Способ получения бруцеллёзной моноспецифической сыворотки anti-melitensis

Изобретение относится к ветеринарии, к диагностике инфекционных болезней, а именно к дифференциации возбудителей бруцеллеза.

Бруцеллез - инфекционная болезнь животных, представляющая большую опасность и для людей.

Существуют различные возбудители бруцеллеза. Среди сельскохозяйственных животных наиболее распространены бруцеллы видов abortus и melitensis. Но наиболее опасным как для животных, так и людей является возбудитель бруцелл вида melitensis (В.melitensis).

В этой связи принципиально важно в случае возникновения вспышки бруцеллеза объективно установить вид возбудителя, так как от этого существенно зависит выбор оптимальной схемы противобруцеллезных мероприятий.

В этой связи наиболее актуальным является получение эффективной бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis.

Известно, что для дифференциации возбудителей бруцеллеза в бактериологической диагностике в качестве одного из основных методов используют антивидовые моноспецифические бруцеллезные сыворотки. От уровня их чувствительности зависит надежность видовой дифференциации бруцелл. Кроме того, практически важны простота и безопасность их получения.

В литературе давно известен принцип получения бруцеллезных моноспецифических (монорецепторных) антивидовых диагностических сывороток по определенной схеме, преследующей достижение высокого уровня антител за счет многократной гипериммунизации животных-продуцентов (кроликов) культурами вирулентных штаммов бруцелл, с последующей адсорбцией полученных сывороток взвесью бруцелл гетерологичного вида, с целью удаления общих для них антител (Вершилова П.А. Биохимическая и серологическая дифференциация группы Brucella и ее значение в эпидемиологии / Архив биологических наук, 35, сер. Б, 2 М., 1934; Кириллов Л.В. Получение монорецепторных сывороток // В кн. Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты / М., 1963. С. 366-371.; Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним/ под ред. Т.С. Сайдулдина - Алматы, 2007. - 433 с).

Недостатками этого принципа получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки являются трудоемкость внутривенного метода, высокая себестоимость конечного продукта за счет получения сыворотки только при однократном взятии крови, а также эпидемическая опасность, связанная с использованием в процессе производства живых вирулентных штаммов бруцелл.

Наиболее близким техническим результатом является способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis (патент RU №2104031 C1 от 10.02.1998 г. A61K 39/10). Способ получения моноспецифических сывороток для дифференциации возбудителей бруцеллеза, включающий внутривенную иммунизацию кроликов разовой дозой штамма B.melitensis 28 в дозе 2,8-3,0×10⁸ КОЕ в 1 мл физиологического раствора, обескровливание животных через 5-7 дней, инактивацию сыворотки при 60-65°C в течение 1-1,5 часов и перекрестную абсорбцию сыворотки бактериальной массой штамма В.abortus 544, выращенной в течение 70-72 ч., центрифугированной, охлажденной в течение 24-26 ч. и разбавленной физиологическим раствором, при концентрации абсорбирующей бактериальной массы в 3,5-3,7×10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки) с последующим добавлением к готовой сыворотке раствора фенола и фасовку.

Недостатками этого способа являются трудоемкость процесса, эпидемическая опасность, связанная с использованием живой культуры бруцелл вида melitensis, небольшой объем выхода конечного продукта за счет получения сыворотки от животного-продуцента только при однократном взятии крови.

Техническим результатом предлагаемого способа изготовления бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis является снижение трудоемкости процесса ее изготовления и эпидемической опасности, увеличения выхода конечного продукта.

Техническое решение достигается тем, что способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis, включает иммунизацию кроликов разовой дозой штамма В.melitensis, получение сыворотки, ее инактивация при 60-65°С течение 1-1,5 ч, перекрестную адсорбцию бактериологической массой штамма В.abortus 544, полученной путем выращивания культуры в течение 70-72 ч. центрифугирования, охлаждения осадка в течение 24-26 часов и добавления к осадку физиологического раствора для получения бактериальной массы в количестве 3,5-3,7×10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, с последующей ее инкубацией при 37°С в течение 2 часов, восстановление сыворотки путем центрифугирования, консервирование и фасовка, иммунизацию кроликов проводят подкожно в область подгрудка суспензией в объеме 1 мл, представляющую собой смесь: 200 млн. м.к. инактивированной культуры штамма В.melitensis 16М с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, для перекрестной адсорбции используют инактивированный штамм В.abortus 544, на 14-16 день проводят пробное крововзятие, а на 21-45 дни осуществляют трехкратное взятие крови и на 60 день обескровливают.

