтопатогенов. Предметом изобретения является тест-система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая оценить степень обсемененности пародонта V. parvula.

Высокая обсемененность пародонта обследуемого пациента V. parvula позволяет сделать вывод о его высокой устойчивости к гиперколонизации патогенными видами Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Tannerella forsythensis, тогда как низкая представленность V. parvula в микробиоценозе пародонта или ее полное отсутствие является прогностическим признаком, свидетельствующим о повышенном риске сверхкритической колонизации пародонта патогенами с последующим развитием хронического генерализованного пародонтита (ХГП). Наибольшей эффективности при оценке состояния пародонта можно добиться за счет параллельного измерения представленности в микробиоценозе пародонта патогенов: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis, Treponema denticola [1-5] и V. parvula. Данный подход позволяет прогнозировать динамику развития заболевания, оценивать результативность курса лечения, пройденного пациентом.

Уровень техники

В настоящее время основной причиной развития пародонтита считается колонизация пародонта пародонтопатогенами красного комплекса по Сокранскому: A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и Т. denticola [6]. Все существующие методы лечения ХГП (антибиотикотерапия, фотодинамическая терапия, озонотерапия, использование инфракрасного лазера, аппараты типа «Вектор») направлены на снижение обсемененности пародонта этими видами. Специалисты и сами пациенты наблюдают положительный эффект от использования этих средств, однако, как правило, он оказывается неустойчивым: в срок от нескольких месяцев до нескольких лет пациенты, склонные к ХГП, вынуждены проходить повторные курсы лечения. Причины индивидуальной склонности пациентов к рецидивированию инфекции пародотопатогенов остаются неясными, однако можно предполагать, что они связаны с недостаточной представленностью в микробиоценозе пародонта бактерий-протекторов - антагонистов патогенов. В настоящее время в диагностике пародонтита не применяется анализ компонентов микробиоценоза пародонта, способных препятствовать его гиперколонизации патогенами. В целом, в литературе практически не уделяется внимания этому вопросу.

Одной из работ, в которой рассматривается вопрос наличия на пародонте как патогенной, так и протекторной микрофлоры, является статья «Идентификация ключевых элементов нормальной и патогенной микрофлоры, определяющей состояние пародонта, методом NSG-секвенирования банков 168-рДНК бактериальных консорциумов пародонта» [7]. В этой работе с применением метода NGS-секвенирования выявлены 6 родов потенциальных пародонтопротекторов и 8 родов потенциальных пародонтопатогенов, имеющих отношение к риску возникновения агрессивного (но не хронического) пародонтита. У лиц со здоровым пародонтом было выявлено статистически достоверное доминирование рода Veillonella, которое, таким образом, предложено рассматривать в качестве критерия здоровья пародонта. В качестве кандидатных пародонтопротекторов предложены также роды Streptococcus, Bergeyella, Granulicatella, Kingella и Corynebacterium.

Известны следующие аналоги данного изобретения

Патент №2306341, дата публикации 20.09.2007 (с 08.04.2010 патент прекратил действие, но может быть восстановлен): «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции»

Это изобретение позволяет определить пять парадонтопатогенов в одном образце с помощью мультиплексной ПНР, что достигается использованием комбинации 16s rDNA- праймеров в определенных концентрациях.

Набор содержит также комплект для подготовки пробы и положительный и отрицательный контрольные образцы. Анализ продуктов ПНР осуществляется методом электрофореза.

Патент №2420591, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis.

Патент №2420589, дата публикации 10.06.2011. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Prevotella intermedia. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов. Указанный результат достигается путем использования при постановке ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтотопагенного микроорганизма Prevotella intermedia.

Патент №2420592, дата публикации 10.06.2010. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans. Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале, забранном с помощью стоматологических зондов.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans.

Во всех перечисленных патентах предлагается оценивать обсемененность пародонта патогенными микроорганизмами, для чего предлагаются тест-системы, включающие наборы соответствующих синтетических олигонуклеотидов (праймеры и зонды) для проведения ПНР.

Предлагаемое изобретение отличается тем, что предлагается оценивать уровень обсемененности пародонта бактерией - антагонистом патогенных микроорганизмов (парадонтопротектором) Veillonella parvula методом ПЦР-РВ, для чего предлагается тест-система, содержащая набор праймеров и зондов, а также способ оценки состояния пародонта человека на предмет устойчивости к развитию хронического генерализованного пародонтита.

Раскрытие изобретения

Авторами предлагается способ оценки состояния пародонта человека на предмет устойчивости к развитию хронического генерализованного пародонтита, вызываемого P. gingivalis, P. intermedia и Т. forsythensis, в котором в качестве специфического маркера используется ДНК бактерии-пародонтопротектора Veillonella parvula.

