×
25.08.2017
217.015.b476

Способ определения генотоксичности химических веществ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к способу определения генотоксичности химических веществ. Способ предусматривает добавление рибофлавина до конечной концентрации 1⋅10 мг/мл - 1⋅10 мг/мл в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri или Photorabdus luminescens поставлен под контроль промотора pColD. Осуществляют добавление тестируемого вещества и определение интенсивности люминесценции полученной суспензии и контроля. О повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля. Изобретение обеспечивает увеличение фактора индукции. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к определению генотоксичности химических веществ, то есть к определению повреждения генетической информации химическими веществами, в результате которого микрофлора в организме пациента может в результате действия подпороговых концентраций генотоксических препаратов приобрести ряд мутаций, повышающих ее патогенность либо увеличивающих резистентность. Изобретение может быть использовано для оценки побочных эффектов лекарственных препаратов и других химических веществ.

Известны способы определения генотоксичности химических веществ на основе биосенсоров (культур клеток бактерий, в которых присутствуют гены, обеспечивающие свечение бактериальной клетки), свечение которых усиливается или подавляется под действием определенных химических веществ (патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, C12Q 1/66, 2002 г.; патент RU №2297450, МПК C12N 1/21, 2007 г.; патент RU №2355760, МПК C12N 1/21, 2009 г.; патент RU №2179581, МПК C12Q 1/02, 2002 г.).

Наиболее близким по выполнению является способ определения генотоксичности химических веществ, включающий инкубацию тестируемого химического вещества с рекомбинантным штаммом Е. coli, несущим плазмиду, в которой lux оперон находится под контролем SOS-lux-промотора, измерение интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих тестируемое химическое вещество и определение генотоксичности по фактору индукции I=Lc/Lk, где I - фактор индукции; Lc - интенсивность свечения суспензии SOS-lux штамма, содержащего тестируемое химическое вещество; Lк - интенсивность свечения контрольной суспензии SOS-lux штамма (Анализ SOS-ответа клеток E. coli с помощью бактериальной люминесценции. Всесоюз. конф. "Генетические исследования действия биологических, химических и физических факторов окружающей среды", по проблеме "Человек и Биосфера ", Киев, 1988, с. 95).

Недостатком данного способа является недостаточно высокий фактор индукции (усиление биолюминесценции анализируемой пробы по сравнению с биолюминесценцией контрольной пробы).

Техническим результатом изобретения является увеличение фактора индукции.

Технический результат достигается тем, что способ определения генотоксичности химических веществ, характеризуется тем, что в культуру Escherichia coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens поставлен под контроль промотора pColD, добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10-7 мг/мл - 1⋅10-5 мг/мл, добавляют тестируемое вещество в концентрации, не подавляющей жизнедеятельность Escherichia coli (определяемую экспериментально) и определяют интенсивность люминесценции полученной суспензии и контроля, а о повреждающем действии тестируемого вещества судят по отклонению интенсивности люминесценции суспензии от контроля (повреждающее действие отсутствует, если нет отклонения от контроля).

Культуру предварительно выращивают предпочтительно на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани.

Культуру после выращивания доводят предпочтительно до плотности 0,01-0,1 единица Мак-Фарланда и концентрации 3⋅107-3⋅106 клеток/мл.

Контроль содержит в качестве вещества сравнения (контрольного вещества) предпочтительно деионизированную воду в эквивалентном объеме.

Отличием предлагаемого способа является добавление в культуру клеток Е. coli, несущей плазмиду pColD-lux, в которой lux оперон поставлен под контроль промотора pColD, рибофлавина в концентрации 1⋅10-7 мг/мл - 1⋅10-5 мг/мл.

Рибофлавин известен в качестве кофактора фермента люциферазы, моноонсигеназы КФ 144413 (J.W. Hastings. 1983. "Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems." Journal of Molecular Evolution, v. 19: p.309-321). Однако не известен характер влияния рибофлавина (усиление или ослабление люминесценции) и не известны пределы концентраций, способствующие увеличению фактора индукции в отношении бактерий Escherichia coli К12 MG1655, содержащей плазмиду pColD-lux, с опероном Photobacterium leiognathi, Vibriofischeri или Photorabdusluminescens.

Ниже приведены примеры осуществления способа.