Предлагаемый способ получения бруцеллезной моноспецифической бруцеллезной диагностической сыворотки anti-melitensis позволяет снизить трудоемкость производственного процесса за счет подкожного введения антигена кроликам, максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса за счет использования инактивированных культур бруцелл, и взятие крови от каждого кролика минимум четырехкратно, а, значит, минимум в два раза повысить количество получаемой сыворотки.

В качестве антигенов использовали инактивированные культуры бруцелл:

- для гипериммунизации кроликов - взвесь инактивированной культуры штамма B.melitensis 16М - 200 млн.м.к. с добавлением адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG;

- для адсорбции полученной сыворотки - штамм В.abortus 544.

Используемые штаммы должны отвечать паспортным данным. Их высевают на одну из питательных сред: эритрит агар, МППГГА. После 2-3-суточного роста бактериальную массу смывают с поверхности питательной среды физиологическим раствором с добавлением 0,5% фенола. Полученную взвесь бруцелл доводят до необходимой концентрации по оптическому стандарту мутности, сливают через двойной марлевый фильтр в колбы и обезвреживают прогреванием на водяной бане при температуре 80°С в течение 60 минут, периодически помешивая. Проверяют на чистоту и стерильность путем засева на питательные среды (Иванов Н.П. Бруцеллез животных и меры борьбы с ним/ под ред. Т.С. Сайдулдина - Алматы, 2007. - 433 с).

Взвеси культур, используемые в качестве антигенов, как при гипериммунизации кроликов, так и для адсорбции полученных сывороток должны быть стерильными.

В качестве адъюванта применяли французский препарат MONTANIDE™ ISA 61 VG, производитель - фирма «SEPPIC». Готовый к использованию масляный адъювант для ветеринарных вакцин для производства эмульсий «вода в масле» содержит особое обогащенное светлое минеральное масло и высокоочищенное ПАВ, полученное из маннитола и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения. Препарат MONTANIDE™ ISA 61 VG не содержит компонентов животного происхождения. Рецептуры вакцин с MONTANIDE™ ISA 61 VG вызывают сильный и продолжительный иммунный ответ. По сравнению с традиционными масляными эмульсиями суспензия с MONTANIDE ISA 61 VG является устойчивой, стабильной и легко вводимой. Для приготовления 100 г вакцины обычно необходимо: MONTANIDE™ ISA 61 VG - 60 г и водной антигенной среды - 40 г. Стабильные эмульсии получаются путем смешивания водной среды в MONTANIDE™ ISA 61 VG, при комнатной температуре или ниже, при интенсивном перемешивании.

При комнатной температуре интенсивно перемешивают на магнитной мешалке взвесь убитой культуры штамма B.melitensis 16М с добавлением адъюванта MONTANIDE™ ISA 61 VG, в соотношении 40 и 60%, соответственно, т.е. для приготовления 10 мл суспензии необходимо 4 мл взвеси и 6 мл адъюванта.

В качестве животных-продуцентов использовали кроликов.

