СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОЧНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологии для доклинической оценки токсичности, определения безопасности и пробиотического потенциала микроорганизмов, в пищевой промышленности для оценки гигиенической безопасности и текущего контроля качества пищевых ингредиентов - пробиотиков, а также в научно-исследовательских работах.

Обеспечение безопасности пищевых ингредиентов, в том числе микроорганизмов, используемых в качестве пробиотических, является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения, поскольку некачественные компоненты и продукты питания могут приводить к заболеваниям различной этиологии. Для предотвращения этого необходимо тщательно проводить испытания токсичности объектов пищевого назначения, в том числе на этапе доклиники.

Биологическую оценку безопасности пищевых продуктов и ингредиентов проводят с использованием одноклеточных протистов, насекомых, мелких ракообразных, водорослей и семян высших растений.

Известны экспресс-методы определения общей токсичности кормов и сырья для их производства, в том числе продуктов микробиологического синтеза, сухого молока, концентрированных кормовых добавок по ГОСТ 31674-2012 [1]. Биотестирование проводят на инфузориях стилонихиях (Stylonychia mytilus) или колподах (Colpoda steinii). Метод основан на извлечении из исследуемых кормов различных фракций токсических веществ параллельно ацетоном и водой с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий или на колподы. Оценку результату биотеста дают по реакции гибели инфузорий. Безопасным считается корм, определенный как нетоксичный (выживаемость стилонихий более 70%; около 90% колпод остались подвижными) при одновременном параллельном исследовании как ацетонового, так и водного экстракта. Выживаемость стилонихий N, %, вычисляют по формуле (1) следующим образом:

где N₂ - среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в конце опыта через 1 ч экспозиции, шт.;

N₁ - среднеарифметическое (из пяти испытаний) значение количества стилонихий в начале опыта, шт.

Известен способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов, заключающийся в использовании инфузорий Paramecium caudatum, культивируемых на зернах длиннозерного риса. Оценку токсичности проводят по проценту выживших инфузорий в водном растворе ацетонового экстракта исследуемого продукта, рассчитанному по формуле, аналогичной формуле (2). Степень токсичности продукта при тестировании его водного раствора определяют по времени, за которое происходит гибель инфузорий [4].

Недостатком данных методов является то, что тест-организмы относятся к царству Простейших (Protozoa) и имеют значительно более простую клеточную организацию, чем высшие позвоночные, организмы которых состоят различных типов тканей и клеток.

В качестве модельной системы организма человека при определении безопасности бактериальных штаммов обычно используются высшие животные (молодые особи крыс, мышей, кроликов, кошек и др.), в том числе сельскохозяйственные (например, цыплята) обоего пола.

Известны методы определения общей токсичности кормов, комбикормов и кормовых добавок биотестированием параллельно на кроликах (кожная проба) и на мышах (острый опыт) по ГОСТ 31674-2012 [1]. Результат определяют по совокупности реакций в обоих методах: корм нетоксичный (нетоксичен в обоих тестах), корм токсичный (токсичен хотя бы в одном тесте).

Первый метод основан на дермонекротическом воздействии на кожу кролика токсичных веществ, в основном микогенного происхождения, извлекаемых из кормов ацетоном. Токсичность исследуемых кормов определяют по наличию воспалительного процесса на участке кожи с нанесенным экстрактом: корм нетоксичный, если воспаление отсутствует.

Второй метод основан на введении водного или ацетонового экстракта корма однократно в желудок белым мышам. Учет реакции ведут на основании анализа состояния внутренних органов (ЖКТ, печени, селезенки, почек) при вскрытии мышей. Корм нетоксичный, если все мыши живы, а при вскрытии убитых мышей патологоанатомических изменений не обнаружено.

Известны способы определения предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов пробиотиков, а именно оценка токсигенности и токсичности [3].

Токсигенность микробов изучают для определения максимальной дозы, вызывающей гибель подопытных животных в течение 7-14 суток наблюдения.

Культуру испытуемого штамма сеют на жидкую питательную среду, выдерживают в термостате при оптимальной для роста температуре в течение 10 суток для накопления в ней токсина, если он продуцируется штаммом. Затем фильтруют ее через бактериальный фильтр. Получаемый при этом прозрачный фильтрат вводят неразведенным или разведенным в несколько раз, в зависимости от целей и задач исследования. Каждую дозу фильтрата испытывают одновременно на 10 мышах массой тела 10-14 г (на двух разных линиях мышей) при внутрибрюшинном введении или морских свинках массой тела 250-350 г. При отсутствии гибели животных, признаков нарушения здоровья и потери массы тела к концу срока наблюдения при введении максимально переносимой дозы следует сделать заключение, что штамм не обладает токсигенностью.