Пример 1. Определение генотоксичности диоксидина по способу прототипа.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин в концентрации 2,25⋅10-5 М (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру Е. coli выращивают на среде LBP (пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 10 г на 1 л раствора; pH 7.0) в присутствии 50 мкг/мл ампициллина. В 50 мл среды вносят 0,1 мл ночной культуры Е. coli С 600 и инкубируют в термостате в течение одного часа при t=37°C. Затем добавляют среду LBP до достижения оптической плотности культуры 0,1 (550 нм). Аликвоты этой культуры по 1 мл переносят в стерильные пробирки и добавляют в них по 10 мкл тестируемого химического вещества. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки помещают на 1 час в термостат при t=37°C. В процессе инкубации пробирки несколько раз встряхивают.

По окончании инкубации культуры охлаждают до комнатной температуры. На люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия) измеряют интенсивности биолюминесценции контрольных культур и содержащих анализируемое химическое вещество. Получают следующие данные. Интенсивность люминесценции для диоксидина составляет 118158,6 у.е., для контроля 311,6 у.е.. То есть, фактор индукции равен 379,2.

Пример 2.

В качестве тестируемого вещества взято генотоксическое вещество диоксидин (Фонштейн Л.М., Ревазова Ю.А., Золотарева Г.Н. и др. Изучение мутагенной активности диоксидина // Генетика. 1985. Т. 21. №5. С. 11-19).

Культуру клеток Е. coli К12 MG1655 с плазмидой pColD-lux, в которой lux оперон (оперон биолюминесценции морских фотобактерий Photobacterium leiognathi) поставлен под контроль промотора pColD, растят на жидкой питательной полноценной среде Луриа-Бертани (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М., Мир, 1984, 480 с.) при постоянной аэрации на круговой качалке при 37°C. В среду добавляют антибиотик ампициллин (100 мкг/мл). Ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,01 - единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅107 клеток/мл), и добавляют рибофлавин до конечной концентрации 1⋅10-6 мг/мл. Аликвоты этой культуры (по 90 мкл) переносят в ячейки (стрипы) планшета и добавляют в них по 10 мкл диоксидина концентрацией 2,25⋅10-5 М (указанная концентрация меньше, чем терапевтическая [Приказ Минздрава СССР от 29.06.1976 № 647 О разрешении к медицинскому применению новых лекарственных средств]). В контрольные ячейки добавляют 10 мкл деионизированной воды.

После обработки планшет с пробами помещают в люминометр, инкубируют при 30°C и измеряют интенсивность биолюминесценции (Люминесценцию измеряли на люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия). Интенсивность люминесценции для пробы с диоксидином составляет 191895,3 у.е., а для контроля 328,0 у.е.. То есть, фактор индукции как их соотношение равен 585,0. Интенсивность люминесценции пробы с диоксидином без добавления рибофлавина (положительный контроль) составляет 135284,1 у.е. То есть, фактор индукции равен 412,5.

Аналогично ночную культуру разбавляют свежей средой до плотности 0,1 единица Мак-Фарланда (концентрация 3⋅106 клеток/мл).

Аналогично в качестве lux оперона используют оперон биолюминесценции морских фотобактерий Vibriofischeri и Photorabdusluminescens.

Результаты по показателям интенсивности свечения аналогичны. На рис. 1 приведены значения фактора индукции анализируемого вещества - диоксидина - в концентрации 2,25⋅10-5 М при различных концентрациях рибофлавина и без добавления рибофлавина к культуре. Как видно из рис. 1, при заявляемых концентрациях (1⋅10-7-1⋅10-5 мг/мл) фактор индукции превышает таковой без добавления рибофлавина. То есть, добавление рибофлавина в концентрациях 1⋅10-7-1⋅10-5 мг/мл позволяет увеличить интенсивность свечения тестируемой пробы.

Таким образом, способ позволяет увеличить фактор индукции по сравнению со способом прототипа (для которого фактор индукции в соответствии с примером 1 составляет 379,2) и может быть использован для определения генотоксичности химических веществ (в частности, диоксидина).


