Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО АКУСТИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ ТКАНЕЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и ветеринарии, а именно, к применению акустических волн для направленного неинвазивного воздействия на функциональное состояние клеток тканей животной этиологии с возможностью выборочного изменения состояния/разрушения клеток-мишеней. Физическое воздействие проводят с целью управления процессами жизнедеятельности, пролиферативной активностью клеток/культур клеток и тканей и избирательного подавления или активации их функций. Изобретение также может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, представляет интерес для разработки методов экспериментальной медицины и ветеринарии, иммунологии, фармакологии, для индивидуальной оценки репарационной системы клетки, а также в диагностике или терапии злокачественных новообразований, при индивидуальном подборе лекарственных препаратов и герондопротекторов.

При воздействии акустических волн за счет сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможен эффект изменения поверхностного заряда и функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуются цепи одинаковых в дальнейшем эффектов как для акустических, так и для электромагнитных волн. Клетки, находящиеся в акустической волне по сравнению с длиной волны, являются точечными. Они могут испытывать сжатие и расширения объема, достигающее 20% при действии волн с амплитудой до 100 кПа, что, в свою очередь, может уменьшить количество активных каналов за счет латеральной диффузии молекул липидного бислоя, изменить проницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и функциональное состояние клетки [1].

В настоящее время нет однозначной теории формирования частотно-зависимых ответов на акустическое воздействие. Ряд исследователей показали существенные отличия на уровне ткани в биологических эффектах непрерывных и модулированных волн различной физической природы. Причем вызываемые изменения при воздействии модулированных волн выше, а степень и выраженность в большой степени зависят от частоты модуляций. Также было показано, что модулированное электромагнитное или УЗ воздействие на некоторых частотах модуляции могут вызывать изменение ферментативной активности как в сторону активирования, так и ингибирования [2-12].

Из уровня техники известен способ иммунокоррекции при аутоиммунном процессе (патент на изобретение RU 2098139, опубл. 10.12.1997). После премедикации осуществляют перфузию крови больного в вено-венозном варианте через срезы ксеноселезенки, предварительно активированные ультразвуком слабой интенсивности 0,3-0,4 Вт/см² в импульсном режиме 50 имп/с, в течение 8-10 мин. Способ применяется для упрощения процесса гемоперфузии и увеличения сорбционной способности селезенки при лечении псориаза. Данный способ эффективен при проведении перфузии с объемной скоростью 75-80 мм/мин в течение 40-45 мин 2-3 сеансами с интервалом между ними в 3-5 дней в начале курса традиционной комплексной терапии.

Однако указанный способ является затратным за счет использования дорогостоящего стационарного оборудования и материала. Способ требует при его реализации работы специально обученного персонала, сложен в исполнении методики, длителен по времени, осуществим при работе УЗ аппаратуры в импульсном режиме и на срезе одного типа ткани.

Известен способ неинвазивного разрушения расположенных за костями грудной клетки биологических тканей (патент на изобретение RU 2472545 от 20.01.2013 г., Бюл. №2), выбранный в качестве ближайшего аналога. Данный способ основан на воздействии фокусированным УЗ пучком на биологическую ткань для локального разрушения клеток только в месте нахождения основного фокуса, без повреждения в побочных фокусах.

Однако данный способ применяется в УЗ хирургии только для одновременно теплового и механического воздействий, сопровождается сильным разогревом ткани. Ограничение в применении способа акустического разрушения клеток определяется использованием высокоинтенсивного УЗ, возможностью воздействия только на один вид ткани организма человека - костную, причем на всю ткань одновременно, а не на отдельные клетки (остеобласты), генерацией локального избыточного пикового положительного давления 30-80 МПа в месте воздействия.

Заявленное изобретение осуществляется путем нахождения оптимальных условий ультразвукового воздействия на ткань, приводящего к избирательному изменению цитоморфологии или к разрушению клеток/клеточных структур животных семейства кошачьих.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа неинвазивного направленного воздействия на клетки ткани животных, безопасного при реализации и не требующего дорогостоящего стационарного оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения; осуществление способа без дополнительных технических средств и химических реагентов; минимальная затрата времени (10-45 с); полная безопасность метода для медицинского персонала и научных сотрудников при максимальном эффекте.

Целью предлагаемого изобретения является плановое воздействие на клетки разных типов и размеров.