Токсичность испытуемых штаммов проверяют на мышах массой тела (15±1) г при внутрибрюшинном введении убитой прогреванием при температуре 100°С в течение 30 мин взвеси испытуемого штамма (в максимальной концентрации микробных клеток). Прогретую культуру, нативную или в разведении, вводят 10 мышам в объеме 0,5 мл. Определяют LD₅₀ или максимально переносимую дозу. Наблюдение за животными ведут в течение 7-14 суток. При отсутствии гибели животных, признаков нарушения здоровья и потери массы тела к концу срока наблюдения при введении максимально переносимой дозы следует сделать заключение, что штамм нетоксичен.

Известен способ определения безвредности пробиотических микроорганизмов [2]. Колонии 24-часовой культуры бифидобактерий или лактобацилл, выращенных на агаризованной МРС-среде, снимают с агара петлей, суспендируют в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида до концентрации 10⁸ кл./мл и выдерживают 30 мин при температуре (37±1)°С. По 0,5 мл полученной взвеси вводят с помощью специальной насадки на шприц в желудок 5 белым мышам массой (15±1) г. Наблюдения за мышами осуществляют в течение 5 суток. В случае гибели хотя бы одной мыши опыт повторяют на удвоенном количестве животных. Если в повторном опыте ни одна из мышей не погибнет, штамм считают безвредным, в противном случае штамм бракуется.

Недостатками методов с использованием высших млекопитающих являются высокая стоимость, громоздкость, длительность анализа и этические проблемы. Поэтому необходим простой, доступный и достоверный метод оценки воздействия различных пищевых ингредиентов на живой организм и его системы.

Вышеперечисленных недостатков лишен предлагаемый метод биологической оценки с использованием в качестве тест-систем культур клеток животных и человека. Клетки in vitro реагируют на воздействие химических и биологических факторов адекватно исходному организму.

Задачей изобретения является разработка эффективного способа определения безопасности микроорганизмов, используемых в качестве пищевых ингредиентов, для человека.

Техническим результатом заявляемого способа является расширение технологических возможностей способа, заключающихся в определении не только токсичности, но и, в целом, безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, а также повышение точности и достоверности результатов и их количественное определение.

Преимущества предлагаемого способа с применением культур клеток перед методами с использованием высших животных в следующем:

- возможность одновременной постановки большого количества опытов;

- возможность оценить динамику поведения клеточной системы в зависимости от времени, т.е. оценить эффект при хроническом воздействии;

- возможность в течение 24 ч сделать предварительное заключение о безвредности объекта исследования;

- использование нескольких типов тканей и клеток человека дает основание для экстраполяции результатов на организм человека в целом;

- способ культивирования в монослое и прижизненное наблюдение клеток человека с помощью микроскопа позволяют определить их жизнеспособность и, соответственно, степень воздействия тестируемого объекта с большей точностью.

Способ определения безопасности микроорганизмов, в том числе пробиотических, используемых в качестве пищевых ингредиентов, в котором в качестве тест-систем используются культуры клеток млекопитающих и человека, включает следующие этапы:

1) подготовку исследуемого объекта: для исследования токсичности микробные клетки выращивают на соответствующей плотной питательной среде в течение 24 ч при 37°С, смытые с агара микробные клетки разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до необходимого количества (используя стандарты мутности ОСО 42-28-59-85 или стандарт McFarland) и инактивируют прогреванием при 100°С в течение 1 ч; для изучения токсигенности микробные клетки выращивают в течение 10 суток в соответствующей жидкой питательной среде при температуре 37°С, после чего культуральную жидкость центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин;

2) подготовку тест-системы: выращивают монослой клеток в культуральном флаконе площадью 25 см² на соответствующей питательной среде ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС, 0,05% антибиотика гентамицина или пенициллина-стрептомицина; удаляют со сформировавшегося монослоя питательную среду; промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером, или раствором Версена, или физраствором; вносят 10 мл питательной среды ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС;

3) определение безопасности объекта для тест-системы: для исследования токсичности сформировавшийся монослой клеток обрабатывают инактивированными бактериями в количестве 10⁷, 10⁸, 10⁹ ОЕ/0,5 мл; для изучения токсигенности супернатант бактериальных клеток вводят во флаконы со сформировавшимся монослоем по 0,25, 0,5 мл и 1,0 мл; в обоих случаях выдерживают 1 ч в СО₂-инкубаторе при 37°С и концентрации газа 5,0%, затем удаляют питательную среду и промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером, или раствором Версена, или физраствором, вносят 10 мл свежей питательной среды ЕМЕМ, DMEM или 199 с содержанием 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС, флаконы на 24 ч помещают в СО₂-инкубатор при температуре 37°С и концентрации газа 5,0%, удаляют питательную среду, производят снятие клеток растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, окрашивают клетки раствором красителя трипанового синего, производят подсчет живых и мертвых клеток и определение жизнеспособности с помощью камеры Горяева.