Способ определения генотоксичности химических веществ
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-10 из 47.
20.02.2013
№216.012.2725

Способ получения деиноксантина - каротиноида микроорганизма deinococcus radiodurans

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения каротиноидов, в частности деиноксантина, который применяется для разработки новых антиоксидантных и радиопротекторных препаратов для повышения адаптационных возможностей человека и животных, профилактики и лечения...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002475541
Дата охранного документа: 20.02.2013
20.07.2015
№216.013.6333

Антиобледенительная пластичная смазка

Изобретение относится к антиобледенительным пластичным смазочным материалам и может найти применение для предотвращения обледенения тормозной системы подвижного состава железнодорожного транспорта. Антиобледенительная пластичная смазка содержит комплексное кальциевое мыло стеариновой и уксусной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002556942
Дата охранного документа: 20.07.2015
20.08.2015
№216.013.7164

Питательная среда для выращивания микроорганизмов deinococcus radiodurans

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans. Питательная среда содержит соевое молоко, глюкозу, MgSO×7HO, MnCl, FeSO×7HO и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет упростить способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002560598
Дата охранного документа: 20.08.2015
10.09.2015
№216.013.7893

[n,n'-бис(2-тозиламинобензилиден)диаминодипропилиминат]металла, обладающий люминесцентной активностью

Изобретение относится к новым соединениям в ряду металлохелатов тетрадентатных азометиновых лигандов 2-тозиламинобензальдегида и алифатических диаминов, а именно [N,N′-бис(2-тозиламинобензилиден)диаминодипропилиминатам]цинка и кадмия формулы I где M=Zn, Cd. Изобретение позволяет получить новые...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002562456
Дата охранного документа: 10.09.2015
20.11.2015
№216.013.90a0

{2-[5-(3,4,5-триметоксифенил)-1,3,4-оксадиазол-2-ил]фенил} ацетат с люминесцентными свойствами

Изобретение относится к 2-[5-(3,4,5-триметоксифенил)-1,3,4-оксадиазол-2-ил]фенилацетату формулы I: Технический результат: соединение изобретения обладает высокой люминесцентной активностью в фиолетовой области видимого спектра. 1 табл., 1 пр.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002568640
Дата охранного документа: 20.11.2015
20.11.2015
№216.013.9169

Противосудорожное средство

Изобретение относится к лекарственным средствам, а именно к противосудорожным препаратам, используемым при лечении эпилепсии. В качестве соединения, обладающего противосудорожной активностью, предложен дигидрохлорид 9-диалкиламиноэтил-2-(4-хлорфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002568841
Дата охранного документа: 20.11.2015
20.12.2015
№216.013.9ba0

Бессвинцовый пьезоэлектрический керамический материал

Изобретение относится к пьезоэлектрическим керамическим материалам на основе ниобатов натрия, калия, лития и может быть использовано в ультразвуковых преобразователях, работающих в широком диапазоне температур в режиме приема, в частности в датчиках детонации двигателей внутреннего сгорания....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571465
Дата охранного документа: 20.12.2015
20.01.2016
№216.013.a06d

Противосудорожное средство

Изобретение относится к лекарственным средствам, а именно к используемым при эпилепсии. Техническим результатом изобретения является повышение противосудорожной активности. Технический результат достигается применением дигидрохлорида 9-диалкил...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002572711
Дата охранного документа: 20.01.2016
10.04.2016
№216.015.2eee

Бессвинцовый пьезоэлектрический керамический материал

Изобретение относится к пьезоэлектрическим керамическим материалам. Технический результат изобретения заключается в повышении температурной стабильности относительной диэлектрической проницаемости ε /ε и коэффициента электромеханической связи планарной моды колебаний. Пьезоэлектрический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002580538
Дата охранного документа: 10.04.2016
27.04.2016
№216.015.39f5

Гидрогалогениды 11-феноксиэтил- и 11-бензилзамещённых 2,3,4,5-тетрагидро[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола, обладающие антиагрегантной активностью

Изобретение относится к гидрогалогенидам 11-феноксиэтил- и 11-бензилзамещенных 2,3,4,5-тетрагидро[1,3]диазепино[1,2-]бензимидазола формулы I: где R=CHOCH(4-Cl); CHOCH(4-OCH); CH(4-F); X=Cl, Br. Технический результат: получены новые производные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002582618
Дата охранного документа: 27.04.2016
Показаны записи 1-10 из 34.
20.07.2015
№216.013.6333

Антиобледенительная пластичная смазка

Изобретение относится к антиобледенительным пластичным смазочным материалам и может найти применение для предотвращения обледенения тормозной системы подвижного состава железнодорожного транспорта. Антиобледенительная пластичная смазка содержит комплексное кальциевое мыло стеариновой и уксусной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002556942
Дата охранного документа: 20.07.2015
20.08.2015
№216.013.7164