Техническим результатом заявленного изобретения является: направленное изменение проницаемости/структуры цитоплазматической и/или ядерной мембраны; регулирование глубины эффекта акустического воздействия; торможение или активация транспортных систем клеток; выборочное разрушение в одной ткани ядер у клеток определенного, заранее заданного размера; направленная супрессия роста клеток, в том числе и ненормированного; нарушение аппарата межклеточного взаимодействия и клеточных контактов; регуляция активности внутриклеточных и мембран-связанных ферментов, что даст возможность проводить купирование заболеваний различной этиологии на клеточном уровне, а также индивидуально оценить репарационную систему клетки.

Заявленный технический результат осуществляется тем, что на клеточную суспензию объемом от 1,0 мл до 1,5 мл, содержащую (6-7)×10⁶ клеток/см³ и помещенную в кювету, воздействуют импульсно-модулированной ультразвуковой волной с несущей частотой 0,88 МГц, диапазонами интенсивностей 0,4-0,7 Вт/см² и частот модуляции 21-50 Гц в течение 15-20 с при направлении действия на цитоплазматическую мембрану безъядерных клеток размера 4-8 мкм, а также одновременно на ЦПМ и ядра ядросодержащих клеток размера 5-17 мкм, или интенсивностью 0,05 Вт/см², частотой модуляции 700-800 Гц в течение 30-45 с при выборе в качестве мишени ядер 5-17 мкм - клеток, содержащих ядро, а в течение 10-45 с - ЦПМ безъядерных клеток размера до 4 мкм.

Пробы обрабатывают в абсолютно одинаковых условиях, поддерживают постоянную температуру образцов в кюветах с проточным охлаждением, а также проводят анализ морфологического состояния клеток пробой с трипановым синим [13] и методами световой микроскопии.

По окраске клетки в синий цвет, началу деформации, изменению клеточного размера, состоянию и изменению проницаемости ЦПМ, по морфологическим изменениям: деформации или степени изменения структуры ядер, ядерному лизису или разрушению ядер, - определяют наличие и регулируют направление и глубину эффекта акустического воздействия, оценивают индивидуальную репарационную систему клетки, рост и размножение клеток-мишеней, активность внутриклеточных и мембран-связанных ферментов.

Способ эффективен и информативен при любом количестве исследуемого материала.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Воздействовали ультразвуком in vitro на жидкую подвижную ткань - кровь, в которой одновременно представлены клетки разного вида, размера и возраста. Среднее количество клеток в суспензии при обработке УЗ (6-7)×10⁶ клеток/см³. Для обеспечения постоянной концентрации образцы разбавлялись сывороткой крови того же животного. Для реализации заявляемого изобретения используются любые из отечественных ультразвуковых терапевтических генераторов с излучателями, работающих на несущей частоте 0,88 МГц: УЗТ-1-01Ф; Ультразвук Т-5 и УЗТ-1.02С и др. Экспозиция УЗ: время от 15 с до 45 с, I_SATA - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,05 Вт/см² и 0,4-0,7 Вт/см², что контролировали с помощью дифференциальной термопары, калиброванной по интенсивности. Интенсивность УЗ, прошедшего в ткань in vitro, составляла 90% номинальной интенсивности. Диапазон активных частот модуляции 21-50 Гц и 700-800 Гц, модулятор Г3-112 (или любой аналогичный генератор). Объем облучаемых образов составлял 1-1,5 мл.

Кровь брали из периферических вен: вены Сафена и подкожной вены предплечья диких (тигр, лев, пантера) и домашних кошек разных пород, веса, возраста и пола. Образцы крови облучались в абсолютно одинаковых условиях (площадь излучателя, охлаждение, циркуляция жидкости). УЗ воздействие на клетки крови, находящейся в термостатируемой кювете, осуществлялось по отработанной ранее методике [4]. Делали мазки крови и окрашивали их по методу быстрого дифференцированного окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: фиксация в абсолютном метаноле 15 с, затем в растворах красителей по 10 с, промывание в забуференной воде, сушка и просмотр под иммерсией. Контролем служили интактные клетки тех же животных. Образцы, опытные и контроль, красили трипановым синим [13] для определения изменения проницаемости ЦПМ. Результат воздействия УЗ на клетки сразу же наблюдали в световой микроскоп («ЛОМО», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18). О направлении воздействия УЗ на клетки ткани судили по количественным и качественным морфологическим изменениям.

Подсчет клеток вели по линии «Меандра»: 3-5 полей зрения вдоль края мазка, 3-5 полей зрения под прямым углом к середине мазка, потом 3-5 полей зрения параллельно краю мазка и вновь под прямым углом к краю мазка. Так продолжали до тех пор, пока не было подсчитано 100 целых клеток [14]. Считали все лейкоциты, находящиеся в 25 больших квадратах, содержащих по 16 малых квадратов (т.е. в 400 квадратах). Для расчета в 1 мл использовали формулу:

где X - количество лейкоцитов в 1 мл крови; М - количество лейкоцитов, подсчитанное в 25 квадратах; 20 - разведение крови; 400 - количество квадратов [15]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий средних значений определяли, используя парный t-критерий Стьюдента; достоверными считали различия при р<0,05. Референсный ряд клеточных размеров приведен по Н.А. Любину [16].