В качестве контроля используют флакон с клетками, выросшими на питательной среде без добавления микроорганизмов или надосадочной жидкости. Испытания повторяют минимум трехкратно. Полученные данные сравнивают с контролем, а результат - жизнеспособность (Ж) - выражают в процентах по формуле (2) как отношение количества живых клеток, выросших на среде с добавлением исследуемого ингредиента, к общему числу клеток:

где Кж - среднеарифметическое значение количества живых клеток в конце опыта, шт.;

Ко - среднеарифметическое общее значение количества клеток в начале опыта, шт.;

100 - коэффициент пересчета в проценты.

Если во всех опытах жизнеспособность более 50%, штамм считают нетоксичным и нетоксигенным, безопасным при использовании в пищевой промышленности. Если хотя бы в одном случае происходит гибель 50% и более клеточной популяции, опыт повторяют. При подтверждении результата определяют ТС₅₀ - цитопатическую активность, характеризующую количество микроорганизмов в питательной среде, которое приводит к уничтожению клеточной популяции на 50%, при этом штамм является небезопасным и не рекомендуется к использованию в пищевой промышленности в качестве пробиотического препарата.

Определение проводят на монослойных постоянных (перевиваемых) клеточных линиях различного происхождения, морфологии, типа ткани, например HEK 293 - почка эмбриона человека, FLECH (ФЛЭЧ) - фибробласты легкого эмбриона человека, Нер-2 - эпидермоидная карцинома гортани человека, СаСо-2 - аденокарцинома ободочной кишки человека, Girardi Heart - клетки предсердия человека, NCTC - подкожная соединительная ткань мыши.

Для ведения культур клеток используют стандартные синтетические жидкие среды: Игла MEM (minimal essential medium), альфа MEM, DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium), 199, F12, основой которых являются солевые растворы Эрла и Хенкса. В качестве источника факторов роста используют сыворотку крови КРС или эмбриональную бычью в количестве 10-15%. Питательную среду готовят согласно паспортам клеточных линий Российской коллекции клеточных культур позвоночных (РКККП). Для предупреждения контаминации используют антибиотики пенициллин-стрептомицин или гентамицин. Во избежание инактивации при хранении раствор антибиотика готовят непосредственно перед заменой среды: в стерильных условиях навеску антибиотика растворяют в физ. растворе и вносят в среду для культивирования клеток из расчета 100-200 ЕД каждого на 1 мл среды или 0,05%. По мере истощения эссенциальных веществ и изменения рН системы каждые 2-3 дня производят замену среды в культуральных флаконах.

Подготовку монослоя (снятие и рассев) осуществляют следующим образом. Со сформировавшегося монослоя лабораторным аспиратором удаляют питательную среду; промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером, или раствором Версена, или физраствором; дезагрегируют клетки в суспензию: во флаконы вносят 1 мл раствора Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, для лучшего открепления клеток от субстрата флаконы помещают на горизонтальный термостатируемый шейкер при 37°С со скоростью вращения 40-50 об/мин на 10 мин; степень дезагрегации клеточного монослоя контролируют визуально, при недостаточном переходе в суспензию используют стерильные скребки лифтеры или скрейперы; по достижении открепления 90-100% клеток клетки хорошо ресуспендируют пипетированием и рассевают: в новый флакон вносят суспензию клеток плотностью около 6000-7000 кл./см² и 10 мл питательной среды ЕМЕМ, DMEM или 199, включающей 10% сыворотки эмбриональной бычьей или КРС и 0,05% антибиотика гентамицина или пенициллина-стрептомицина; флаконы помещают в СО₂-инкубатор при температуре 37°С и концентрации газа 5,0%.

В процессе пересева после трипсинизации оценивают состояние клеточной культуры методом исключения красителя и подсчета общего количества клеток, а также выявления в их числе мертвых и живых клеток: аликвоту суспензии клеток (~40 мкл) смешивают с равным количеством 0,4% раствора красителя трипанового синего, отбирают пипеткой 3 мкл суспензии, вносят под покровное стекло камеры Горяева и производят подсчет клеток.

