Способ прогнозирования характера течения хронического рецидивирующего афтозного стоматита путем оценки мукозального иммунитета

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может использоваться для прогнозирования характера течения хронического рецидивирующего афтозного стоматитом путем оценки мукозального иммунитета.

Организм человека обладает целым комплексом различных механизмов, обеспечивающих защиту его от микроорганизмов. При нарушении в одном из звеньев цепочки механизмов увеличивается риск возникновения инфекции. Первой линией защиты макроорганизма против микроорганизмов являются кожные покровы и слизистые оболочки.

Слюна играет ведущую роль в обеспечении сохранения целостности тканей ротовой полости, что обусловлено ее бактерицидными свойствами. Бактерицидное действие слюны - один из механизмов неспецифической защиты высших организмов от бактерий. Ослабление бактерицидности слюны способствует повышению чувствительности макроорганизма к инфекциям, развитию различных воспалительных процессов. В зависимости от вида воспалительной реакции и глубины поражения принято выделять поверхностные, катаральные, афтозные, глубокие, язвенные и некротические стоматиты. Хронический рецидивирующий афтозный стоматит считается одним из самых частых заболеваний слизистой оболочки полости рта.

Общепризнанно, что бактерицидная активность ротовой жидкости представляет собой индикаторную систему, реагирующую на изменения местного (мукозального) иммунитета.

На протяжении многих лет наиболее распространенным способом оценки гибели микроорганизмов является бактериологический метод, который предполагал высев смеси бактерицидного агента и микробов после инкубации на чашки Петри с плотной питательной средой, учет результата производили через сутки по числу колоний.

В 1974 году Fierer и сотрудниками был предложен радиометрический метод. Бактерицидный эффект оценивали по высвобождению Cr⁵¹ из Cr⁵¹-меченых бактерий. К недостаткам этого метода можно отнести наличие изотопов, наличие специального оборудования, специализированной лаборатории, необходимости разрешения для работы с радиоактивными препаратами (Muns G, Liesen Н, Riedel Н, Bergmann K-С. Einflus von langstrckenlauf auf den IgA-gehalt in nasensekret und speichel. Deut. Zeit. Sportmed. 1989. 40. 63-65. 27).

В настоящее время доказана возможность применения проточной лазерной цитометрии для определения бактерицидной активности ротовой жидкости. Основным преимуществом данной технологии перед микробиологическим и фотометрическим методами является абсолютная объективность, точность и быстрота. Эта технология позволяет в течение нескольких минут анализировать несколько тысяч изучаемых клеток. Наличие интенсивно светящихся флуорохром-меченых бактерий является главным условием возможности оценки бактерицидного действия слюны с помощью проточной цитометрии.

Известен способ оценки клеток слюны с помощью проточной цитофлюориметрии (патент RU 2377568, 27.12.2009). Однако данный способ позволяет только проводить анализ популяционного состава клеток образца слюны, выделяя жизнеспособные лейкоциты с помощью двух маркеров CD45 и 7-AAD, и не отражены эти показатели при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите.

Показано, что течение хронического рецидивирующего афтозного стоматита сопровождается нарушениями антиоксидантной и иммунной защиты в полости рта, что проявляется повышением содержания продуктов ПОЛ первичных - гидроперекисей и вторичных продуктов - малонового диальдегида, снижением антиокислительной активности слюны, а также снижением уровня SIgA и лизоцима, которые коррелируют с тяжестью и продолжительностью заболевания, выраженностью и характером дисбиотических нарушений (Ионов В.В. Состояние местного иммунитета, свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты в слюне при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите // Автореферат, Москва, 2008).

Известен способ прогнозирования рецидива хронического афтозного стоматита, включающий цитологический анализ образца, снятого с труднодоступного участка слизистой оболочки полости рта, и определение индекса дифференцировки индекса клеток эпителия (UA 11695 U, 15.01.2006).

Ближайшим аналогом изобретения является способ оценки бактерицидной активности слюны с помощью проточной лазерной цитометрии, заключающийся в двойном окрашивании флюорохромами бактерий (Будихина А.С. Оценка бактерицидной активности биологических жидкостей в норме и при патологии с помощью лазерной проточной цитометрии // Автореферат, Москва, 2007). В данной работе определены нормативные значения показателей бактерицидности слюны группы здоровых доноров и у больных с хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом - киллинг слюной St. aureus, %, при инкубации образца 3 часа. Однако отсутствуют критерии, позволяющие прогнозировать осложнения течения рецидивирующего афтозного стоматита.