Заявленный результат достигается следующим образом:

Кроликам однократно подкожно в область подгрудка вводят 1 мл суспензии, представляющей собой смесь антигена (200 млн. м.к. инактивированной культуры штамма В.melitensis 16М с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG). На 14 день проводят пробное крововзятие, а далее при условии положительной РА с полученной сывороткой и испытуемой живой культурой В.melitensis в разведении не ниже 1:160, осуществляют четырехкратное взятие крови (из ушной вены) в сроки с 21 по 45 день после гипериммунизации, из расчета 16-20 мл крови на 1 кг живой массы. Через 60 дней тотальное взятие крови (производственное кровопускание). Кровь от каждого кролика берут с соблюдением правил асептики и антисептики в отдельную стерильную емкость. После крововзятия емкость с кровью ставят в термостат при 37°С на 3-4 часа для отделения сыворотки, затем помещают в холодильник при 2-8°С на 2-е суток. Сыворотку от каждого кролика сливают отдельно в стерильные сосуды, после чего прогревают в водяной бане при температуре 60-65°С в течение 1-1,5 часов при постоянном перемешивании и обезвреживают добавлением мертиолата натрия до конечной концентрации 1:10000.

Затем осуществляют процесс перекрестной адсорбции полученной anti-melitensis сыворотки, используя бактериальную массу инактивированного штамма В.abortus 544, полученную путем выращивания в течение 70-72 ч, центрифугирования, охлаждения осадка в течение 24-26 часов и добавления к осадку физиологического раствора для получения бактериальной массы в количестве 3,5-3,7×10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, с последующим инкубированием смеси при 37°С в течение 2 часов и ее восстановление центрифугированием 30 мин при 3000-5000 об/мин и добавлением в качестве консерванта, например, мертиолата натрия в конечной концентрации 1:10000 и фасовка.

Контроль активности полученной сыворотки осуществляют в РА до адсорбции и после нее, используя в качестве антигенов живые культуры бруцелл видов abortus и melitensis. Сыворотка считается качественной, если РА с ней и антигенами живых культур бруцелл видов melitensis будет положительной в разведениях не ниже 1:160 и отрицательном результате агглютинации живых культур бруцелл видов abortus в разведениях 1/10, соответственно.

Пробу сыворотки крови из каждой емкости подвергают проверке на стерильность путем высевов на ΜΠΑ, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро и на активность в РА, РСК, РБП.

При условии стерильности и получении положительных результатов серологических реакций сыворотку смешивают в одну емкость для составления серии, консервируют мертиолатом натрия в качестве консерванта в конечной концентрации 1:10000 и расфасовывают.

Пример 1. Определение оптимальной схемы гипериммунизации кроликов для получения сыворотки бруцеллезной моноспецифической anti-melitensis

В опыте изучили сравнительную эффективность двух схем получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis, для чего из здоровых кроликов, предварительно проверенных на бруцеллез серологическими методами, сформировали две группы (по 3 кролика в каждой):

1-я группа - животным ввели однократно внутривенно живую культуру В.melitensis 16М в дозе 200 млн. м.к. в объеме 1 мл.;

2-я группа - животным ввели однократно подкожно инактивированную культуру В.melitensis 16М в дозе 200 млн.м.к. в смеси с адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG в общем объеме 1 мл.

Кровь от животных обеих групп в целях получения сывороток брали на 7, 14, 21, 28, 45, 60 и 90 дни после введения антигенов.

Исследование полученных сывороток проводили в РА с антигенами, приготовленными из В.abortus 544 и В.melitensis 565, согласно общепринятой методике до и после адсорбции.

Перед адсорбцией сыворотки инактивировали при 60-65°C в течение 1-1,5 ч и обезвреживали мертиолатом натрия до конечной концентрации 1:10000.

В дальнейшем проводили адбсорбцию полученных сывороток anti-melitensis бактериологической массой штамма В.abortus 544, полученной путем выращивания культуры в течение 70-72 ч, центрифугирования, охлаждения осадка в течение 24-26 часов и добавления к осадку физиологического раствора для получения бактериальной массы в количестве 3,5-3,7×10⁹ КОЕ на 10 мл сыворотки, с последующей инкубацией смеси при 37°С в течение 2 ч и ее восстановление путем центрифугированием 30 минут при 5000 об /мин и добавлением в качестве консерванта мертиолата натрия до конечной концентрации 1:10000 и расфасовку