Действие модулированного УЗ на клетки крови животных (р<0,05).

Облучения в течение 10-45 с УЗ интенсивностью 0,05 Вт/см² (таблица) частотами модуляции 700-800 Гц деформировало клетки ткани, нарушало проницаемость ЦПМ (по данным теста с трипановым синим) безъядерных клеток размером менее 4 мкм, а воздействие теми же диапазонами, но при времени экспозиции 30-45 с на ядросодержащие клетки размера 5-17 мкм вызывало деформацию и/или изменение структуры ядер. Ядра могли разрыхляться, а также «вытекать» из всех клеток. На фотографии (Фиг. 1) показаны результаты действия в течение 45 с интенсивности 0,05 Вт/см² частоты модуляции 800 Гц: ядро сегментоядерного нейтрофила деформировано и разрыхлено; на Фиг. 2 - экспозиция 35 с. Деформация ядра лимфоцита и разрыв ядра гранулоцита.

Безъядерные клетки размера 4-8 мкм и ядросодержащие клетки размера 5-17 мкм. Кратковременное 15-20 с действие модулированным УЗ (р<0,05) направленно изменяло проницаемость ЦПМ. Также шло изменение формы клеток, формирование симметричных групп вокруг клетки и цепочек эритроцитов без признаков разрушения или цитолиза. Возможно, это связано с изменением поверхностной плотности заряда или перераспределением заряда ЦПМ. Основные спектры активных частот в диапазоне интенсивностей 0,4-0,7 Вт/см² для воздействия на ЦПМ, составляют: 21-50 Гц при времени облучения 15-20 с. На фотографии (фиг. 3) показаны изменения эритроцитов кошки (агрегированные, каплевидные или вытянутые - 3.1), образование булавовидных утолщений ЦПМ и разные стадии изменения ядер лейкоцитов.

Облучение УЗ 0,7 Вт/см² в течение 15-20 с частотным диапазоном модуляции 21-50 Гц деформировало безъядерные клетки размера 4-8 мкм, изменяло проницаемость ЦПМ ядросодержащих клеток размером 5-17 мкм, вызывало лизис ядер. Направленное воздействие вызывало вначале изменение формы эритроцитов, без внешних признаков разрушения или цитолиза, затем регистрировали формирование групп вокруг клеток и цитоцепочек. Возможно, было появление теней клеток. В зависимости от экспозиции во всех клетках ткани кошачьих происходили одинаковые эффекты: цитолиз, деструкция и агрегация клеток, вспенивание цитоплазмы гранулоцитов, разрыв ЦПМ, деформация и взрыв ядер. Изменение мембран и ядер лейкоцитов в зависимости от вида и размера клетки регистрировалось, при озвучивании активными частотами, как клеток крови больных, так и здоровых кошачьих.

На фотографиях (фиг. 4-6) показаны направления акустического воздействия на клетки ткани. После облучения УЗ с интенсивностью 0,4 Вт/см² частотой модуляции 30 Гц в течение 20 с (фиг. 4) видно изменение клетки. По-видимому, это гранулоцит, т.к. просматривается зернистость: базофил, или сегментоядерный нейтрофил, или эозинофил, с деформированным ядром. В результате влияния интенсивностью 0,7 Вт/см², частотой модуляции 21 Гц в течение 18 с менялась структура ЦПМ, а затем шло разрушение ядер лейкоцитов. На фиг. 5 - разрыв цитоплазмы и деформация ядра, вероятно, сегментоядерного лейкоцита. На фиг. 6 видны изменения ядра, вспенивание цитоплазмы лейкоцита после УЗ экспозиции 0,7 Вт/см², модуляции 22 Гц, в течение 20 с. Так как структура неоднородна, можно предположить, что это палочкоядерный нейтрофил. Во многих случаях цитологические изменения столь значительны, что клетки идентифицировать было сложно (фиг. 4-6).

Выводы.

1. Предложена схема ультразвукового воздействия на суспензии клеток-мишеней тканей представителей семейства кошачьих в фиксированном, термостатируемом объеме и определена оптимальная 10⁶ клеток/мл.