Известно, что максимальный бактерицидный эффект слюны достигается через 24 часа и в 2 раза увеличивается число убитых бактерий слюной по сравнению с 3-часовой инкубацией слюны. Также одним из этапов обследования больного, обеспечивающих успех лечения, является комплексное определение отклонений иммунологических показателей с целью прогнозирования течения заболевания и выбора дальнейшей тактики лечения.

Поэтому задачей изобретения была разработка способа прогнозирования характера течения хронического рецидивирующего афтозного стоматита с определением механизмов рецидивирования и осложнений эрозиями слизистой оболочки рта для выявления дальнейшей тактики коррекций нарушений мукозального иммунитета.

Для прогнозирования характера течения хронического рецидивирующего афтозного стоматита оценивали мукозальный иммунитет, включающий определение бактерицидной активности слюны (БАС) методом проточной цитофлюориметрии, а также определение активности лизоцима. При значениях БАС равных 65,7% и выше прогнозируют течение заболевания как благоприятное, а при величине БАС равной 37,0% и ниже - как течение, осложненное эрозиями слизистой оболочки рта.

Техническим результатом данного изобретения является выявление группы стоматологических пациентов с предрасположенностью к осложнениям эрозиями слизистой оболочки рта при хроническом рецидивирующем афтозном стоматите путем определения снижения бактерицидной активности слюны методом проточной цитофлюориметрии через 24 часа инкубации образца слюны, обеспечивая максимальный бактерицидный эффект слюны.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Гистограммы со статистикой для автоматического подсчета процента убитых бактерий (двойная метка) по отношению к сумме убитых и живых (одинарная метка).

Подробное описание изобретения

Бактерицидность образца слюны оценивали при помощи цитометрического метода, используя для этого St. aureus-ФИТЦ⁺. В основе метода лежит двойное окрашивание бактерий флюорохромами ФИТЦ и ПИ, позволяющее визуально отделить убитые микроорганизмы от живых и оценить их количество.

Определение бактерицидного действия слюны проводится из образцов этой биологической жидкости, взятой натощак в 8-10 часов утра в стерильную пробирку, через 10 мин после предварительного полоскания ротовой полости водой. Затем образцы цельной слюны центрифугировали при 10000g 15 мин для удаления осадка. Аликвоты слюны хранили при -70°С.

Методика постановки

Реакцию бактерицидной активности слюны ставили в 96-луночном круглодонном планшете. Для этого инкубировали 90 мкл биологической жидкости и 90 мкл St. aureus-ФИТЦ⁺ (10×10⁶/мл) в течение 24 часов при +37°C. Контролем реакции была спонтанная гибель St. aureus-ФИТЦ⁺ (бактерии с ФСБ, находящиеся в тех же условиях). Для оценки вклада комплемента в бактериолиз слюну предварительно прогревали на водяной бане при +56°C 30 мин. После бактерии осаждали центрифугированием 1000g 10 мин и ресуспендировали в 200 мкл ПИ (2,5 мкг/мл) на ФСБ. Через 10 мин образцы анализировали на проточном цитофлюориметре FACS Calibur («Becton Dickinson») в программе CellQuest.

Для анализа проб использовали цитометр, оснащенный двумя светофильтрами: для ФИТЦ - 525 нм и для ПИ (пропидиум иодид) - 620 нм. На фиг. 1 представлен пример определения бактерицидности слюны одного из доноров. На экран выводят Dot Plot FSC на SSC, отображающий только ФИТЦ-меченые стафилококки (фиг. 1А). Проекцию Dot Plot FL1/FL3 (фиг. 1Б) на FL3 выводят в виде гистограммы (фиг. 1Г) для автоматического вычисления процента убитых бактерий, несущих двойную метку, по отношению к сумме убитых и живых бактерий. Dot Plot FL1/FL3, отражающий спонтанную гибель St. aureus, не приведен, показана его проекция на FL3 в виде гистограммы (фиг. 1В). На гистограмме В показана спонтанная гибель St. aureus, на гистограмме Г - влияние слюны на киллинг St. aureus. На гистограммах В и Г показано 2 пика: правые пики, выделенные курсором Ml, отражают процент двойных позитивных бактерий (ФИТЦ⁺ПИ⁺), т.е. мертвых бактерий, левые пики отражают живые бактерии.

