Результат интеллектуальной деятельности: Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta - продуцент этилового спирта

Изобретение относится к биотехнологии и касается штамма базидиального гриба (базидиомицета) Trametes hirsuta, продуцирующего этиловый спирт из углеводов, целлюлозного и лигноцеллюлозного субстрата. Этиловый спирт, полученный микробиологическим путем, может быть использован в качестве компонента топлива для двигателей внутреннего сгорания, в медицине и пищевой промышленности.

Известен штамм базидиомицета Phlebia sp. MKFC40001, способный продуцировать этиловый спирт из древесных опилок с выходом, достигающим 43,9% от теоретически возможного, за 20 суток инкубирования в полуанаэробных условиях. Однако использование указанного штамма предопределяет необходимость предобработки лигноцеллюлозного субстрата в аэробных условиях в течение 8 недель (US 9145568, 2015).

Также известен штамм Phanerochaete chrysosporium, продуцирующий этиловый спирт из лигноцеллюлозных субстратов (дробленое зерно, кукурузная солома) путем их твердофазного сбраживания в полуанаэробных условиях (US 8309328, 2012). При этом указанный штамм проявляет способность продуцировать наряду с этиловым спиртом такие соединения, как ацетон и изопропанол, что приводит к получению целевого продукта недостаточно высокого качества и необходимости проведения его дополнительной очистки.

Наиболее близким к изобретению является штамм Trametes suaveolens, способный продуцировать до 7,7 г/л этилового спирта из глюкозы за 18 суток инкубирования в полуанаэробных условиях. (Okamoto К. et al. Production of ethanol by the white-rot basidiomycetes Peniophora cinerea and Trametes suaveolens //Biotechnology letters, 2010, Vol.32, №7, p. 909-913). Таким образом, при использовании данного штамма необходимо достаточно длительное время культивирования. Кроме того, указанный штамм способен продуцировать спирт только из углеводного сырья, таким образом спектр используемого сырья ограничен.

Задача изобретения заключается в получении нового эффективного штамма - продуцента этилового спирта из глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья.

Поставленная задача достигается созданием штамма базидиомицета Trametes hirsuta ВКПМ F-1288 - продуцента этилового спирта из глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья.

Технический результат заключается в создании штамма, способного продуцировать этиловый спирт из глюкозы, целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья (субстратов). При этом снижается время культивирования. Кроме того, описываемый штамм позволяет получать спирт высокого качества, не содержащего такие примеси, как ацетон и изопропанол.

Новый штамм Trametes hirsuta выделен из природного плодового тела, найденного на мертвой древесине Betula pendula. Кусочки гриба, вырезанные из середины плодового тела, в асептических условиях были перенесены на селективную плотную питательную среду (сусловый агар), содержащую 30 мг/л ампициллина и 4 мг/л беномила. Выросший мицелий был идентифицирован как чистая базидиальная культура по наличию пряжек на мицелии. Таксономическая принадлежность описываемого штамма к виду Trametes hirsuta подтверждена молекулярно-генетическим методом. Штамм базидиального гриба Trametes hirsuta депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ F-1288.

Характеристики штамма Trametes hirsuta.

Выделенный штамм относится к классу Basidiomicetes, подклассу Agaricomycetidae, порядку Polyporales, семейству Polyporaceae, роду Trametes, виду hirsuta. Вид Т. hirsuta не патогенен для человека и не образует токсичные метаболиты ни на одной из стадий морфогенеза.

Условия культивирования: сусловый агар, температура 26-28°С, время культивирования составляет 5-7 суток.

Условия хранения: в пробирках с сусловым агаром при 4-6°С в течение 12-18 месяцев без пересева.

Макроморфологические признаки:

На сусловом агаре колония округлая с ризоидным краем, слабовыраженная концентрически зональная, пушится вокруг инокулюма, профиль приподнятый. Воздушный мицелий белого цвета, субстратный мицелий бесцветный, обратная сторона колонии не окрашена. Структура колонии ватно-пушистая, слабошероховатая, плотная. По мере старения мицелий становится кожистым, плотным.

Микроскопические признаки:

Гифы воздушного мицелия до 3 мкм в диаметре, разветвленные, короткие. На мицелии имеются большие сильновыпуклые пряжки стабильной формы.

Способностью продуцировать этиловый спирт обладает мицелий Trametes hirsuta (далее Т. hirsuta), выращенный в условиях погруженного культивирования.

Вегетативный мицелий базидиомицета выращивают в погруженной культуре в асептических аэробных условиях. Культивирование осуществляют в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальной качалке при температуре 28°С. Среда для погруженного культивирования содержит глюкозу 10-30 г/л, соевую муку 5-15 г/л, дигидрофосфат калия 2-3 г/л, сульфат магния 0,2-0,3 г/л и водопроводную воду. Значение рН среды доводят до 5,5-6,2. Питательную среду автоклавируют при температуре 121°С в течение 30 минут. Длительность процесса получения жидкого посевного мицелия составляет 4 суток, ферментации - 4 суток.