2. Показана общая закономерность влияния акустической волны выбранного диапазона действия на клетки крови всех представителей Семейства, не зависимо от вида животного.

3. Определены диапазоны частот управления и интенсивность, действующие направленно на цитоплазматические мембраны безъядерные клеток размера до 4 мкм: 0,05 Вт/см² вблизи частот 700-800 Гц, и времени ультразвукового воздействия от 10 с до 45 с.

4. Интенсивностью 0,05 Вт/см², частота модуляции 700-800 Гц в течение 30-45 с направленно действует на клеточные ядра клеток тканей представителей Семейства кошачьих. Происходит разрушение ядер ядросодержащих клеток размера 5-17 мкм и изменение объема их цитоплазмы.

5. Интенсивностью 0,05 Вт/см², частота модуляции 700-800 Гц в течение 10-45 с способна изменить проницаемость ЦПМ безъядерных клеток размером до 4 мкм.

6. Применение УЗ в диапазонах интенсивности 0,4-0,7 Вт/см², частот модуляции 21-50 Гц, в течение 15-20 с приводило к цепи взаимосвязанных эффектов: изменению проницаемости ЦПМ, вспениванию цитоплазмы, разрушению ЦПМ и/или ядер всех клеток размера 4-17 мкм.

7. Облучение интенсивностью 0,4-0,7 Вт/см² частотами модуляции 21-50 Гц в течение 15-20 с оказывало эффект на цитоплазматическую мембрану и ядросодержащих клеток размера 5-17 мкм и безъядерных 4-8 мкм - клеток.

Список литературы

1. Олешкевич А.А., Каминская Е.В., Носовский A.M. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (УЗ) волнами. Ч. 2. Методика акустической стимуляции клеток животного происхождения // Биомед. радиоэлектр. 2014 - №. 3. С. 33-39.

2. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Возможность изменения лейкограмм животных при действии непрерывного ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей // Аграрная Россия.-№6 (2015). С 13-17.

3. Oleshkevich, АА. Studies of frequency-dependent changes under modulated ultrasound exposure on cells in suspension // International Journal of BioMedicine. N.-Y.: "Int. Medical Research and Development Corporation". V. 4, Issue 1, March 2015. P. 30-34.

4. Олешкевич A.A., Пашовкин Т.Н. Количественный анализ действия модулированного ультразвука на некоторые клетки тканей животных // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2014 - №5. С. 27-33.

5. Олешкевич А.А., Носовский A.M., Каминская Е.В. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (ультразвуковыми) волнами. Ч. 3. Сравнительный анализ методов оценки функционального состояния клеток после ультразвукового воздействия // Биомедицинская радиоэлектроника, 2014 - №.8. - С. 45-49.

6. Олешкевич А.А., Кутликова И.В. Влияние ультразвука на лимфоциты и сегментоядерные нейтрофилы // Научное обозрение. - 2015. - №13. - С. 145-150.

7. Олешкевич А.А. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на клетки крови животных in vitro /V Съезд биофизиков России. Материалы докладов: в 2 т. - Ростов-на-Дону: ЮФУ. - Т. 2: 2015. - С. 107.

8. Утешев В.К., Пашовкин Т.Н., Гахова Э.Н. Выживаемость зародышей амфибий после воздействия модулированного ультразвука терапевтического диапазона //Вестник новых медицинских технологий, 2010, №4, С. 7-10.

9. Максутова Д.Ж Применение фокусированного ультразвука под контролем магнитно-резонансной томографии // Проблемы репродукции / Russian Journal of Human Reproduction. 2009. №2. С. 30-36.

10. Panagopoulos D.J., Karabarbounis A., Margaritisa L.H. Mechanism for action of electromagnetic fields on cells //Biochemical and Biophysical Research Communications 298. 2002. P. 95-102.

11. Пашовкина M.C., Акоев И.Г., Пашовкин Т.Н. Изменение активности некоторых ферментов животных и человека при воздействии модулированных микроволн и феномены выявления нелинейных эффектов.// Биологические эффекты слабых электромагнитных излучений. Пущино. 2002. С. 26-37.

12. Пашовкина М.С., Акоев И.Г. Изменение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови морских свинок iv vivo при действии амплитудно-модулированного сверхвысокочастотного электромагнитного поля (2375 МГц) // Биофизика. 2000. - Т. 45, Вып. 1. С. 130-136.

13. Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели: - Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011. - 61 с.

14. Бурмистров Е.Н. Шанс Био: Лабораторная диагностика. М., 2006. - 154 с.

15. Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. - М.: Агропромиздат, 1985. - с. 59-64.

16. Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. Ульяновск, ГСХА, 2005, с. 113.