Активность лизоцима в слюне определяли по изменению светопропускаемости взвеси Micrococcus lysodeikticus (конц. 1 млрд./мл) до внесения слюны и после инкубации со слюной пациентов. Определение проводили на спектрофотометре PV 1251С.

Методика постановки

1. Сбор смешанной не стимулированной слюны (3-5 мл) проводится в течение 10 мин, через 1 час после еды и полоскания полости рта водой. После забора слюна в течение 40 мин - 1 часа должна быть доставлена в лабораторию и обработана (собранные образцы до обработки хранить при +4°C).

2. Перед постановкой реакции слюну необходимо развести 1:20 фосфатно-солевым буфером (ФСБ: 0,15 М, рН=7,4).

3. При подготовке проб и перед началом постановки слюну следует тщательно встряхивать, т.к. лизоцим при стоянии образцов почти полностью осаждается.

4. В одноразовую полистироловую кювету с 1,47 мл подготовленной микробной взвеси добавляют 0,03 мл разведенной слюны. Кюветы при постоянном встряхивании выдерживают в термостате при +37°C в течение 2 часов.

5. После инкубации измеряют светопропускаемость испытуемой взвеси на спектрофотометре при длине волны 540 нм.

6. Активность лизоцима определяют как разность между процентом светопропускаемости испытуемой взвеси после инкубации со слюной и процентом светопропускаемости исходной микробной взвеси.

Пример 1.

Группу здоровых доноров составили 75 некурящих человек в возрасте от 18 до 60 лет с санированной ротовой полостью. Группа больных с хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом и осложненным эрозиями слизистой оболочки рта - 9 и 8 человек соответственно.

При исследовании бактерицидности слюны больных (киллинг слюной St. aureus, %) с хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом (N=9) оказалось, что бактерицидность слюны через 24 часа инкубации выше на 24,2%, чем у здоровых доноров (N=75) (таблица 1).

При значениях БАС равных 65,7% и выше оценивалось течение заболевания как благоприятное с отсутствием осложнений эрозиями слизистой оболочки рта.

Увеличение бактерицидной активности слюны свидетельствует о степени выраженности воспалительного процесса у этих больных. Увеличение числа убитых бактерий, по всей видимости, связано с высвобождением содержимого гранул нейтрофилов, привлеченных в очаг воспаления и активированных микробами ротовой полости, что свидетельствует об активации местного иммунитета

Однако, высвобождаясь во внеклеточное пространство, антимикробные пептиды и протеины из нейтрофилов и других клеток обеспечивают не только внеклеточный механизм киллинга, но также влияют и на функционирование других клеток. Также из активированных нейтрофилов высвобождаются и эластаза, коллагеназа, желатиназа и др., которые также вносят свой вклад в повреждение тканей. Прогрессирование воспаления приводит к подавлению процессов репарации в слизистой и появлению эрозий и язв на ней.

Далее оценивали бактерицидную активность слюны у больных с хроническим рецидивирующим афтозным стоматитом, осложненным эрозиями слизистой оболочки рта. При оценке бактерицидности слюны у больных с эрозиями (N=8) отметили снижение процента убитых микробов у этих больных на 30,1% по сравнению с донорами и больными хроническим афтозным стоматитом (таблица 2).

Как и в предыдущей группе больных, отмечалось снижение уровня лизоцима в слюне.

При величине БАС равной 37,0% и ниже в данной группе больных наблюдалось осложненное течение заболевания, проявляющееся эрозиями слизистой оболочки рта. Снижение БАС свидетельствует об истощении ресурсов мукозального иммунитета.

Полученные данные были сопоставлены с бактериологическим (метод посева), фотометрическим и цитометрическим методами оценки бактерицидного действия биологических жидкостей человека. Был установлен высокий уровень корреляции (r=0,84 и r=0,92 соответственно).

Таким образом, снижение в слюне уровня лизоцима и бактерицидной активности являются определяющими факторами в возникновении и развитии осложнений хронического процесса, что позволяет выявить группу стоматологических пациентов с предрасположенностью к осложнениям эрозиями слизистой оболочки рта при хроническом афтозном стоматите и, как результат, позволяет определить схему коррекции нарушений мукозального иммунитета.