Предложенный способ иллюстрируется следующим примером.

Определение таких показателей безопасности пробиотических микроорганизмов, как отсутствие токсичности и токсигенности, для штамма Lactobacillus plantarum L-211(В-11235)

Клеточные тест-системы аденокарциномы ободочной кишки человека СаСо-2, соединительной ткани мыши NCTC, легкого эмбриона человека FLECH выращивают на питательных средах согласно таблице 1 с добавлением 0,05% антибиотика гентамицина в течение 10-14 суток в зависимости от линии; со сформировавшегося монослоя удаляют питательную среду лабораторным аспиратором; промывают монослой клеток дважды фосфатно-солевым буфером; вносят 10 мл соответствующей питательной среды, включающей 10% сыворотки согласно таблице 1.

Для исследования токсичности штамма Lactobacillus plantarum микробные клетки выращивают на среде MRS, состав которой указан в таблице 2, с добавлением 1,2% агара в течение 24 ч при 37°С. Смытые с агара микробные клетки разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до необходимого количества (по оптическому стандарту ОСО 42-28-59-85, выпускаемому ГИСК им. Тарасевича) и инактивируют прогреванием при 100°С в течение 1 ч. Сформировавшийся монослой клеток обрабатывают инактивированными бактериями в количестве 10⁷, 10⁸, 10⁹ ОЕ/0,5 мл, выдерживают 1 ч в СО₂-инкубаторе при 37°С и концентрации газа 5,0%, после чего удаляют питательную среду, промывают монослой дважды фосфатно-солевым буфером и среду заменяют на свежую. Спустя сутки производят удаление питательной среды, дезагрегацию клеток растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1 на качалке в течение 10 мин, снятие монослоя клеток, окрашивание, подсчет клеток и оценку жизнеспособности помощью камеры Горяева. Полученные данные сравнивают с результатами контроля при введении 0,5 мл физраствора.

В таблице 3 показано, что инактивированные температурой бактерии Lactobacillus plantarum штамма В-11235 не оказывают критического влияния на пролиферацию и жизнеспособность нераковых клеточных линий FLECH и NCTC. В отношении раковой линии СаСо-2 проявляется дозозависимое ингибирование жизнеспособности, т.е. с увеличением концентрации бактерий увеличивается процент мертвых клеток аденокарциномы, увеличение смертности варьируется от 17% до 26%.

Для изучения токсигенности штамма Lactobacillus plantarum микробные клетки выращивают в течение 10 суток на жидкой среде MRS, состав которой указан в таблице 2, при температуре 37°С. По истечении срока культуральную жидкость центрифугируют при 4000 об/мин в течение 30 мин. Бактериальный супернатант вводят во флаконы с клеточными линиями по 0,25, 0,5 мл и 1,0 мл, выдерживают 1 ч в СО₂-инкубаторе при 37°С и концентрации газа 5,0%, после чего среду удаляют, монослой клеток промывают и вносят свежую среду. Спустя 24 ч производят удаление питательной среды, дезагрегацию клеток растворами Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1 на качалке в течение 10 мин, снятие монослоя клеток, окрашивание, подсчет клеток и оценку жизнеспособности помощью камеры Горяева. Полученные данные сравнивают с результатами контроля при введении соответствующих объемов физраствора.

В таблице 4 показано, что инактивированные центрифугированием клетки бактерий Lactobacillus plantarum В-11235 не оказывают критического влияния на пролиферацию и жизнеспособность нераковых клеточных линий FLECH и NCTC. В отношении раковой линии СаСо-2 проявляется дозозависимое ингибирование жизнеспособности, т.е. с увеличением концентрации бактерий увеличивается процент мертвых клеток аденокарциномы, увеличение смертности варьируется от 10% до 21%.

В процессе исследований не определена ТС₅₀. Штамм Lactobacillus plantarum L-211(B-11235) не обладает токсичностью и токсигенностью для клеточных линий аденокарциномы ободочной кишки человека СаСо-2, соединительной ткани мыши NCTC, фибробластов легкого эмбриона человека FLECH, является безопасным и может использоваться в пищевой промышленности в качестве пробиотического препарата.

Источники информации

1. ГОСТ 31674-2012 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - М.: Стандартинформ, 2013. - 33 с.

2. МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 93 с.

3. МУК 4.2.2602-10 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. - М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 61 с.

4. Пат. РФ №2266015, МПК A23K, G01N. Способ комплексной оценки токсичности кормовых и пищевых продуктов / Гроздов А.О. (РФ). - Заявл. 16.08.01; опубл. 20.08.03.