Техническим результатом настоящего изобретения является метод достоверного обнаружения V. parvula в биологическом материале, с возможностью количественной оценки ДНК бактерии в пародонтальном смыве.

Данный результат достигается путем использования при проведении ПНР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопротекторного микроорганизма V. parvula по принципу ПНР в реальном времени включающего в себя праймеры и зонд:

где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Забор биологического материала из пародонтального кармана у пациентов осуществляется при помощи стерильных бумажных эндодонтических штифтов (размер №30-35), которые затем помещают в пробирку с реактивом «Проба-Рапид» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) объемом 0,5 мл и транспортируют в лабораторию в охлажденном состоянии, в течение 6 час. Забор проводят в двух повторностях от каждого пациента.

Выделение суммарной ДНК пародонтального смыва осуществляют при помощи набора реагентов «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Препарат ДНК, соответствующий 1/10 объема одного смыва (50 мкл), растворяют в 50 мкл элюирующего раствора (комплектация «Проба-ГС»). В качестве матрицы для проведения одной ПНР-реакции используют 5 мкл полученного препарата.

Методика проведения ПНР в реальном времени

1. В промаркированные полипропиленовые пробирки для ПЦР в реальном времени (Axygen), объемом 200 мкл вносят компоненты реакционной смеси для выполнения ПЦР.

Состав буфера на одну реакцию (20 мкл смеси), мкл:

- 18 - ПЦР буфер (Комплект реагентов для ПЦР амплификации, ООО «НПО ДНК-Технология», Россия);

- 1,695 - вода;

- 0,27 - dNTP 25 мкM;

- 0,014 - праймер 1,100 мкМ;

- 0,014 - праймер 2, 100 мкМ;

- 0,007 - зонд, меченный флуорофором Fam и гасителем BHQ, 50 мкМ.

В каждую пробирку вносят каплю расплавленного парафина для разграничения компонентов реакционной смеси до начала реакции.

Праймеры для выявления V. parvula, представляющие собой синтетические олигонуклеотиды к маркерному участку генома V. parvula длиной 322 п.н. - локусу pin0048 гена InpA, вводятся в реакцию с целью обеспечения амплификации продукта. Зонд, специфичный к этому же участку ДНК, имеет в своем составе флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции, а его 3'-конец не способен к удлинению ДНК-полимеразой за счет блокировки гидроксильной группы. В случае образования специфического продукта ДНК зонд специфически взаимодействует с ним и частично разрушается ДНК-полимеразой. При этом действие гасителя на флуоресцентную метку в пределах молекулы зонда прекращается за счет их разобщения, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции зонда. Сигнал флуоресценции реакционной смеси считывается термоциклером с оптической системой детекции в реальном времени или с некоторой периодичностью (например, один раз за цикл амплификации). Интенсивность флуоресценции зонда позволяет оценивать концентрацию образовавшегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности соединения праймеров с ДНК-матрицей, количества исследуемого материала и других параметров. Иными словами, праймеры обеспечивают протекание реакции, а зонд - оценку ее результатов.

2. Ex tempora приготавливают разведенный раствор Taq-полимеразы (Комплект реагентов для ПЦР амплификации, ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), смешивая стоковый раствор фермента и воду в соотношении: 0,5 мкл полимеразы на 10 мкл воды в расчете на одну реакцию. В каждую промаркированную пробирку вносят по 10 мкл свежеразведенного раствора Taq-полимеразы, не повреждая слой парафина, и 5 мкл раствора анализируемой ДНК. В каждую пробирку вносят по капле минерального масла, не повреждая слой парафина.

3. Отрицательный контрольный образец (ОКО) - образец, который вводится в определение без использования ДНК. Взамен нее в пробирку добавляют 5 мкл деионизованной воды. ОКО необходим для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце требует аннулировать результаты тестирования всей серии. Определение должно быть повторено с применением вновь приготовленных реагентов.

4. Пробирки устанавливают в термоциклер ДТ-322 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) или аналогичный по техническим возможностям. Общий объем реакционной смеси составляет 35 мкл.

Параллельно с определением специфических последовательностей ДНК V. parvula проводится определение общей бактериальной массы в образце (нормировочный параметр), для чего параллельно проводят реакцию ПЦР в реальном времени с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров и зонда:

где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Реакционную смесь для определения общей бактериальной массы проводят по методике, идентичной описанной для определения специфических последовательностей ДНК V. parvula за исключением того, что вместо праймеров SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 используют праймеры SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5, а вместо зонда SEQ ID NO 3 используют зонд SEQ ID NO 6 в эквивалентных молярных концентрациях.

