Результат интеллектуальной деятельности: Способ электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении белков сыворотки крови и молока на фракции в полиакриламидном геле.

Электрофорез широко применяют в исследовательской и клинико-лабораторной практике. Посредством его выявляют и выделяют белки, липопротеиды, гликопротеиды, нуклеиновые кислоты. Подавляющее большинство исследований с помощью электрофореза позволяет диагностировать состояние белкового обмена биологического организма.

В медико-биологических исследованиях применяют множество вариантов двух главных модификаций электрофореза в свободной жидкости (свободно-проточный электрофорез) и зонального электрофореза (зонный электрофорез, или электрофорез на инертных носителях).

Для разделения белков плазмы крови широкое распространение получил зонный электрофорез на поддерживающих средах-носителях. Зонный электрофорез можно осуществлять с использованием смоченных буферным раствором (рН-8,6) полосок хроматографической бумаги, ацетататцеллюлозной пленки, агарового геля и других носителей.

Известен способ разделения белков на фракции, используя электрофорез в полиакриламидном геле. Этот метод нашел самое широкое применение в биохимических и научных исследованиях. Он используется для изучения белков, липо- и гликопротеинов, пептидов, гормонов, ферментов и нуклеиновых кислот.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле значительно повышается при использовании в качестве носителя системы гелей (обычно двух - «рабочего», мелкопористого и непосредственно над ним «формирующего», крупнопористого). Кроме степени пористости эти гели резко различаются по величине рН и молярности буферных растворов, в которых они полимеризуются. Такой электрофорез называют ступенчатым или дискэлектрофорезом.

Известна методика проведения электрофореза в полиакриламидном геле с использованием крупнопористого концентрирующего геля (рН=6,7) и мелкопористого разделяющего геля (рН=8,9). Разведение сыворотки крови и молока проводят с использованием раствора сахарозы. Проводят электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови в крупнопористом концентрирующем геле в течение 30 мин при силе тока 25 мА. При использовании этого геля в качестве концентрирующего происходит диффузия белков сыворотки крови и молока, что приводит к частичной потере белков и, следовательно, снижению точности электрофоретического разделения (Малахова А.Г., Кармолиев Р.Х. Применение современных биохимических методов исследования в ветеринарии. М., 1986) [1].

Недостатками данной методики электрофореза являются недостаточно высокая точность проведения электрофореза за счет наличия процесса диффузии в крупнопористом концентрирующем геле и длительность осуществления методики.

Задачей изобретения является повышение точности проведения электрофореза и сокращение времени проведения анализа.

Для достижения поставленной задачи в способе электрофоретического разделения белков сыворотки крови и молока в полиакриламидном геле, заключающемся в проведении электрофореза в полиакриламидном геле с использованием концентрирующего геля с рН=6,7 и разделяющего геля с рН=8,9 при силе тока 25 мА, с предварительным разведением сыворотки крови и молока, согласно изобретению в качестве концентрирующего геля используют мелкопористый гель, при этом сыворотку крови и молока разводят в физиологическом растворе 1:2.

Мелкопористый гель выполняет также функции концентрирующего благодаря тому, что в предлагаемой методике сохраняется прерывистость системы буферов, что обеспечивает концентрирование белков пробы и образование тонкой стартовой зоны на границе концентрирующего и разделяющего гелей из-за возникающего электрохимического эффекта.

Использование в качестве концентрирующего геля мелкопористого (7,5%-ного) геля с рН=6,7 приводит к снижению процесса диффузии разделяемых белков, что позволяет избежать потери белков и повысить точность анализа. Кроме того, полимеризация в мелкопористом геле проходит быстрее. Электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови в мелкопористом концентрирующем геле осуществляется в течение 10 мин при силе тока 25 мА. Это позволяет сократить время проведения анализа.

Использование физиологического раствора для разведения проб сыворотки крови и молока является наиболее физиологичным для этих биологических жидкостей. Кроме того, хлорид-ионы из физиологического раствора, дополнительно введенные к хлорид-ионам концентрирующего буфера, устремляющиеся под действием электрического поля в сторону анода и оставляющие за собой бедное ионами пространство, приводят к резкому падению напряжения. Это вызывает ускорение медленных ионов глицината и следующих за ними белковых молекул.

Пример выполнения.

1. В блок для полиакриламидных гелей заливают разделяющий (7,5%-ный) мелкопористый гель с рН=8,9. Осторожно наслаивают на поверхность гелевого раствора дистиллированную воду или раствор триса. Через 30-60 минут полимеризация заканчивается, что отмечается появлением границы раздела между поверхностью геля и водой.

2. Сливают воду, поверхность разделяющего геля 2-3 раза промывают раствором акриламида, не содержащим рибофлавин, и заливают затем в кассету 7,5%-ный раствор акриламида с рH=6,7 почти до верхнего края, вставляют сверху гребенку из оргстекла для формирования лунок. Полимеризация длится 15 минут. Затем вынимают гребенку и вносят в лунки по 0,01 мл проб сыворотки крови (молока), разведенной физраствором в соотношении 1:2. В крайние лунки вносят по одной капле раствора 12 (бромфенолового синего), который является индикатором передвижения белка в геле.

3. Помещают кассету в нижний электродный сосуд с платиновым электродом и сверху, по месту щели, прижимают верхним электродным сосудом с платиновым электродом. В нижний электродный сосуд заливают 1000 мл буферного раствора 10, с рН 8,3, в верхний электродный сосуд осторожно, чтобы не вымыть пробы из лунок, заливают 500 мл того же буферного раствора. Камеру деления подключают к источнику питания.

4. Проводят электрофоретическое концентрирование белков сыворотки крови (молока) в течение 10 мин при силе тока 25 мА. После прохождения фронта индикатора границы раздела двух гелей силу тока увеличивают до 50 мА. Электрофорез заканчивается по достижении первой зоны красителя нижнего края кассеты. По окончании электрофореза отсасывают буферный раствор из верхнего электродного сосуда и отделяют его от кассеты. Осторожно отслаивают пластину геля от стенок кассеты и гель отмывают в 7%-ном растворе уксусной кислоты.

5. Отмытый гель фотографируют. На фиг. 1 представлена электрофореграмма белков сыворотки крови. На фиг. 2 представлена электрофореграмма белков молока. Полученные электрофореграммы свидетельствуют о высокой разделяющей способности заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ позволят повысить точность проведения электрофореза, сократить длительность процесса проведения анализа.