Результаты опыта приведены в таблицах 1-7.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 7 день после их сенсибилизации (таблица 1) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:40-1:80 и 1:80-1:160, а после адсорбции - 1:20 и 1:160-320 соответственно; во второй группе до адсорбции 1:80 и 1:40, а после адсорбции - 0- 1:10 и 1:40-1:80, соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 14 день после их сенсибилизации (таблица 2), в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160-1:2560 и 1:80-1:1280, а после адсорбции - 1:10 -1:20 и 1:160-320, соответственно; во второй группе до адсорбции 1:160-1:1280 и 1:160-1:1280, а после адсорбции - 0-1:20 и 1:80-1:160, соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 21 день после их сенсибилизации (таблица 3) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160-1:320 и 1:80-1:640, а после адсорбции - 1:10 и 1:320 соответственно; во второй группе до адсорбции 1:40-1:160 и 1:80-1:640, а после адсорбции - 1:10 и 1:320-1:640, соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 28 день после их сенсибилизации (таблица 4) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160 и 1:1280-1:2560, а после адсорбции - 1:10 и 1:160-1:320 соответственно; во второй группе до адсорбции 1:640-1:1280 и 1:640-1:2560, а после адсорбции - 1:10-1:20 и 1:320, соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 35 день после их сенсибилизации (таблица 5) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160-1:320 и 1:1280-1:2560, а после адсорбции - 1:40-1:160 и 1:80-1:320 соответственно; во второй группе до адсорбции 1:640-1:1280 и 1:640-1:2560, а после абсорбции - 1:10 и 1:320,соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 60 день после их сенсибилизации (таблица 6) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160-1:320 и 1:1280-1:2560, а после адсорбции - 1:40-1:160 и 1:80-1:320, соответственно; во второй группе до адсорбции 1:640-1:1280 и 1:640-1:2560, а после адсорбции - 1:10 и 1:320 соответственно.

РА с сыворотками крови, полученными от кроликов на 90 день после их сенсибилизации (таблица 7) в первой группе была положительной до адсорбции с антигенами инактивированных культур бруцелл видов abortus и melitensis в разведении 1:160-1:320 и 1:160-1:640, а после адсорбции - 1:40 и 1:80-1:160 соответственно; во второй группе до адсорбции 1:320 и 1:640, а после адсорбции - 1:20 и 1:80-1:160 соответственно.

Таким образом, из приведенных данных, очевидно, что оптимальной является схема получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis, испытанная на животных второй группы, в которой использовалась однократная подкожная гипериммунизация в область подгрудка суспензией инактивированной культуры бруцелл вида melitensis в смеси с масляным адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG. Кроме эпидемической безопасности, ее преимущества заключаются в более высоких ее титрах при получении в отдаленные сроки после гипериммунизации, а значит в возможности получения значительного объема сыворотки с более высокой активностью за счет многократного (не менее 4-х раз) взятия крови.

Пример 2. Изучение диагностической активности бруцеллезных моноспецифических сывороток anti-melitensis, полученных от кроликов, гипериммунизированных по разным схемам, через 6 месяцев их хранения (таблица 8).

Установлено, что сыворотка, полученная от кроликов по схеме, предусматривающей однократную подкожную гипериммунизацию инактивированной культурой бруцелл вида melitensis в смеси с масляным адъювантом MONTANIDE™ ISA 61 VG, сохранила свою активность (РА в разведении не ниже 1:160) в течение не менее 6 месяцев после ее получения из крови, взятой через 21, 28, 35 и 60 дней после гипериммунизации, в отличие от сыворотки, полученной при однократной внутривенной гипериммунизации живой культурой бруцелл вида melitensis без адъюванта, потерявшей активность в более ранние сроки - 28-35 дней.

Предлагаемый способ получения бруцеллезной моноспецифической сыворотки anti-melitensis позволяет снизить трудоемкость производственного процесса за счет подкожного введения в область подгрудка кроликам антигена, максимально повысить противоэпидемическую безопасность этого процесса за счет использования инактивированных культур бруцелл, а также брать кровь от каждого животного минимум четырехкратно, а, значит, минимум в два раза повысить количество получаемой сыворотки.