Реакцию проводят со следующими параметрами циклирования:

Программа амплификации:

Настройки анализа, устанавливаемые на приборе:

Метод - Геометрический (Ср) (BF), cr=9, vt=10, tp=30, tv=5

Для каждой реакции программное обеспечение термоциклера автоматически вычисляет величину порогового цикла Ct.

Нормировку сигнала при определении специфических последовательностей ДНК V. parvula для каждого образца проводят вычисляя величину относительного Ct. Для этого из величин абсолютного Ct, полученных при определении специфических последовательностей ДНК V. parvula (усредненного по двум образцам одной серии), вычитают усредненную величину Ct общей бактериальной массы для того же образца серии. Нормальная обсемененность пародонта фиксируется при условии, что величина относительного Ct для V. parvula составляет 15,0 циклов или более.

Осуществление изобретения

Клинический материал был собран на базе МГМСУ им. А.И. Евдокимова. Было обследовано 153 пациента жителя Москвы и Московской области в возрасте от 16 до 70 лет. Основным критерием для постановки диагноза ХГП являлось разрушение зубодесневого прикрепления. Степень тяжести устанавливали на основании глубины пародонтальных карманов и степени деструкции костной ткани.

Клинические данные о состоянии пародонта пациентов выражали в баллах, как описано в работе [8]: степень выраженности заболевания (от 1 до 5), глубина пародонтального кармана (от 0 до 4). Возраст пациентов учитывался путем включения их в одну из групп: <30, 30-50, >50 лет.

Биологический материал из пародонтальных карманов исследовали отбирая содержимое с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов, которые затем помещали в пробирку с реактивом «Проба-Рапид» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) объемом 0,5 мл (пародонтальные смывы) и транспортировали в лабораторию в охлажденном состоянии. Обработку материала проводили в срок не свыше 6 час. Забор материала проводили в двух повторностях от каждого пациента, на стадии выделения ДНК и проведения ПНР-анализа каждая повторность обрабатывалась отдельно.

Суммарную ДНК пародонтального смыва пациентов выделяли при помощи набора реагентов «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) в соответствии с инструкцией к набору реагентов. Препарат ДНК, соответствующий 1/10 объема одного смыва (50 мкл), растворяли в 50 мкл элюирующего раствора (комплектация «Проба-ГС»). В качестве матрицы для проведения одной ПЦР-реакции использовали 5 мкл полученного препарата.

Для каждого образца проводили семь параллельных определений следующих параметров:

1. Определение специфических последовательностей ДНК V. parvula с применением праймеров SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 и зонда SEQ ID NO 3.

2. Определение общей бактериальной массы в образце с применением праймеров SEQ ID NO 4 и SEQ ID NO 5 и зонда SEQ ID NO 6.

3. Определение специфических последовательностей пародонтопатогенов по Сокранскому: A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, Т. forsythensis и Т. denticola с использованием методики и олигонуклеотидов, описанных ранее [5].

С целью нормировки сигнала (учета разброса в количестве взятого биоматериала и эффективности экстракции ДНК) для каждого образца определяли величину «относительного Ct» как для V. parvula, так и для пародонтопатогенов. Для этого из величины абсолютного Ct для специфического набора праймеров и зонда, усредненного по двум образцам одной серии, вычитали усредненную величину Ct общей бактериальной массы для тех же двух образцов серии. Статистической обработке подвергали данные, выраженные в форме относительного Ct.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 8.0 для Windows, по стандартным методикам вариационного анализа. Для проверки гипотезы о достоверности отличий пар выборок по исследуемому параметру (относительный Ct для V. parvula и пародонтопатогенов) использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. При анализе корреляций между исследуемыми параметрами в пределах выборки использовали корреляционный анализ по методу Спирмана. Во всех случаях уровень статистической значимости принимали за 95% (р≤0,05).

Исследуемая выборка (153 человека) включала группу контроля в размере 75 человек (пациенты без признаков пародонтита), средний возраст в группе 28 лет и группу случая (пациенты с диагнозом гингивит, ХГП легкой, средней и тяжелой степени), средний возраст составил 42 года. Можно сказать, что в группу контроля попало больше пациентов из более молодой возрастной категории, в то время как группа пациентов с ХГП оказалась более возрастной. Такой результат связан с объективными причинами: хронический пародонтит является возрастным заболеванием, что осложняет задачу подбора как молодых пациентов с диагнозом ХГП (чаще в молодом возрасте речь идет об агрессивном пародонтите) и возрастных пациентов с высокой степенью сохранности пародонта.