Штамм Т. hirsuta способен сбраживать углеводы (например, глюкозу) и целлюлозные и лигноцеллюлозные субстраты (например, карбоксиметилцеллюлозы натриевую соль, микрокристаллическую целлюлозу, солому) в анаэробных условиях.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие изобретение, но не ограничивающие его.

Пример 1. Получение погруженного мицелия Т. hirsuta.

Погруженное культивирование штамма Т. hirsuta проводят на орбитальном шейкере со скоростью вращения 250 об/мин при температуре 28°С в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава: глюкоза 20 г/л, соевая мука 10 г/л, дигидрофосфат калия 2,5 г/л и сульфат магния 0,25 г/л. Уровень рН среды доводят до 5,5-6,2. Процесс погруженного культивирования проводят в два этапа. На первом этапе получают жидкий посевной материал, на втором этапе осуществляют ферментацию.

Для приготовления посевного материала используют культуру, выращенную в пробирках на сусловом агаре. Кусочки агара размером не более 3×3 мм в количестве 30-40 штук асептически вносят в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивируют в течение 4 суток. Затем 10 мл посевного материала в асептических условиях вносят в качалочные колбы, содержащие 100 мл питательной среды, и культивируют в течение 4 суток. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 5,8 г/л питательной среды на 4 сутки ферментации.

Пример 2. Получение погруженного мицелия Т. hirsuta.

Получение погруженного мицелия Т. hirsuta проводят по примеру 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносят в количестве 10 г/л, 5 г/л, 3 г/л и 0,3 г/л, соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 4,2 г/л питательной среды на 4 сутки ферментации.

Пример 3. Получение погруженного мицелия Т. hirsuta.

Получение погруженного мицелия Т. hirsuta проводят по примеру 1, но глюкозу, соевую муку, дигидрофосфат калия и сульфат магния в питательную среду вносят в количестве 30 г/л, 15 г/л, 2 г/л и 0,2 г/л, соответственно. Выход воздушно высушенной биомассы составляет 4,1 г/л питательной среды на 4 сутки ферментации.

Пример 4. Получение этилового спирта из глюкозы.

Получают погруженную культуру Т. hirsuta по примеру 1. Определяют остаточную концентрацию глюкозы в культуральной жидкости DNS-методом. В качалочные колбы с погруженной культурой асептически вносят стерильный раствор глюкозы в концентрации 20 г/л. Колбы закрывают стерильными гидрозатворами и термостатируют при 25°С в темном месте. Отбор проб для определения концентрации этилового спирта и глюкозы в культуральной жидкости производят каждые 24 часа. Определение концентрации этилового спирта проводят методом газовой хроматографии. Полученные данные по исследованию динамики накопления целевого продукта и убыли исходного субстрата с использованием описываемого штамма Trametes hirsuta сведены в таблицу.

Как следует из представленных данных, максимальная концентрация этилового спирта в культуральной жидкости составляет 9,5 г/л на 7 сутки сбраживания. Таким образом, культивирование этилового спирта с использование описываемого штамма в сравнении с использованием известного штамма позволяет повысить выход спирта и снизить время проведения культивирования.

Пример 5. Получение этилового спирта из целлюлозного и лигноцеллюлозного сырья (субстратов).

В качестве субстратов используют: карбоксиметилцеллюлозы натриевую соль в количестве 20 г/л, микрокристаллическую целлюлозу марки «Авицел» в количестве 20 г/л, измельченную солому с размером частиц 2-4 мм в количестве 30 г/л. Субстраты помещают в качалочные колбы объемом 750 мл в указанных концентрациях, добавляют по 10 мл водопроводной воды. Колбы автоклавируют при температуре 121°С в течение 30 минут.

Получают погруженную культуру Т. hirsuta по примеру 1. В стерильные колбы с субстратами помещают по 90 мл погруженной культуры, закрывают стерильными гидрозатворами, в качестве дополнительного стерилизующего вещества в гидрозатворах используют бледно-розовый раствор перманганата калия. Колбы термостатируют при 25°С в течение 11 суток.

Определение концентрации этилового спирта проводят методом газовой хроматографии. Концентрация этилового спирта в культуральной жидкости через 7 суток сбраживания карбоксиметилцеллюлозы натриевой соли составляет 3 г/л, микрокристаллической целлюлозы 2,6 г/л, измельченной соломы 2,6 г/л.

Получаемый спирт не содержит таких примесей, как ацетон и изопропанол.

Таким образом, описываемый штамм позволяет продуцировать этиловый спирт повышенного качества из более широкого спектра используемого сырья по более простой технологии.