Питательная среда для выращивания микроорганизмов deinococcus radiodurans

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания Deinococcus radiodurans. Питательная среда содержит соевое молоко, глюкозу, MgSO×7HO, MnCl, FeSO×7HO и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет упростить способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002560598
Дата охранного документа: 20.08.2015
10.09.2015
№216.013.7893

[n,n'-бис(2-тозиламинобензилиден)диаминодипропилиминат]металла, обладающий люминесцентной активностью

Изобретение относится к новым соединениям в ряду металлохелатов тетрадентатных азометиновых лигандов 2-тозиламинобензальдегида и алифатических диаминов, а именно [N,N′-бис(2-тозиламинобензилиден)диаминодипропилиминатам]цинка и кадмия формулы I где M=Zn, Cd. Изобретение позволяет получить новые...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002562456
Дата охранного документа: 10.09.2015
20.11.2015
№216.013.90a0

{2-[5-(3,4,5-триметоксифенил)-1,3,4-оксадиазол-2-ил]фенил} ацетат с люминесцентными свойствами

Изобретение относится к 2-[5-(3,4,5-триметоксифенил)-1,3,4-оксадиазол-2-ил]фенилацетату формулы I: Технический результат: соединение изобретения обладает высокой люминесцентной активностью в фиолетовой области видимого спектра. 1 табл., 1 пр.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002568640
Дата охранного документа: 20.11.2015
20.11.2015
№216.013.9169

Противосудорожное средство

Изобретение относится к лекарственным средствам, а именно к противосудорожным препаратам, используемым при лечении эпилепсии. В качестве соединения, обладающего противосудорожной активностью, предложен дигидрохлорид 9-диалкиламиноэтил-2-(4-хлорфенил)имидазо[1,2-а]бензимидазола общей формулы I....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002568841
Дата охранного документа: 20.11.2015
20.12.2015
№216.013.9ba0

Бессвинцовый пьезоэлектрический керамический материал

Изобретение относится к пьезоэлектрическим керамическим материалам на основе ниобатов натрия, калия, лития и может быть использовано в ультразвуковых преобразователях, работающих в широком диапазоне температур в режиме приема, в частности в датчиках детонации двигателей внутреннего сгорания....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571465
Дата охранного документа: 20.12.2015
20.01.2016
№216.013.a06d

Противосудорожное средство

Изобретение относится к лекарственным средствам, а именно к используемым при эпилепсии. Техническим результатом изобретения является повышение противосудорожной активности. Технический результат достигается применением дигидрохлорида 9-диалкил...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002572711
Дата охранного документа: 20.01.2016
10.04.2016
№216.015.2eee

Бессвинцовый пьезоэлектрический керамический материал

Изобретение относится к пьезоэлектрическим керамическим материалам. Технический результат изобретения заключается в повышении температурной стабильности относительной диэлектрической проницаемости ε /ε и коэффициента электромеханической связи планарной моды колебаний. Пьезоэлектрический...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002580538
Дата охранного документа: 10.04.2016
27.04.2016
№216.015.39f5

Гидрогалогениды 11-феноксиэтил- и 11-бензилзамещённых 2,3,4,5-тетрагидро[1,3]диазепино[1,2-а]бензимидазола, обладающие антиагрегантной активностью

Изобретение относится к гидрогалогенидам 11-феноксиэтил- и 11-бензилзамещенных 2,3,4,5-тетрагидро[1,3]диазепино[1,2-]бензимидазола формулы I: где R=CHOCH(4-Cl); CHOCH(4-OCH); CH(4-F); X=Cl, Br. Технический результат: получены новые производные...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002582618
Дата охранного документа: 27.04.2016
13.01.2017
№217.015.8099

Бис-[2-(замещённые бензилиден)-3',4'-диметоксифенилэтилиминаты]цинка(ii), обладающие люминесцентной активностью

Изобретение относится к новым соединениям металлохелатовбидентатных азометиновых лигандов 2-N-тозиламинобензальдегида и 2-гидроксибензальдегида и аралкиламинов, а именно к бис-[2-(N-тозиламинобензилиден)-3′,4′-диметоксифенилэтилиминату]цинка(II) и...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002602263
Дата охранного документа: 10.11.2016
+ добавить свой РИД