Соотношение размера выборок мужчин и женщин составило соответственно 61 и 92 человека (соотношения возрастов с разницей ±1 год соответствует значениям всей выборки). Внутри выборки женщин соотношения распределялись следующим образом: женщины из группы контроля - 51 пациент, женщины с диагнозом ХГП - 41 пациент; в группе мужчин группа контроля составила 27 человек, ХГП - 34 пациента.

Статистическая обработка результатов с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни показала существенные различия в уровне обсемененности пародонта V. parvula у пациентов с диагнозом пародонтит и в группе контроля. Так, параметр R в сравниваемых выборках равен 4, в то время как значение р (достоверность различий) составило 5,5×10^-5. Это свидетельствует, что обсемененность пародонта бактерией V. parvula здоровых пациентов значительно выше, чем у пациентов с ХГП, что, в свою очередь, подтверждает предположение о наличии протективных свойств у V. parvula.

При сравнении параметра «относительный Ct» для V. parvula в выборках мужчин и женщин статистически значимых различий выявлено не было. При сравнении по тому же параметру выборок здоровые женщины - женщины с диагнозом ХГП наблюдались различия на грани достоверности. Однако при сравнении параметра «относительный Ct» для V. parvula в выборках здоровые мужчины - мужчины с диагнозом ХГП различия параметра R составили 3,8 при достоверности различий (р)=1,3×10^-4.

В результате анализа корреляции в представленности на пародонте V. parvula и основных пародонтопатогенов по Сокранскому с помощью критерия Спирмана были получены следующие результаты: наблюдается выраженная обратная корреляция при сравнении степени обсемененности пародонта V. parvula и P. gingivalis (R=3,4, при р=7×10^-4). Корреляции представленности V. parvula в парах с P. intermedia и Т. forsythensis также оказались негативными, однако менее жесткими: R=2,9 при р=4×10^-3 и R=3,l при р=2×10^-3 соответственно. Достоверной корреляции между уровнями обсемененности пародонта пародонтопротектором V. parvula и пародонтопатогенами Т. denticola и A. actinomycetemcomitans не обнаружено.

Такие результаты могут свидетельствовать о том, что обсемененность бактерией V. parvula не связана напрямую с полом пациента, но подтверждают наличие антагонистического действия V. parvula по отношению к пародонтопатогенам или группам пародонтопатогенов, обсемененность пародонта которыми в определенной мере связана с полом: P. gingivalis, в меньшей мере - P. intermedia и Т. forsythensis.

Источник информации

1. Зорина О.А., Кулаков А.А., Грудянов А.И., Петрухина Н.Б., Борискина О.А., Авраамова Т.В., Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. Патент РФ №2420589. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Prevotella intermedia методом полимеразной цепной реакции. Заявка от 21.04.2010. Опубл. 10.06.2011.

2. Зорина О.А., Кулаков А.А., Грудянов А.И., Петрухина Н.Б., Борискина О.А., Авраамова Т.В., Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. Патент РФ №2420591. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Porphyromonas gingivalis методом полимеразной цепной реакции. Заявка от 21.04.2010. Опубл. 10.06.2011.

3. Зорина О.А., Кулаков А. А., Грудянов А.И., Петрухина Н.Б., Борискина О.А., Авраамова Т.В., Турчанинова М.А., Ребриков Д.В. Патент РФ №2420592. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Actinobacillus actinomycetemcomitans методом полимеразной цепной реакции. Заявка от 21.04.2010. Опубл. 10.06.2011.

4. Ребриков Д.В., Зорина О.А., Петрухина Н.Б., Борискина О.А., Беркутова И.С., Аймадинова Н.К. Патент РФ №2510857. Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Treponema denticola методом полимеразной цепной реакции. Заявка от 24.02.2012. Опубл. 10.04.2014.

5. Шибаева А.В., Ребриков Д.В., Трубникова Е.В., Айвазова Р.А. и соавт.Способ оценки обсемененности пародонта патогенными бактериями с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени. Заявка на патент на изобретение №2015120411 от 29.05.2015.

6. Ximénez-Fyvie L.A., Haffajee A.D., Socransky S.S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 2000. V. 27. №9. P. 648-657.

7. Зорина O.A., Шибаева A.B., Трубникова E.B., Ребриков Д.В., Шевелев А.Б. Идентификация ключевых элементов нормальной и патогенной микрофлоры, определяющей состояние пародонта, методом NSG-секвенирования банков 168-рДНК бактериальных консорциумов пародонта. Стоматология. 2014. Том 93. №6. С. 25-31.

8. Armitage G.C. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Annals of periodontology. 1999. №4. P. 1-6.